تصور تعبير البروتين القائم على CUBIC : إجراء لتصور تعبير البروتين في خزعات جلد الفأر ذات السماكة الكاملة

- الجلد هو عضو معقد يتكون من مجموعات خلايا متنوعة مرتبة في طبقات متعددة. تساعد CUBIC ، وهي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد قائمة على إزالة الأنسجة ، على تصور أنماط التعبير عن البروتين داخل خلايا الجلد هذه باستخدام خزعات الجلد بالكامل. ابدأ بأخذ فأر قتل رحيم وإزالة الشعر من منطقة العنق الظهرية. استئصال قطعة من الجلد وتقطيعها إلى قطع صغيرة.

اغمر القطع في محلول مقاصة CUBIC1 واحتضنها. خلايا الجلد غير شفافة ، بسبب وجود الكروموفورات والدهون التي تسبب تشتت الضوء. تزيل المواد الكيميائية الموجودة في محلول CUBIC هذه الجزيئات ، وبالتالي تقلل من تشتت الضوء وتجعل الأنسجة شفافة.

بعد ذلك ، عالج الأنسجة بالأجسام المضادة الأولية المرغوبة التي ترتبط على وجه التحديد بالبروتينات المستهدفة داخل الخلايا المعبر عنها في خلايا الجلد. علاوة على ذلك ، عالج بالأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الفلورية التي ترتبط بمجمعات الأجسام المضادة الأولية للبروتين. قم بتلطيخ الأنسجة بصبغة ملزمة للحمض النووي تلطخ النواة.

أخيرا ، اغمر العينة في محلول CUBIC2. يقلل المحلول من تشتت الضوء داخل الأنسجة ، مما يجعله أكثر شفافية للتصوير. راقب تحت المجهر متحد البؤر لتصور المناطق ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية في العينة ثلاثية الأبعاد. يسمح البروتوكول التالي بتصور تعبير علامات تكاثر الخلايا الكيراتينية في خزعات الجلد بالكامل باستخدام بروتوكول CUBIC

- ابدأ باستخدام أدوات التشذيب لحلق الشعر من عنق الفأر القتل الرحيم ، مع الحرص على عدم جرح الجلد. ثم قم بتطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول في PBS. بعد ذلك ، ارفع جلد الرقبة الظهرية بالملقط واستخدم المقص لإزالة مساحة 1.5 × 4 سم تقريبا من جلد الفأر الظهري. بعد ذلك ، قم بتسطيح الجلد ، بحيث يكون جانب الأدمة لأسفل ، على قطعة من ورق الترشيح ، مع ملاحظة الاتجاه الأمامي الخلفي للعينة وقص الورق حول الجلد المقطوع.

- للحصول على التصوير الأمثل ، يجب أن تظل عينات الجلد مسطحة مع اتجاه ثابت لبصيلات الشعر. للحفاظ على العينات في وضع أمامي خلفي مناسب ، نقوم بتثبيت قطع الجلد على ورق ترشيح في خزعات مستطيلة.

- انقل العينات إلى أنبوب سعة 15 مليلتر مملوء ب 4٪ PFA المحضر حديثا في PBS. بعد ذلك ، عندما يتم تثبيتها بإحكام على ورق الترشيح ، انقل العينات إلى أنبوب جديد سعة 15 مليلتر من PBS لغسلتين لمدة 5 دقائق.

لتنظيف خزعات الجلد بعد الغسيل الثاني ، استخدم شفرة حلاقة حادة لتقطيع الأنسجة إلى قطع 0.2 × 0.5 سم تقريبا ، مع الحرص على قطع الجوانب الأطول للعينات على طول الاتجاه الأمامي الخلفي للعينات.

- يساعد قص الجانب الأطول من الخزعة بالتوازي مع اتجاه بصيلات الشعر أيضا على تجنب تلف بصيلات الشعر بشكل كبير.

- بعد ذلك ، اغمر الخزعات في 5 مل من محلول المقاصة CUBIC1 المحضر حديثا في أنبوب جديد سعة 15 مليلتر وضع الأنبوب على منصة دوارة في فرن تهجين عند 37 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح قطع المناديل شفافة ، اغسل الخزعات في 4 ملليلتر من PBS لأربع غسلات لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية متبوعة بغسل لمدة 4 ساعات و 37 درجة مئوية بوزن 20٪ لكل حجم سكروز في PBS.

في نهاية الحضانة ، قم بتجميد كل عينة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل في أنابيب فردية سعة 15 مليلتر طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لزيادة نفاذية الأنسجة لاختراق الأجسام المضادة.

في صباح اليوم التالي ، قم بتلطيخ عينات الجلد بالأجسام المضادة المناسبة والأصباغ الحيوية ذات الأهمية. بعد ذلك ، قم باحتضان العينات في 1 مليلتر من محلول المقاصة CUBIC2 المحضر حديثا في أنابيب 2 ملليلتر على شاكر لمدة 24 ساعة في فرن 37 درجة مئوية حتى معامل الانكسار للأنسجة.

عندما تكون الأنسجة صافية ، ضع الخزعات على طول الجانب الأطول من زلات الغطاء الزجاجي الفردية بحيث يكون اتجاه نمو بصيلات الشعر موازيا لسطح انزلاق الغطاء. ضع قطرة واحدة من محلول CUBIC2 على المنديل. ضع شريطين من المسمار الأزرق مقاس 1 ملم × 2 سم على زلة غطاء. ثم قم بتغطية الخزعة بقسيمة غطاء ثانية.

بعد ذلك ، ضع غرفة التصوير على مرحلة المجهر متحد البؤر وانقل الأنسجة إلى مسار الضوء. باستخدام مصدر الضوء المناسب ومرشحات التألق القياسية ، امسح العينة لتحديد المناطق الملطخة بالفلورسنت ذات الأهمية. بعد ذلك ، احصل على صور متحد البؤر الفلورية للمناطق ذات الاهتمام.