Name: قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: تعلم قياس نشاط الكالباين في الخلايا الثابتة والحية باستخدام التدفق الخلوي. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة دور البروتياز في أمراض الدم والأورام.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بدعم من المنح المقدمة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية ، وسرطان الدم والغدد اللمفاوية والمجتمع في كندا ومؤسسة الليمفوما في كندا.

إعداد الكواشف ملاحظة : جميع PBS يحتوي الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف الكاشف إضافة 20μM - 7 - 4 - الأمينية كلوروميثيل الكومارين ، تي BOC - يسين ، ميثيونين أميد (BOC - LM - تواجه المركز) إلى درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. وسوف تتطلب كل خلية تعليق 2mL كاشف الكشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 ٪ لامتصاص العرق (خلايا ثابت) تمييع 4 ٪ محلول المخزون بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. بارافورمالدهيد قسامة 1mL 1 ٪ لكل أنبوب FACS. هناك حاجة إلى ثلاث أنابيب FACS لكل شرط التجريبية (مثلا 32Dkit ، 32Dkit PD150606 + ، + 32Dkit PD98059 حاجة 9 FACS أنابيب) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD150606 (calpain المانع) إعادة PD150606 في DMSO إلى التركيز النهائي لل100mM. حماية هذا الكاشف وجميع الخلايا المعالجة معها بعيدا عن الضوء لمدة من هذه التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD98059 (MEK1 المانع) إعادة PD98059 في DMSO إلى التركيز النهائي لل50mM. </li></ol> تحضير خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا في 32Dkit 5 × 05 حتي 01 أكتوبر × 10 6 خلية لكل مليلتر في OPTI - MEM الإعلام تستكمل مع مصل بقري جنيني من 5 ٪ ، WEHI - 3 طاف كمصدر للIL - 3 (أو أي مصدر آخر لمثل هذه IL - 3 كما البروتين المؤتلف) ، 0.1 ٪ 2 - المركابتويثانول والمضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 12 × 10 6 خلايا 32Dkit في أنابيب فالكون three 15mL (4 × 10 6 خلايا في أنبوب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 15 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح لطاف. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 2mL غرفة درجة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معاملة بعضهم مع التعليق الخلية 50μM PD150606. ضمان حماية العينة من الضوء من خلال تغطية أنبوب فالكون بورق الألمنيوم. دوامة لفترة وجيزة ثم احتضان لمدة عشرين إلى ثلاثين دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج تعليق الخلية الثانية مع 20μM PD98059. لوحة الخلايا في نسيج الثقافة طبق 35mm واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol> Calpain الفحص في خلايا الثابتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن العينات مع PD150606 يحتضنها ، والشروع في مقايسة calpain على عينات غير المعالجة. تبدأ بإضافة 2mL كاشف الكشف لتعليق كل خلية. إضافة 1mL الفور للتعليق خلية / الكشف عن خليط كاشف للأنابيب FACS معدة مسبقا مع بارافورمالدهيد 1 ٪ (0 نقطة زمنية دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الايقاف الخلية مع كاشف الكشف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم يضاف 1mL لتعليق الخلية إلى أنبوب FACS مع 1mL بارافورمالدهيد 1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة احتضان الايقاف الخلية مع خليط الكشف لمدة 5 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة. ثم يضاف 1mL لتعليق الخلية إلى أنبوب FACS مع 1mL بارافورمالدهيد 1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الفحص calpain على الخلايا 32Dkit التي تم التعامل مع مثبطات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في الظلام بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه اليوم التالي الخلايا في 1800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 15 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح لطاف. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 750uL. مكان الخلايا والحفاظ على الجليد في الظلام. </li></ol> الحصول على بيانات عن خلايا الثابتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الخلايا باستخدام الثاني LSR دينار بحريني (العلوم البيولوجية). يتم تعيين المرشحات لXcyte الخفيفه (UV) ليزر ، 355nm خط الإثارة والقوة 25mW الليزر ، والانبعاثات من 405 و 450 نانومتر لالركيزة والمنتج على التوالي. مرشحات تمرير الفرقة لتكون الركيزة والمنتج و405/20 450/50. مرشحات تمريرة طويلة للمنتج هي الركيزة و405 و 450. تم تعيين PMT على الجهد 350-375 325-350 عن الركيزة وللمنتج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء تجربة FACSDiva دينار بحريني مع المعلمات التالية : مبعثر إلى الأمام ؛ مبعثر الجانب ؛ الهندية - 1 أزرق (سجل) ؛ الهندية - 1 فيوليت (سجل). في ورقة العمل إعداد الرسوم البيانية التالية : مبعثر إلى الأمام مقابل مؤامرة مبعثر مع الجانب نقطة بوابة على الخلايا الحية (الشكل 1A) ، الهندية - 1 المدرج الأزرق ، الهندو الرسم البياني 1 بنفسجي ، أزرق الهندية - 1 - 1 مقابل الهندية فيوليت نقطة المؤامرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة الثاني LSR مع AlignFlow AlignFlow زائد والخرز فلوري (Invitrogen). ينبغي تعديل PMT الجهد لوضع الرسم البياني لذروة التألق حبة في نفس القناة قبل كل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستبدأ بالحصول على البيانات باستخدام الخلايا 32Dkit عند النقطة الدقيقة الوقت 0. ضبط الفولتية المعلمة حسب الضرورة. الحصول على وتسجيل 10000 الأحداث في العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار للاستحواذ على كل عينة ، الشطف الجهاز مع نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة بين كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات. يتم تنظيف ضمان LSR الثاني وفقا لمبادئ توجيهية المعهد. </li></ol> Calpain الفحص في الخلايا الحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق الخلية على النحو الوارد أعلاه ، مع عدم وجود PD150606. إحضار عينات الى الثاني LSR واقامة المصافي والمعلمات على النحو الوارد أعلاه. إعداد ورقة العمل على النحو الوارد أعلاه. وتشمل مؤامرة كبيرة تظهر نقطة الهندية - 1 الأزرق مقابل الوقت. وضع برنامج للحصول على الحد الأقصى لعدد الأسطواناتنوفمبر من الأحداث (أي بوابة إيقاف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق 50μM PD150606 خلية واحدة من الخلايا 32Dkit. الحفاظ على عينة في الظلام واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستبدأ بالحصول على بيانات عن التعليق الخلية 32Dkit مع عدم وجود PD150606. استخدام معدل تدفق منخفض من 200-300 الأحداث في الثانية الواحدة. بعد 30 ثانية إلى 1 دقيقة إزالة أنبوب من الجهاز. إضافة 20μM BOC - LM - تواجه المركز للخلايا. دوامة لفترة وجيزة ثم مواصلة الحصول على البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات لمدة 10-20 دقيقة أو حتى الهضاب calpain النشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3 و 4 مع الخلايا 32Dkit تعامل مع PD150606. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات. يتم تنظيف ضمان LSR الثاني وفقا لمبادئ توجيهية المعهد. </li></ol> Calpain الفحص بالسكان في مجمع الخلية (مختلط) * وهذه التجربة في تحديد الخلايا 32Dkit تعليق الخلية التي تحصد من الطحال الماوس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد والطحال من كل الماوس. ليز وخلايا الدم الحمراء مع الكلورين NH 4 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية واحدة في برنامج تلفزيوني 2mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم كل خلية في تعليق اثنين. 1 تعليق علاج الخلية مع 50μM PD150606 لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما على النحو الوارد أعلاه لCalpain الفحص في خلايا الثابتة (الخطوات 1-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح لطاف. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 500μL. نضح لطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في تلطيخ 200μL العازلة مع جيش صرب البوسنة 2 ٪. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة الأولية (FITC مكافحة CD117 الماوس). ينبغي أن تستخدم الأجسام المضادة في التخفيف 1:200 في تلطيخ العازلة. ضمان أن يظل الأضداد في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الضد 200μL الأولية إلى الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى 400μL PBS لزيادة حجم التدفق الخلوي. مكان الخلايا والحفاظ على الجليد في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما كما هو موضح في الحصول على بيانات عن الخلايا الثابتة. إضافة إلى FITC المعلمات وتشمل الرسم البياني للFITC على ورقة العمل. </li></ol> تحليل النتائج والممثل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات باستخدام FlowJo (Treestar). بوابة على الخلايا الحية على أساس التعريف مبعثر إلى الأمام والجانب (الشكل 1A). تحديد مضان يعني الهندية للأزرق من بوابة خلية قابلة للحياة (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أ) بالنسبة للسكان الخلية المختلطة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام FITC مضان على رسوم بيانية ومخططات لتحديد نقطة السكان 32Dkit </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مضان يعني الهندية للأزرق من السكان 32Dkit </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Microsoft Excel إلى الرسم البياني في مضان يعني (الشكل 2A). حساب المنحدر من الخط الفاصل بين 5 و 10 دقيقة. الرسم البياني المنحدر كما رسم بياني شريطي لتحديد النشاط calpain في الخلايا (الشكل 2B). