أليغو التنميط قداس (OLIMP) من السكريات خارج الخلية
June 20th, 2010
وصفت وسيلة سريعة للحصول على نظرة ثاقبة لبنية السكريات في المصفوفة خارج الخلية. الأسلوب يستفيد من خصوصية وحساسية glycosylhydrolases من مطياف الكتلة يسمح تحليل كميات ضئيلة من المواد. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف لاستخدامها مباشرة على النسيج نفسه.
يسمح التنميط الكتلي oligo أو التجربة الأولمبية الموضحة هنا للمرء باكتساب رؤى سريعة حول بنية البوليمرات في المصفوفة خارج الخلية أو جدار الخلية للكائن الحي. في الحالة هنا ، يتم تحضير جدران الخلايا من شتلات النبات عن طريق إزالة المكونات الخلوية أولا بنسبة 70٪ من الإيثانول. يتم هضم بوليمر الجدار المستهدف بعد ذلك باستخدام دانتيل مائي محدد يذوب مكونات جدار معينة على شكل جميع الأربطة.
النهج البديل هو هضم جدار الخلية باستخدام الإنزيم الموجود في C اثنين مباشرة على الأنسجة. يتم تحديد الوفرة النسبية لإطلاق الأربطة بواسطة MALDI لقياس الطيف الكتلي والتحليل الإحصائي. مرحبا ، أنا ماركوس بولي من معهد العلوم الحيوية للطاقة هنا في جامعة كاليفورنيا في بيركلي.
مرحبا ، أنا ماركوس ري وأنا آشا جيلر. أيضا من معهد العلوم الحيوية للطاقة. الكائنات الحية محاطة بمصفوفات خارج الخلية تتكون اعتمادا على الكائن الحي من شبكات بوليمر معقدة.
الطريقة السريعة والحساسة لتقييم المصفوفة خارج الخلية هي الطريقة التي نسميها أولي التنميط الشامل الأوليوم القصير ، والتي سنعرضها لك اليوم. يمكن أيضا إجراء هذا الإجراء مباشرة على الأنسجة النباتية. لذلك دعونا نبدأ.
ابدأ هذا الإجراء بعزل المصفوفة خارج الخلية أو جدار الخلية للأنسجة النباتية. احصد خمس شتلات أرابيدوبسيس أو ما يعادلها من المواد النباتية الأخرى وانقلها إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر. تأكد من وضع المادة في قاع الأنبوب.
أضف كرتين معدنيتين بحجم ثلاثة ملليمترات إلى أنبوب التفاعل وقم بتجميد النيتروجين السائل. ثم قم بطحن العينة المجمدة باستخدام مطحنة كروية لمدة 2.5 دقيقة عند 25 هرتز. بعد طحن المادة ، أضف ملليلتر واحد من الإيثانول المائي بنسبة 70٪ إلى العينة.
قم بإزالة الكرات المعدنية باستخدام مغناطيس ودوامة جيدا. يعمل هذا العلاج على إذابة معظم البروتينات وعضيات الخلايا بالطرد المركزي للعينة عند 14 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق لتكسير بقايا الكحول غير القابلة للذوبان. تمثل مادة جدار الخلية ، قم بشفط المادة الطافية بعناية ، مع التأكد من عدم إزعاج الحبيبات.
أضف ملليلتر واحد من محلول الميثانول الكلوروفورم إلى الحبيبات المتبقية في دوامة الأنبوب جيدا. لإعادة تعليق الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي ، يستخرج الميثانول الكلوروفورم المركبات الكارهة للماء مثل الدهون. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة السنات وجفف الحبيبات تماما باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ ، يكمل هذا عزل مادة جدار الخلية ، والتي يمكن معالجتها الآن بإنتاج أربطة محددة.
المثال الموضح هنا هو إذابة Xlo glucan ، وهو السليلوز الدموي الرئيسي الموجود في جدران الخلايا لنباتات ثنائي القطن مثل نبات الأرابيدوبسيس Xlo glucan هو بوليمر يتكون من العمود الفقري للجلوكان الذي يتم استبداله بشكل كبير ببقايا السكر الأخرى لإذابة هذا البوليمر. يتم استخدام endo glucan الفطري لإذابة هذا السليلوز الهمي Resus ، قم بتعليق حبيبات جدار الخلية المعزولة الجافة في 25 ميكرولتر من 50 مليمولار فورمات الأمونيوم 4.5 وإضافة 0.2 وحدة من جلوكونات إندو. دوامة التعليق وتدوير السائل لأسفل.
ضع الأنبوب في الخلاط واترك الجدران تهضم لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج. عند 300 دورة في الدقيقة. عند اكتمال هضم جدار الخلية المعزولة ، قم بإزالة المذيب باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ واستمر في تحليل السكريات قليلة السكاريد التي تم إطلاقها عن طريق قياس الطيف الكتلي ، تتم إزالة الأملاح والإنزيم من العينة المهضومة باستخدام حبات راتنج التبادل الكاتيوني من Biox MSD 5 0 1.
