خالية من التحديد التمهيدي Aptamer باستخدام مكتبة DNA عشوائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الأبرز من مكتبة عشوائية ، والتي ترتبط على وجه التحديد ببروتين مستهدف في هذه الحالة ، بروتين S 100 B. يتم تحقيق ذلك عن طريق هضم المكتبة أولا باستخدام نوكلياز التقييد لتحرير التسلسلات العشوائية من التسلسلات التمهيدية الثابتة المحيطة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط تسلسلات المكتبة العشوائية ببروتين S 100 B المنقى واستعادتها.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إعادة توحيد التسلسلات المرتبطة بتسلسلات التمهيدي الثابتة عن طريق التهجين والربط. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في نسخ المنتجات المربوطة للسماح بإعادة تضخيم R-T-P-C-R للمجموعة المقيدة من abers المرشح ، متبوعة بجولات إضافية من إجراء الاختيار هذا. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر ارتباطا محددا للأبرز المختار ببروتين S 100 B.

على سبيل المثال ، هنا ، يتم إجراء فحوصات ربط الساندويتش باستخدام المصفوفات الدقيقة ويتم أيضا إجراء فحوصات الأبرز الثانية المصنفة بالفلورسنت باستخدام أسلاك نانوية وظيفية وحواجز ثانية مقترنة بجسيمات نانوية ذهبية 15 نانومتر. سنعرض اليوم إجراء لاختيار الأمثل ، والذي يرتبط ببروتين S مائة ب من مكتبة عشوائية من تسلسلات D. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لمجموعة متنوعة من الأغراض ، بما في ذلك تطوير منصة استشعار للكشف المبكر عن السرطان.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا الإجراء ، قم بإنشاء مكتبة DNA خالية من التمهيدي أو PF كما هو موضح سابقا. سيؤدي انقسام مكتبة الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل متبوعا بتنقية الهلام باستخدام هلام بولي أكريلاميد متغير الطبيعة بنسبة 10٪ إلى جزء 32 نيوكليوتيدات من خمسة فوسفات رئيسي في 30 سم مكعب ، وجزء 30 نيوكليوتيدات من خمسة فوسفات رئيسي في 30 ، يعين الجزء 32 زائد و 30 زائد على التوالي.

يحتوي الجزء المكون من 32 زائد على المجال العشوائي المكون من 30 نيوكليوتيدات مع الحد الأدنى من تسلسل المحيط CC في الطرف الأولي الثلاثة ، في حين أن الجزء الزائد 30 يتكون فقط من تسلسل المجال العشوائي المكون من 30 نيوكليوتيدات. لإعداد شظايا الحمض النووي لمكتبة PF لاختيار aptr ، قم بتعليق كل جزء من الأجزاء البالغ عددها 32 زائد و 30 زائد في 40 ميكرولترا من 20 ملي تريس ، حمض هيدروكلوريك 7.4. ثم سخني العينات لمدة ثلاث دقائق عند 85 درجة مئوية بعد الحضانة.

بارد ، تنخفض العينات لمدة ثلاث دقائق في حاضنة حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، بعد ذلك عند 760 ميكرولتر من الاختيار ، والعازلة والحضانة لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ثلاث دقائق ، احتفظ بالعينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، قم بتمرير المحلول عبر عمود يحتوي على حبات النيكل NTA الزراعية المغسولة مسبقا باستخدام مخزن مؤقت للاختيار.

لإزالة الحمض النووي غير المحدد، اجمع أجزاء الحمض النووي لمكتبة PF التي لا ترتبط بالعمود وتوضع جانبا لوقت لاحق. لتحضير حبات S 100 B المقيدة أولا ، قم أولا بتدوير 400 ميكرولتر من حبات NDA من النيكل لمدة ثلاث ثوان في جهاز طرد مركزي صغير وتخلص من المادة الطافية. ثم اغسل الخرزات ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم عن طريق سحب العينات برفق خمس مرات.

