التحول القائم على ناقلات miniCoopR: تقنية لفحص الجينات المسببة للورم الميلانيني في نموذج ورم الزرد

- في الزرد ، ينشأ الورم الميلانيني من التحول الخبيث للخلايا الصباغية - الخلايا المنتجة للميلانين. لدراسة ظهور الورم الميلانيني ، استخدم نموذج أسماك الزرد المعدلة وراثيا المعدل وراثيا المعدل وراثيا المعرضة للورم الميلانيني والخلايا الصباغية. يفتقر هذا النموذج إلى الخلايا الصباغية بسبب طفرة فقدان الوظيفة في مروج mitfa الخاص بالخلايا الصباغية.

ابدأ بأخذ جنين وحيد الخلية من هذا النموذج المعدل وراثيا على لوحة أجار. شارك في حقن مزيج يحتوي على ناقل miniCoopR القائم على الينقولات وإنزيم الترانسبوزاز mRNAs في الجنين. يحتوي المتجه على شريط جيني ، يتألف من مصغر من mitfa يحمل المحفز مقترنا بجين مرشح محصور بين عنصرين ينقولات.

تقوم mRNAs المحقونة بالحقن المشترك بتشفير بروتينات الينقولاز. تعمل هذه البروتينات على عناصر الينقولات وتحفز استئصال الكاسيت من ناقل miniCoopR ، متبوعا بدمجها في الحمض النووي الجيني للجنين. بعد ذلك ، يقود مروج الكاسيت التعبير عن كل من جين mitfa والجين المرشح ذي الأهمية.

يدعم جين mitfa إنقاذ الخلايا الصباغية وتطورها ، بينما يؤدي الجين المرشح ، إذا كان مسرطن ، إلى ظهور الورم الميلانيني. فحص سمكة الزرد المتطورة. تطور الأسماك المعدلة وراثيا ذات الخلايا الصباغية التي تم إنقاذها تصبغ الميلانين ، بينما تحمل تلك التي تحمل الأورام الميلانينية آفات مصطبغة بارزة.

في البروتوكول التالي ، سنعرض فحص معدلات ظهور الورم الميلانيني باستخدام نواقل miniCoopR في نماذج أورام الزرد المعدلة وراثيا.

- لإنشاء تركيبات للحقن ، ابدأ بإنشاء نسخ إدخال منتصف البوابة عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لإطار القراءة المفتوح الكامل للجينات ذات الأهمية وإعادة التجميع في pDONR221. بعد ذلك ، استخدم تقنية Multisite Gateway لإعادة تجميع محفز mitfa الخاص بالخلايا الصباغية ، والجين المعني ، وإشارة polyadenylation في ناقل miniCoopR لوضع الجينات ذات الأهمية تحت سيطرة مروج mitfa.

حقن 25 بيكوغرام من كل استنساخ مع 25 بيكوغرام من Tol2 transposase mRNA في أجنة أسماك الزرد ثلاثية الخلية ، معدلة وراثيا ، ثلاثية الزيجوت. الطافرة mitfa-BRAF-p53 تعاني من نقص الخلايا الصباغية وعرضة للتحول وتكوين الورم الميلانيني. إلى جانب الجين محل الاهتمام ، يحتوي ناقل miniCoopR على جين صغير منقذ mitfa. لذلك ، فإن المحقونة بنجاح سوف تطور الخلايا الصباغية التي تم إنقاذها ، والتي تعبر عن الجين محل الاهتمام.

احتضان الأجنة المحقونة عند 28.5 درجة مئوية. بعد 24 ساعة من الإخصاب ، أو HPF ، قم بإزالة أي أجنة ميتة. بعد 72 ساعة من الإخصاب ، باستخدام مجهر تشريح تحت ضوء ساقط على خلفية بيضاء ، اختر المعدلة وراثيا مع الخلايا الصباغية التي تم إنقاذها.

عندما تصل إلى 4 أيام بعد الإخصاب ، انقلها إلى خزانات سعة 3 لترات في مشتل منشأة أسماك الزرد. في عمر شهرين ، حدد التي تحتوي على مساحة واحدة على الأقل من الخلايا الصباغية التي تزيد مساحتها عن 4 ملليمترات مربعة. فحص المختارة أسبوعيا بحثا عن وجود أورام. عزل الحاملة للورم للدراسة.

ارسم منحنيات البقاء على قيد الحياة الخالية من الورم الميلانيني مع تقدم العمر والأسابيع على الخراج والنسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة الخالي من الورم الميلانيني على الإحداثيات. قارن بين ذات الخلايا الصباغية التي تعبر عن جين ذي أهمية للتحكم في التي تعبر عن EGFP في الخلايا الصباغية. استخدم اختبار رتبة السجل لتحديد ما إذا كان المنحنيان مختلفين إحصائيا أم لا.