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="الشكل 1أ" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1A"> الشكل 1A. تحديد الخلايا الحية على أساس التعريف مبعثر إلى الأمام والجانب. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="الشكل 1ب" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الرقم 1B"> 1B الرقم. مضان متوسط ​​التغير على مدى 10 دقيقة دوام. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="الشكل 2أ" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2A"> الشكل 2A. الممثل يعني الرسم البياني لمضان. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="الشكل 2ب" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الرقم 2B"> الرقم 2B النشاط Calpain. 32Dkit في الخلايا مع مثبطات.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم تحديد النشاط في الخلايا calpain 32Dkit الثابتة والذين يعيشون في هذا البروتوكول الفيديو. أدت المعاملة من خط الخلية مع مثبط calpain PD150606 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، أدت المعاملة مع مثبط MEK1 PD98059 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. إرك هو المنشط الرئيسي لcalpain - 2 3. هذه النتائج تشير إلى أن calpain - 2 النشاط هو السائد في الخلايا 32Dkit. العمل الحالي في مختبرنا تحقق من عواقب زيادة النشاط calpain ومساهمات calpain - 1 و 2...

<table><tbody><tr><td>محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)
BOC-LM-CMAC
بارافورمالدهيد 4%</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;أذب 4 جم من البارافورمالدهيد في 100 مل من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS). وفي خزانة استخلاص الغازات، سخّن العينة مع التقليب المستمر حتى يصبح المحلول رائقاً.&lt;br/&gt;اتركه ليبرد، ثم خزنْه في درجة حرارة 4 مئوية&amp;#x00B0;سيترات الكربون (C)</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>استخدم PD150606 المُعاد تشكيله حديثاً لتحقيق أقصى تثبيط للكالبين.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أنابيب FACS الخاصة بـ AlignFlow وAlignFlow plus ذات الخرزات الفلورية</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;يُستخدم الطافي الخاص بخلايا WEHI-3 كمصدر لـ IL-3 في هذه التجارب. ويتم معايرة كل مجموعة من طافي WEHI-3 لتحديد التركيز الأمثل المستخدم لنمو خلايا 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

قياس نشاط خلايا في calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains موجودة في كل مكان داخل الخلايا ، والكالسيوم الحساسة ، البروتياز السيستين محايدة<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains تلعب أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك إشارة وإعادة تشكيل هيكل الخلية ، وتنظيم الخلايا الجينات والتعبير وتقدم دورة الخلية<sup&gt; 1</sup&gt;. قد تورطت في الأمراض Calpains ضمور العضلات كثيرة من بينها ، والسرطان والسكري ومرض الزهايمر والتصلب المتعدد<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain تنظيم معقد وغير مفهومة تماما. مرنا والبروتين ربط مستويات ضعيفة للنشاط ، مما يحد من استخدام تقنيات التعبير الجيني أو البروتين لقياس النشاط calpain. تفاصيل هذا البروتوكول فيديو مقايسة تدفق cytometric تطويرها في المختبر لدينا لقياس النشاط calpain في الخلايا الحية والثابتة. يستخدم هذا الأسلوب الركيزة الفلورسنت BOC - LM - تواجه المركز ، الذي هو على وجه التحديد calpain المشقوق ، لقياس النشاط calpain.<sup&gt; 2</sup&gt; في هذا الفيديو ، ويتم قياس النشاط في calpain الثابتة ويعيشون الفئران خلايا اللوكيميا 32Dkit ، وحدها أو كجزء من مجموعة من السكان باستخدام خلية طحالية LSRII دينار بحريني (العلوم البيولوجية). وتظهر الخلايا 32Dkit أن يكون النشاط مرتفعة مقارنة splenocytes العادي.