ثم قم بتدوير الخرز وتخلص من المادة الطافية. كرر هذا. اغسل مرتين.

بعد ذلك ، تم تنقية الهيستيدين الفقيرة سابقا ، والبروتين الموسوم به على الخرز. هنا ، S 100 الكالسيوم البشري ملزم. يستخدم البروتين ب برفق ، وقم بسحب المحلول لأعلى ولأسفل خمس مرات كل ثلاث دقائق لمدة 15 دقيقة.

بعد 15 دقيقة ، قم بتدوير الخرز وتخلص من المادة الطافية. أخيرا ، اغسل S 100 B المرتبط بالخرزة بسعة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاختيار عن طريق المداعبة برفق عن طريق المداعبة لأعلى ولأسفل ثلاث مرات. مرة أخرى ، قم بتدوير الخرزات لأسفل وتخلص من المادة الطافية.

كرر هذه الخطوة مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات نهائية للاختيار من أجل S 100 B bound. استرجع الأجزاء البالغ عددها 32 زائد و 30 زائدا التي تم وضعها جانبا مسبقا. أضف الأجزاء إلى الخرزة المقيدة بالخرزة S 100 B.ثم احتضن العينة لمدة 15 دقيقة.

الخلط كل ثلاث دقائق عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل بعد 15 دقيقة ، وتدوير الخرزات لفترة وجيزة ، والتخلص من المادة الطافية ، ثم اغسل مركب S 100 BDNA ب 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاختيار عن طريق سحب العينة برفق. ثم قم بتدوير الخرزات لأسفل وتخلص من المادة الطافية. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين.

لاستعادة S 100 ، يتم اختيار abers عند 200 ميكرولتر من 20 مللي مولار تريس ، حمض هيدروكلوريك 7.4 للخرز. ثم سخني الملاط لمدة ثلاث دقائق عند 85 درجة مئوية. بعد الحضانة.

دوامة الخرز لمدة دقيقة واحدة وتدويرها. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة مرة واحدة واجمع المواد الطافية

أخيرا ، قم بتنقية شظايا الحمض النووي المحددة. استخرج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مرتين بحجم مكافئ من كلوروفورم الفينيل وكحول الأيزوبروبيل. قم بترسيبها ب 250 مللي مولار كلوريد الصوديوم و 2.5 ضعف حجم 100٪ إيثانول عند 70 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 15 دقيقة.

تدور عند 21,000 GS عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم تخلص من الطافف. اشطف الحبيبات بنسبة 75٪ من الإيثانول بكفاءة.

قم بالدوران عند 21 ، 000 GS عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. جفف الحبيبات في فراغ سريع لمدة ثلاث دقائق بعد 10 جولات من الاختيار. استنساخ شظايا الحمض النووي المضخم ل PCR الناتج في ناقل توبو PCR 2.1 الذي تم الحصول عليه من نواة vitrogen.

ثم قم بتسلسل ما بين 40 و 50 مستعمرة مفردة لكل جزء من أجزاء N 30 cc و N 30 المحددة باستخدام التمهيدي M 13 الأمامي. قم بمحاذاة التسلسلات المحددة باستخدام برنامج Infomax vector NTI. ثم حدد تسلسلات الإجماع بناء على المحاذاة.

بمجرد تحديد تسلسلات الإجماع ، قم بشراء إجماع الشراء كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. قم بتعليق أول أبتامر تم تصنيعه مع خمسة أجزاء أولية من أمين C ستة أجزاء في المخزن المؤقت للطباعة إلى تركيز نهائي يبلغ 15 ميكرومولار. ثم حدد حل aptamer على الشرائح المنشطة لارتباط التعليمات البرمجية باستخدام مصفوفة الشبكة الصغيرة للاكتشافات apogen.

اتباع البروتوكولات الموصى بها لارتباط الكود. اطبع كل شريحة ب 12 صفيفة. استخدم تنسيق اثنين في ثمانية.

