التخيل والكمي لالتفاعلات داخل الخلايا النيسرية السحائية والإنسان α - actinin بواسطة التصوير متحد البؤر

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم مستوى التموضع المشترك للبكتيريا الداخلية ، RIA السحائي مع بروتين الهيكل الخلوي Alpha Actinin. يتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة خلايا الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري المزروعة بزراعة البكتيريا طوال الليل لمدة ثلاث إلى ثماني ساعات للسماح للبكتيريا بدخول الخلايا المستهدفة. كخطوة ثانية يتم غسل الخلايا التي تحتوي على بكتيريا داخل الخلايا وتثبيتها ثم تغلغلها ، مما يهيئ الثقافة المصابة للتلوين المناعي للبكتيريا الداخلية وأكتينين ألفا داخل الخلايا.

بعد التصوير متحد البؤر وتطبيق برنامج التحديد المشترك ، يمكن ملاحظة صور التموضع داخل الخلايا والحصول على نتائج كمية تظهر أن السحح الدموي يعبر عن OPC وأيضا البروتين الغشائي يمكن أن يتفاعل على وجه التحديد مع ألفا أكتينين داخل الخلايا بناء على التصور المجهري متحد البؤر وعن طريق تحليل التحديد الكمي. مرحبا ، أنا إيزل ماريا من مختبر البروفيسور ماتا TI في قسم الطب الجزيئي الخلوي بجامعة بري. سنعرض لك اليوم إجراء لتقدير مستوى الكول ، نسبة البكتيريا داخل الخلايا مع بروتينات الهيكل الخلوي.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تفاعل التهاب السحايا الفطري الذي يعبر عن بروتين الغشاء التلقائي OPC مع بروتين الهيكل الخلوي ألفا أكتين. لذلك دعونا نبدأ. يجب القيام بهذا العمل في مختبر سلامة مناسب.

قبل يومين من إجراء التلوين المناعي ، قم بتلقيح البقعة البكتيرية ذات الأهمية عند تسريب قلب الدماغ. تنمو صفائح أجار المكملة بدم حصان ساخن بنسبة 10٪ بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ في اليوم السابق للتلطيخ المناعي. استخدم حلقة ثقافة سعة 10 ميكرولتر لعمل تعليق للثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها.

في ملليلترين من PBSB ، اترك المعلق يقف لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للركام البكتيري الكبير بالاستقرار. بعد ذلك ، انقل المليلتر العلوي من التعليق إلى أنبوب معقم دون إزعاج البكتيريا الذوبان في الحبيبات عن طريق إضافة مليلتر واحد من 1٪ SDS 0.1 مولي هيدروكسيد الصوديوم إلى قارورتين تحتويان على 20 ميكرولتر من التعليق البكتيري وعكس الأنبوب للخلط. لتقدير الأعداد البكتيرية.

قم بقياس محتوى الحمض النووي عن طريق تحديد امتصاص المحلول. عند 216 قرون ، قم بضبط المعلق البكتيري على الكثافة المطلوبة في وسط العدوى لإصابة الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري. الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للدماغ البشري أو H-B-M-E-C-A التي تم زرعها قبل يومين من التلوين المناعي ، تم وضع غطاء زجاجي بحجم 16 ملم ينزلق في آبار صفيحة 12 بئر وبذرة HBME عند 50٪ التقاء على زلات الغطاء تحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في غلاف جوي 5٪ من ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي.

تصيب الخلايا بالتعليق البكتيري المحضر حديثا في مختبرنا. يتم استخدام نسبة عدوى من 200 إلى 300 وحدة تشكيل مستعمرة لكل خلية مستهدفة بشكل روتيني. احتضان لمدة ثلاث إلى ثماني ساعات عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون في نهاية فترة الإصابة.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وقم بتثبيت 500 ميكرولتر من 2٪ بارا فورمالديهايد لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد غسل الفقرة فورمالديهايد ، قم بتثبيت الخلايا الثابتة للبارالديهايد عن طريق احتضان 0.1٪ Triton X 100 المخفف في PBS لمدة 10 دقائق. أخيرا ، اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS وانتقل إلى التلوين المناعي كما هو موضح. بعد ذلك ، يمكن إجراء تلطيخ البكتيريا داخل الخلايا و dfor actinin في وقت واحد.

