خالية من التحديد التمهيدي Aptamer باستخدام مكتبة DNA عشوائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الـ abers من مكتبة عشوائية، والتي ترتبط بشكل محدد ببروتين مستهدف، وهو في هذه الحالة بروتين S 100 B. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق هضم المكتبة باستخدام إنزيم قطع مقيد لتحرير التواليات العشوائية من تواليات البادئات الثابتة المجاورة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط تواليات المكتبة العشوائية ببروتين S 100 B المُنقى ثم استعادتها.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إعادة دمج التسلسلات المرتبطة مع تسلسلات البادئات الثابتة عن طريق التهجين والربط. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي نسخ النواتج المربوطة للسماح بإعادة تضخيم تجمع الأبيمرات المرشحة المرتبطة باستخدام R-T-P-C-R، تليها جولات إضافية من إجراء الانتقاء هذا. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر ارتباطاً نوعياً للأبيمرات المختارة ببروتين S 100 B.

على سبيل المثال، يتم هنا إجراء مقايسات ربط الساندوتش باستخدام المصفوفات الدقيقة، كما تُجرى مقايسات للأجسام المضادة الثانية الموُسمة فلوريسنتيًا باستخدام أسلاك نانوية وظيفية وأجسام مضادة ثانية مقترنة بجسيمات ذهب نانوية بحجم 15 nanometer. سنعرض اليوم إجراءً لاختيار الأجسام المضادة الأمثل التي ترتبط ببروتين S hundred B من مكتبة عشوائية من تسلسلات D. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لأغراض متنوعة، بما في ذلك تطوير منصة استشعار للكشف المبكر عن السرطان.

فلنبدأ الآن. لبدء هذا الإجراء، قم بإنشاء مكتبة DNA خالية من البادئات (PF DNA library) كما تم وصفه سابقاً. سيؤدي قطع مكتبة DNA مزدوجة الشريط، متبوعاً بالتنقية باستخدام هلام بولي أكريلاميد مسخ بنسبة 10%، إلى الحصول على قطعة من 32 نيوكليوتيد ذات مجموعة فوسفات في الطرف '5، وقطعة من 30 نيوكليوتيد ذات مجموعة فوسفات في الطرف '5، واللتين يُرمز لهما بـ 32+ و 30+ على التوالي.

تحتوي قطعة 32 plus على نطاق عشوائي مكون من 30 نيوكليوتيد مع تسلسل جانبي أدنى CC عند الطرف الثلاثي (three prime)، بينما تتكون قطعة 30 plus من تسلسل النطاق العشوائي المكون من 30 نيوكليوتيد فقط. ولتحضير قطع DNA لمكتبة PF من أجل عملية اختيار aptr، يتم إعادة تعليق كل من قطع 32 plus و30 plus في 40 µL من محلول 20 mM tris, HCL pH 7.4. بعد ذلك، تُسخن العينات لمدة ثلاث دقائق عند 85 °C بعد فترة الحضانة.

قم بتبريد العينات لمدة ثلاث دقائق في حمام مائي حاضن عند درجة حرارة 37 °C، ثم أضف 760 µL من منظم الاختيار وقم بالتحضين لمدة ثلاث دقائق عند 37 °C. بعد مرور ثلاث دقائق، احتفظ بالعينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد التحضين، قم بتمرير المحلول عبر عمود يحتوي على حبيبات nickel NTA agro التي تم غسلها مسبقاً بمنظم الاختيار.

لإزالة الحمض النووي غير النوعي، اجمع قطع الحمض النووي لمكتبة PF التي لم تلتصق بالعمود واحتفظ بها لاستخدامها لاحقاً. ولتحضير الخرز المرتبط بـ S 100 B، قم أولاً بطرد مركزي لـ 400 microliters من خرز النيكل NDA لمدة ثلاث ثوانٍ في جهاز طرد مركزي دقيق وتخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، اغسل الخرز باستخدام 400 microliters من محلول الربط عن طريق السحب والضخ بلطف باستخدام الماصة لخمس مرات.

بعد ذلك، قم بطرد الخرزات مركزياً لأسفل وتخلص من السائل الطافي. كرر هذه العملية. اغسل مرتين.