يتم تكييف الخرزات أولا عن طريق وضع الكمية المطلوبة في عمود فارغ وغسل الخرزات بكميات وفيرة من الماء. أضف خمسة إلى 10 حبات كاتيونية بيوكس مكيفة إلى العينة المهضومة والمجففة. ثم أضف 10 ميكرولتر من الماء لكميات أقل من المواد.
يمكن استخدام خمسة ميكرولتر من الماء. اغمر الخرزات في المحلول عن طريق تدوير الأنبوب لفترة وجيزة لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة أثناء احتضان الهضم بالخرز. ضع ميكرولترين من مصفوفة DHB على لوحة مستهدفة D mal.
تبخر مذيب المصفوفة تحت الفراغ مما يؤدي إلى بلورات كيميائية مصفوفة الآن يكتشف ميكرولترين من محلول Desalted Digest. في الجزء العلوي من بلورات المصفوفة على اللوحة المستهدفة. يتبخر مذيب بقعة مصفوفة العينة مرة أخرى تحت الفراغ.
من المهم الحفاظ على فترة زمنية مناسبة لخلط سائل مصفوفة العينة قبل التبلور كما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول المكتوب المصاحب. بمجرد أن تجف العينة ، ضع اللوحة المستهدفة في مطياف مالدي إلى الكتلة. اضبط الجهاز على الوضع الإيجابي بجهد متسارع يبلغ 20,000 فولت وتأخير 350 نانومتر.
نطاق الكتلة المحدد لأربطة السليلوز الهيمي هو 500 إلى 3000 دالتون. يجب تعديل نطاق الكتلة وفقا لحجم الأربطة المتوقعة. ابدأ في إطلاق الليزر واجمع 100 إلى 200 طيف لكل عينة ، والتي يتم تجميعها لتوليد طيف متوسط تمثيلي.
هذا هو طيف السليلوز الهيمي. يمكن أيضا استخدام طريقة oly الموضحة في هذا الفيديو مباشرة على الأنسجة النباتية ، مع حذف أي خطوات لتحضير الجدار. يتم توضيح إجراء التحليل في الموقع هذا على شتلات الأرابيدوبسيس المزروعة الداكنة.
توضع العينة مباشرة على صفيحة مستهدفة وتجفف بالهواء إلى الشتلات الجافة على اللوحة. أضف 0.5 ميكرولتر من مزيج العازلة الإنزيمي المناسب في المواضع المرغوبة. تأكد من أن قطرة الإنزيم تلامس جزئيا الأنسجة واللوحة المستهدفة.
ضع لوحة المالدي المستهدفة في وعاء مغلق به رطوبة مشبعة لتجنب جفاف قطرات الإنزيم. احتضان الطبق لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. في نهاية فترة الحضانة ، جفف بقعة الإنزيم تحت الفراغ وأضف 0.5 ميكرولتر من مصفوفة DHB السائلة فوق كل بقعة إنزيم مجففة.
ثم جفف لوحة الهدف MALDI تحت الفراغ. لتحليل NC عينتين. ضع اللوحة المستهدفة ، بما في ذلك بقع مصفوفة إنزيم عينة الأنسجة في أطياف كتلة تسجيل مطياف متعدد إلى كتلة ، باستخدام نفس الإعدادات الخاصة بعينة جدار الخلية المعزولة.
ابدأ في إطلاق الليزر على المصفوفة. عينة من البلورات بجوار الأنسجة. تأكد من عدم ضرب الأنسجة نفسها كما هو الحال في مثل هذه الحالة ، سيكون وقت طيران الجزيئات متوقفا.
اجمع حوالي 20 إلى 50 طيفا لكل بقعة وقم بتجميعها لإنشاء طيف متوسط تمثيلي. هذا هو الطيف المتوسط التمثيلي لقليل السكاريد المشتق من HemosIL glucan الموجود في AOPs. تضاف الشتلات أو شدة الأيونات أو ارتفاع الأيونات لجميع الأيونات ذات الأهمية بنسبة تصل إلى 100٪ مما يؤدي إلى الوفرة النسبية لمختلف السكريات قليلة.
تعطي نتيجة طريقة NC two OMP نتائج مماثلة. يمكن تحليل كل قطرة هضم إنزيم مميزة بدائرة ملونة بشكل مستقل ويمكن الحصول على أطياف الكتلة المقابلة وتحليلها. يمكن أيضا إجراء Oola على بوليمرات أخرى من المصفوفة خارج الخلية إذا كان إنزيم التحلل المائي المناسب متاحا.
على سبيل المثال ، هذا طيف أولا من سيلين السليلوز الهيمو الموجود في محصول الطاقة الحيوية. السيدة كانوس للحصول على البيانات المقدمة بينما تم هضم المواد من ورقة mecampus باستخدام xin. لتعيين الهياكل للأيونات ، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المصاحب.