في 12 لوحة بئر ، تسد زلات الغطاء التي تحتوي على الخلايا القابلة للاختراق مع 500 ميكرولتر من 3٪ B-S-A-P-B-S-T لمدة 30 إلى 60 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة بعد الغسيل مع نقل PBS ، ينزلق كل غطاء إلى بئر جاف جديد في لوحة 12 بئر في الأجسام المضادة الأولية ضد البكتيريا وألفا أكتينين في وقت واحد 80 إلى 100 ميكرولتر من الجسم المضاد لكل زلة غطاء كافية إذا تمت إضافتها بعناية لتغطية سطح زلة الغطاء ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في نهاية الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى ، ارفع زلة الغطاء جيدا وضعها في بئر جديد يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS بعد خمس دقائق ، قم بإزالة PBS عن طريق سحب العينات ثم أضف PBS جديدا. كرر مرتين وانزلق الغطاء إلى بئر جاف جديد.

بعد ذلك ، أضف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المترافقة مع فلوروكرومات مختلفة مخففة في 1٪ B-S-A-P-B-S-T احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام في نهاية غسل الحضانة الموضح سابقا ثم قم بمضاد الحمض النووي باستخدام DPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام في نهاية هذه الحضانة ، اغسل الغطاء ينزلق في PBS مرة واحدة ثم قم بتركيبه بقطرة من التركيب. يجب تخزين زلات الغطاء المتوسطة المثبتة في الظلام حتى تصبح جاهزة للمراقبة. تحت المجهر ، نراقب ونلتقط صورا لعيناتنا ذات العلامات المناعية باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المتصل بمجهر مضان epi مقلوب.

لبدء إجراء CLSM عند قطرة من الغمر في الهدف ووضع غطاء شريحة العينة ، والانزلاق لأسفل على مرحلة المجهر ، وضبط المجهر على الوضع المرئي والعثور على منطقة الاهتمام باستخدام قطع العين في المجهر ، نحن الآن جاهزون لاستخدام برنامج Leica. حدد وضع اكتساب XY zed. حدد التنسيق الخمسة 12 × خمسة 12 لدراسات التوطين المشترك.

كلما زادت الدقة ، زادت دقة الصورة. ثم حدد وضع X ثنائي الاتجاه ، مما سيزيد من سرعة المسح ويساعد في تقليل تبييض الصور. قم بإعداد إعدادات المسح الضوئي المتسلسل.

انقر فوق وظيفة SEC ثم حدد بين الأسطر. حدد أشعة الليزر وفقا للفلوروكرومات المترافقة مع الأجسام المضادة الثانوية. 4 0 5 نانومتر ل DPI 4 88 نانومتر لأليكسا ، فلور 4 88 و 5 61 نانومتر.

بالنسبة إلى trixy ، قم بتنشيط أنبوب المضاعف الضوئي واحد واثنين وثلاثة على التوالي. قم بإعداد الجزء العلوي والسفلي من مكدس Z أو السلسلة. المجموعة التالية ، حجم خطوة Zed إلى 0.2 ميكرومتر.

RIA Mencius هو ديبلو شاغر وبما أن كل تجمع له قطر تقريبي يبلغ 0.5 ميكرومتر ، فإن حجم خطوة Z البالغ 0.2 ميكرومتر يعزز احتمالية مسح كل تجمع مرتين على الأقل. قم بتعيين معلمات المسح النهائي عن طريق تحديد متوسط الخط من ثلاثة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالنقر فوق ابدأ. يتم الحصول على الصور الملطخة المزدوجة أو الثلاثية عن طريق المسح المتسلسل بأطوال موجية مختلفة وباستخدام وضع ما بين الخطوط لكل قناة للتخلص من الحديث المتبادل بين الكروموفورات المختلفة.

للحصول على إشارة إلى تحديد الموقع المشترك لاثنين من الفلوروكروم، حدد وظيفة التراكب لدمج القنوات المحددة في صورة واحدة. على سبيل المثال ، عندما يظهر كل من Alexa 4 88 و trissy Fluor Chromes في توطين اللون الأصفر في الصورة المتراكبة لإعادة بناء ثنائية الأبعاد المطلوبة لتصور تجميع Zed المكدس أو السلسلة الممكنة باستخدام الحد الأقصى لوظيفة الإسقاط. بعد الحصول على مكدس Z أو السلسلة ، قم بمعالجة بياناتك للحصول على صورة متعامدة لتصور التوطين داخل الخلايا للعناصر المختلفة.