بعد ذلك، يتم تمرير البروتين المنقى مسبقاً والموسوم بالهستيدين فوق الخرزات. في هذه التجربة، تم استخدام بروتين S 100 البشري الرابط للكالسيوم B. يتم سحب المحلول وإطلاقه بلطف باستخدام الماصة خمس مرات كل ثلاث دقائق، لمدة إجمالية تصل إلى 15 دقيقة.

بعد مرور 15 دقيقة، قم بإجراء طرد مركزي للكرات وتخلص من السائل الطافي. وأخيراً، اغسل بروتين S 100 B المرتبط بالكرات باستخدام 400 µL من محلول التحديد المنظم عن طريق التحريك اللطيف للأعلى والأسفل ثلاث مرات. قم بإجراء طرد مركزي للكرات مرة أخرى وتخلص من السائل الطافي.

كرر هذه الخطوة مرتين، ليكون المجموع ثلاث غسلات نهائية، وذلك لاختيار الأجسام المضادة المرتبطة بـ S 100 B. استرجع شظايا 32 plus و 30 plus التي تم تنحيتها سابقاً. أضف الشظايا إلى S 100 B المرتبط بالخرزات. ثم حضن العينة لمدة 15 دقيقة.

يتم الخلط كل ثلاث دقائق عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة، وبعد مرور 15 دقيقة، تُطرد الخرزات مركزياً لفترة وجيزة، ويُتخلص من السائل الطافي، ثم يُغسل معقد S 100 BDNA بـ 800 µL من محلول التحديد المنقي عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة. بعد ذلك، تُطرد الخرزات مركزياً ويُتخلص من السائل الطافي. تُكرر خطوة الغسل هذه مرتين.

لاستعادة S 100، يتم إضافة 200 µL من Tris-HCl بتركيز 20 mM و pH 7.4 إلى الحبيبات. ثم يتم تسخين المزيج لمدة ثلاث دقائق عند 85 °C. بعد فترة الحضن.

قم برجّ الخرز باستخدام جهاز جهاز هزاز (vortex) لمدة دقيقة واحدة ثم قم بطردها مركزياً لترسيبها. بعد ذلك، انقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد. كرر هذه الخطوة مرة واحدة واجمع السوائل الطافية معاً.

أخيراً، قم بتنقية قطع DNA المختارة. استخلص نواتج PCR مرتين باستخدام حجم مكافئ من phenyl chloroform و isopropyl alcohol. ثم رسبها باستخدام 250 millimolar من sodium chloride و 2.5 مرة من حجم 100% Ethanol عند درجة حرارة minus 70 degrees Celsius لمدة 15 minutes.

قم بالطرد المركزي عند 21,000 GS في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تخلص من الطافي. اشطف الراسب بـ 75%ethanol بكفاءة.

قم بالطرد المركزي بسرعة 21,000 GS عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وتخلص من الطافي. جفف الراسب في جهاز طرد مركزي مفرغ (speed vacuum) لمدة ثلاث دقائق بعد 10 جولات من الانتخاب. قم باستنساخ قطع DNA المضخمة بواسطة PCR الناتجة في ناقل PCR 2.1 topo الذي تم الحصول عليه من vitrogen core.

بعد ذلك، قم بتسلسل ما بين 40 و 50 مستعمرة مفردة لكل من قطع N 30 cc و N 30 المختارة باستخدام بادئ M 13 الأمامي. قم بمحاذاة التسلسلات المختارة باستخدام برنامج infomax vector NTI. ثم حدد تسلسلات الإجماع بناءً على عمليات المحاذاة.

بمجرد تحديد تتابعات الإجماع، يتم شراء خيوط الإجماع كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. يتم تعليق أول aptamer تم تخليقه مع شطر Amin C في الطرف 5' في محلول طباعة مؤقت بتركيز نهائي قدره 15 micromolar. بعد ذلك، يتم وضع محلول الـ aptamer على شرائح منشطة بـ code link باستخدام مصفوفة microgrid array من apogen discoveries.

اتبع البروتوكولات الموصى بها في رابط الكود. اطبع كل شريحة بحيث تحتوي على 12 مصفوفة. استخدم تنسيق اثنين في ثمانية.