لقد أظهرنا لك للتو إجراء التنميط الكتلي oligo mar على المقاييس الخلوية الخارجية. البوليمرات، عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يمكن الحصول على أفضل النتائج عند الحصول على نتائج مصفوفة متجانسة لتحليل OV MS. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في التجارب.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة سريعة لتحليل بنية السكريات المتعددة في المصفوفة خارج الخلية باستخدام الإنزيمات المحللة للجليكوزيد والتحليل الطيفي للكتلة. يمكن تطبيق التقنية مباشرة على عينات الأنسجة، مما يسمح بتحليل دقيق لكميات صغيرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا النبات
الخلفية
- تتكون المصفوفات خارج الخلية من شبكات بوليمر معقدة.
- فهم بنية السكريات المتعددة أمر بالغ الأهمية للعديد من التطبيقات البيولوجية.
- قد لا توفر الطرق التقليدية رؤى سريعة حول هذه الهياكل.
- يوفر التحليل الطيفي للكتلة أسلوبًا حساسًا لتحليل العينات الصغيرة.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لتحليل سريع للسكريات المتعددة في المصفوفة خارج الخلية.
- استخدام الإنزيمات المحللة للجليكوزيد لهضم بوليمرات الجدار بشكل محدد.
- الدليل على قابلية الأسلوب للتكيف لتحليل الأنسجة المباشر.
الطرق المستخدمة
- عزلة مادة الجدار الخلوي من الأنسجة النباتية.
- هضم البوليمرات باستخدام إنزيمات محددة.
- تحليل السكريات الأوليغوسكاريدية المفرج عنها بواسطة تحليل الكتلة MALDI-TOF.
- التحليل في الموقع مباشرة على أنسجة النبات دون تحضير مسبق.
النتائج الرئيسية
- تتيح الطريقة إذابة السكريات المتعددة المحددة.
- يقوم تحليل الكتلة بشكل فعال بتنميط السكريات الأوليغوسكاريدية المفرج عنها من العينات المهضومة.
- يوفر التحليل في الموقع نتائج قابلة للمقارنة مع العينات المعزولة.
- التقنية قابلة للتكيف لمختلف أنواع الأنسجة النباتية والظروف.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة المطورة أسلوبًا سريعًا وحساسًا لتحليل السكريات المتعددة.
- يمكن تطبيقها مباشرة على عينات الأنسجة، مما يزيد من فائدتها في البحث.
- تفتح هذه التقنية طرقًا جديدة لدراسة المصفوفات خارج الخلية في كائنات مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
OLIGO Mass Profiling (OLIMP) enables rapid, high-sensitivity structural analysis of plant extracellular polysaccharides, supporting early-stage discovery and de-risking in biopharma and industrial biotechnology. By providing detailed glycostructure profiles from minimal sample input, OLIMP enhances predictive confidence in target validation and informs the development of renewable biomaterials. Its high-throughput compatibility positions it as a strategic tool for portfolio triage and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of extracellular matrix composition and polymer structure in plant systems.
- Enables biological de-risking by revealing glycostructural diversity and substitution patterns.
- Supports predictive confidence in selecting and validating polysaccharide targets for downstream applications.
Screening & Assay Development
- Prepares validated glycostructure profiles for assay standardization and reproducibility.
- Delivers quantitative relative abundance data for oligosaccharide ions, supporting robust screening workflows.
- Enables high-throughput analysis and platform scalability for diverse wall polymers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns glycostructure analysis with translational biomarker discovery in plant-based systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative glycomic profiling.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for renewable resource development and bioprocessing strategies.
Pipeline & Workflow Integration
OLIMP integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid glycostructure profiling, from early hypothesis testing to lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping extracellular polysaccharide structures.
- Screening: Provides reproducible, quantitative mass spectrometry outputs for comparative analysis of wall polymers.
- Analytics: Delivers relative abundance and substitution-pattern data to inform condition comparisons and mechanistic studies.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and continuity across plant model systems and renewable material pipelines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability adaptable to multiple polymer targets and enzyme specificities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in glycostructure analysis.
- Operational Value: Standardizes workflows with high sensitivity, reproducibility, and minimal sample requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling rapid, high-throughput profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of renewable resource and glycoengineering projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymatic digestion and MALDI-TOF mass spectrometry.
- Needs access to specific glycosylhydrolases for targeted polymer analysis.
- Demands standardized sample preparation and matrix application for reproducible results.
- Adaptable to various plant and microbial model systems with appropriate enzyme selection.
- Limited to relative quantification; absolute oligosaccharide amounts are not determined.
![غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F4238.jpg%3Fv%3D2026-07-07T13%253A21%253A16.775Z&w=384&q=75)