يتم إجراء القياس الكمي للتحديد المشترك باستخدام برنامج Vol City من توفير IMP. لبدء إنشاء مكتبة بصور CLSM، حدد التركيز الموسع من الصورة في الشريط العلوي. ستجمع هذه الأداة بين Zacks في صورة ثنائية الأبعاد ليتم تحليلها.

حدد الآن أداة تحديد المواقع المشتركة. يجب أن يكون للقناتين المراد تحليلهما نفس عمق اللون. حدد المنطقة التي سيتم تحديدها كميا.

قم بتعيين الحد لإزالة أي خلفية. قم بإنشاء إخراج colocalization عن طريق تحديد إنشاء colocalization. سيتم إنشاء إحصائيات التحديد المشترك للمناطق ذات الأهمية المحددة مسبقا.

بعد ذلك ، حدد معاملات Mander R و ny. أخيرا ، قم بتصدير أو إحصائيات القيم إلى مستند Excel لعرض البيانات الموضحة هنا نتائج التصوير متحد البؤر التمثيلية للخلايا البطانية للدماغ البشري المصابة بقرينة السحائية لمدة ثماني ساعات. يظهر موقع البكتيريا باللون الأحمر.

بينما يظهر موقع ألفا أكتينين في الأسهم الخضراء تشير إلى المناطق التي يبدو أن درجة عالية من تراكم ألفا أكتينين قد حدثت حول البكتيريا. في صورة التراكب هذه ، هناك العديد من المناطق التي يظهر فيها اللون البرتقالي الأصفر مما يشير إلى تحديد الموقع بين السحيا occi و alpha actinin. في هذه الصورة التالية ، يشير التشريح البصري لطبقة أحادية H-B-M-E-C المصابة إلى تحديد الموقع المشترك حول البكتيريا داخل الخلايا الموجودة في قاعدة الخلية.

عندما تمت معالجة الصور ثلاثية الأبعاد للطبقات الأحادية المصابة H-B-M-E-C ، تظهر نظرة مائلة للسطح القمي بكتيريا ديورانت ملطخة باللون الأحمر يشار إليها بالسهم الأحمر حيث توجد العديد من البكتيريا باتجاه الأسطح القاعدية للخلايا البطانية المشار إليها بالسهم الأصفر. يمكن رؤية الموقع القاعدي البرتقالي والأصفر باللون بشكل أكثر وضوحا في هذا المقطع العرضي ENDON XZ. على عكس بعيد ، تكشف تجارب الأكتينين التي تم فيها وضع العلامات على البكتيريا الداخلية وإما المنتون أو الأكتين عن تحديد موقع عرضي مع الأكتين ولكن نادرا مع التخمير في خلايا H-B-M-E-C.

كما لوحظ في التجارب السابقة ، تركز ريتين حول العديد من البكتيريا الداخلية المشار إليها بواسطة الأسهم البيضاء. كما تم تحليل البيانات للحصول على تداخل نسبي. المعامل R ، الذي يمثل وفقا لماندا ، الدرجة الحقيقية للتوطين ، أي عدد وحدات البكسل التي تشارك في التوطين مقارنة بالعدد الإجمالي للبكسل وقيم نيويورك لألفا أكتينين ، وذكر وأكتين بشكل عام في H-B-M-E-C المصابة بالمكورات السحائية OPC التي تعبر عن المكورات السحائية ، تم الحصول على أكثر من 25٪ من تداخل العنان في المكورات السحائية.

المعامل و Y هو مقياس لتردد عملة إشارة الكبح الأكثر وفرة في كل مرة تحدث فيها إشارة الكاكاو السحائية الأقل وفرة. يظهر هذا المقياس مستوى مذهلا لحدوث ألفا أكتينين بالقرب من كوكي السحائية الداخلي. نوضح لك فقط كيفية تصور وتحديد إدخال البكتيريا الداخلية بعناصر الهيكل الخلوي في هذه التجربة.

من المهم أن تتذكر اتباع بروتوكولات التثبيت والجذع المناعي بدقة للحفاظ على سلامة الهياكل وتجنب الخلفية العالية. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.