كاسيت تهجين المصفوفة الدقيقة (microarray) لعملية التهجين. قم بتخفيف بروتين S 100 B إلى التركيز المناسب في 70 µL من PBS. بعد ذلك، ضع المحلول في آبار كاسيت المصفوفة الدقيقة.

قم بإغلاق كاسيت المصفوفة الدقيقة (microarray cassette) باستخدام رقاقة تغليف لاصقة خالية من النوكلياز لمنع التبخر. اترك البروتين ليرتبط بالأجسام المضادة المطبوعة على الشريحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد عملية التحضين بشكل فردي.

اغسل آبار الكاسيت ثلاث مرات باستخدام PBS يحتوي على خمس ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم أو PBSM. بعد ذلك، خفف الأجسام المضادة الثانوية الموُسومة فلورياً لتصل إلى 0.125 micromolar في 70 microliters من PBSM. سخن المزيج لمدة ثلاث دقائق عند 85 °C.

بعد ذلك، اترك ABERS المسمى ليبرد على الثلج. وقم بتطبيق ABERS على آبار كاسيت المصفوفة الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. مرة أخرى، قم بإغلاق الكاسيت باستخدام الرقاقة اللاصقة واحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

كرر العملية مرة أخرى، وبشكل فردي. اغسل الآبار ثلاث مرات بـ PBSM بعد عملية الغسل. قم بتفكيك الكاسيت وشطف الشريحة بأكملها باستخدام PBSM.

ثم جفف الشريحة جيداً عن طريق الطرد المركزي. وأخيراً، قم بمسح الشريحة باستخدام مصفوفة مسح من Packard Biosciences. تم تحديد ارتباط 4,000 XL للأبتامرات الملحقة بـ gamma P 32 A TP في الطرف الخماسي (five prime) مع بروتين S 100 B وتم رسمها مقابل التركيز لتحديد KD.

تكون قيم Kd التمثيلية بعد سبع جولات تقريباً من الاختيار عادةً في نطاق 10⁻⁷ مولار. تم ربط أبتامرات الاستهداف الأولى 5' بمصفوفات دقيقة من نوع code link، ثم تم ربط بروتين S100B المنقى بالأبتامر الأول، وأخيراً تم ربط الأبتامر الثاني المسمى بـ LOR 5 46 بمعقدات S100B المرتبطة بالأبتامر الأول.

تم قياس الفلورة كمياً باستخدام ماسح مصفوفة المسح. يوضح الصف الأوسط ارتباط الساندوتش الذي يتميز بارتباط تراكمي في مقايسات KD في الصفوف الأعلى والأسفل. لا يوجد ارتباط ساندوتش بالنسبة لـ abers، حيث تم ربط أول abers المشتقة من ثيول في الطرف الخماسي (5 prime) بالأسلاك النانوية الذهبية باستخدام كيمياء الثيول القياسية.

تم ربط الأجسام المضادة الثانية بـ 50 NMO أو بجسيمات الذهب النانوية (gold nps) بنفس الطريقة. بعد ذلك، تم ربط بروتين S 100 B المُنقى أولاً بالأسلاك النانوية المشتقة، ثم رُبطت الـ aptamer الثانية بتركيز 50 nano molar gold mps بمعقدات S 100 B والأسلاك النانوية المرتبطة بالـ aptamer الأول. وتم تصوير معقدات الساندوتش المرتبطة باستخدام F FE SEM.

يمكن رؤية ضابط سلبي لاختبار ربط تم إجراؤه باستخدام بروتين HTRA one بدلاً من بروتين S 100 B. حسنًا، أحد أهم الجوانب في هذا الإجراء هو أننا نستخدم نهجاً خالياً من البادئات حيث لا توجد تسلسلات ثابتة قد تتسبب في نتائج إيجابية أو سلبية خاطئة بناءً على التسلسلات نفسها التي قد تطغى على المنطقة العشوائية. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من تدمير قالب DNA قبل كل تفاعل نسخ عكسي، والحرص على عزل ناتج R-T-P-C-R المحدد بعد كل عملية إعادة تضخيم.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.