كاسيت تهجين المصفوفات الدقيقة للتهجين. خفف بروتين S 100 B إلى التركيز المناسب في 70 ميكرولتر من PBS. ثم قم بتطبيق المحلول على آبار كاسيت المصفوفة الدقيقة.

أغلق كاسيت المصفوفة الدقيقة باستخدام رقائق السقف اللاصقة الخالية من النوكلياز لمنع التبخر. اسمح للبروتين بالارتباط بالأبرز المطبوعة على رابط الكود. انزلق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة بشكل فردي.

اغسل آبار الكاسيت ثلاث مرات باستخدام PBS أو خمسة مللي مولار أو كلوريد المغنيسيوم أو PBSM. بعد ذلك ، قم بتخفيف الأبر الثاني المسمى بالفلورسنت إلى 0.125 ميكرومولار في 70 ميكرولتر من PBSM. سخني الخليط لمدة ثلاث دقائق على 85 درجة مئوية.

ثم اترك ABERS المسمى ليبرد على الجليد. لمدة ثلاث دقائق ، ضع abers على آبار كاسيت المصفوفة الدقيقة. مرة أخرى ، أغلق الكاسيت بورق لاصق واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

مرة أخرى ، بشكل فردي. اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام PBSM بعد الغسيل. قم بفك الكاسيت وشطف الشريحة بأكملها باستخدام PBSM.

ثم جفف الشريحة تماما عن طريق الطرد المركزي. أخيرا ، امسح الشريحة ضوئيا باستخدام مصفوفة مسح Packard Biosciences للمسح الضوئي. تم تحديد 4 ، 000 XL الارتباط ل gamma P 32 A TP خمسة أطراف أولية تسمى aptamers إلى بروتين S 100 B وتم رسمها مقابل التركيز لتحديد KD.

تكون kds التمثيلية بعد ما يقرب من سبع جولات من الاختيار في النطاق 10 إلى سالب سبعة مولار. تم إقران خمسة مصفوفات أولية تهدف إلى رتبة التعليمات البرمجية المصفوفات الدقيقة المنقاة S 100 B تم ربطه بالأمثل الأول و LOR 5 46 المسمى الثاني. كان Optimer مرتبطا بأول مجمعات Optimer S 100 B.

تم قياس التألق باستخدام ماسح ضوئي لمصفوفة المسح. يظهر الصف الأوسط ذبول تجليد الساندويتش الذي يتميز بربط إضافي في فحوصات الديكورات الكويتية في الصفوف أعلاه وأدناه. لا يوجد تجليد شطيرة لخمسة أبرز أولية مشتقة من الثيول تم إقرانها بأسلاك نانوية ذهبية باستخدام كيمياء الثيلة القياسية.

تم إقران الأبرز الثاني ب 50 NMO أو nps ذهبي بنفس الطريقة. ثم تم ربط بروتين S 100 B المنقى أولا بالأسلاك النانوية المشتقة ، وتم ربط aptamer الثاني 50 nano molar gold mps لاحقا بمجمعات aptamer nanowire S 100 B. تم تصور مجمعات الساندويتشات الملزمة باستخدام F FE SEM. هنا.

يمكن رؤية عنصر تحكم سلبي لاختبار الربط الذي يتم إجراؤه باستخدام بروتين HTRA واحد بدلا من بروتين S 100 B. حسنا ، أحد أهم الأشياء في الإجراء هو أننا نستخدم نهجا خاليا من التمهيدي حيث لا يكون لدينا تسلسلات ثابتة يمكن أن تسبب إيجابيات خاطئة وسلبيات خاطئة بناء على التسلسلات نفسها تطغى على المنطقة العشوائية. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم التأكد من تدمير قالب الحمض النووي قبل كل تفاعل نسخ عكسي ، وتوخي الحذر لعزل منتج R-T-P-C-R المحدد بعد كل إعادة تضخيم.

هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.