هذه المادة سوف بالتفصيل بروتوكول لقياس النشاط calpain في الخلايا الحية باستخدام الثابتة والتدفق الخلوي.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

تعد الكالبينينات (Calpains) بروتيازات سيستين محايدة، حساسة للكالسيوم، ومتواجدة في جميع الخلايا 1. وتلعب الكالبينينات أدواراً حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية، ...

تُعد الكالبينين (Calpains) بروتيازات سيستين متعادلة، موجودة في كل مكان داخل الخلايا وحساسة للكالسيوم، وتلعب أدواراً حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك نقل الإشارات، وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي، وتنظيم التعبير الجيني، والموت الخلوي المبرمج، وتقدم الدورة الخلوية. ولقياس نشاط الكالبينين في الخلايا الثابتة والحية، يتم إضافة الركيزة الفلورية BUC$_{L}$MAC. يتم قطع BUC$_{L}$MAC تحديداً بواسطة الكالبينين، مما يؤدي إلى زيادة في الفلورة. ويتم رصد التغير في الفلورة عن طريق قياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، والذي يكشف عن زيادة نشاط الكالبينين في خلايا 30 2D kit مقارنة بالخلايا الطبيعية.مرحباً، أنا كريستينا فار من مختبر الدكتور ستيوارت بيرجر في جامعة تورنتو بقسم المناعة وشبكة الصحة الجامعية. سأوضح لكم اليوم كيفية قياس نشاط calpain في الخلايا المثبتة والحية باستخدام مقايسة تعتمد على قياس التدفق الخلوي. نحن نستخدم هذه المقايسة في مختبرنا لدراسة نشاط calpain في خلايا اللوكيميا والليمفوما.لنبدأ الآن. قبل البدء في التجارب، قم بتحضير الكواشف اللازمة بما في ذلك كاشف الكشف 1% PARAFORM aldehyde ومانع cal pain inhibitor PD 1 50 0 6 0 6، ومانع MEC one inhibitor PD 9 8 0 5 9. للحصول على تفاصيل حول تحضير هذه الكواشف، يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق. أضف 1 mL من para formaldehyde بتركيز 1% إلى كل أنبوب fax.يلزم استخدام ثلاثة أنابيب fax لكل حالة تجريبية للخلايا المثبتة الموضحة في هذا الفيديو. وبما أنه يتم اختبار ثلاث حالات، فإن الحاجة تكون إلى تسعة أنابيب fax. ابدأ بـ 32 خلية dki بكثافة تتراوح من 0.5 إلى 1 × 10 من الخلايا الست لكل مليلتر من الخلايا التي نمت في أوساط مثالية.مُدعّم بمصل جنين البقر وIL-3 والـ tumor capto والإيثانول والمضادات الحيوية. يتم نقل 4 × 10⁶ من الخلايا إلى كل أنبوب من ثلاثة أنابيب فالكون سعة 15 ملليلتر. توضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي ويتم تجميع الخلايا في شكل كتلة راسبة عن طريق الدوران بسرعة 225 Gs لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 15 درجة مئوية.بعد عملية الطرد المركزي، قم بشفط السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 2 mL من PBS بدرجة حرارة الغرفة. عالج أحد معلقات الخلايا بـ 50 µM من مثبط الكالبين PD 150606. تأكد من حماية العينة من الضوء عن طريق تغطية الأنبوب بورق ألومنيوم. قم بالرج باستخدام جهاز Vortex لفترة وجيزة، ثم حضّن العينة لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.قم بمعالجة معلق الخلايا الثاني بـ 20 micromolar من مثبط me one وهو PD 9 0 5 9. وزع الخلايا في طبق زراعة أنسجة بقطر 35 millimeter وحضنها لمدة ساعتين عند 37 degrees Celsius أثناء فترة حضن العينات. ابدأ في إجراء مقايسة Calpain على العينات غير المعالجة.ابدأ بإضافة 2 mL من كاشف الكشف إلى معلق الخلايا. أضف على الفور 1 mL من خليط معلق الخلايا وكاشف الكشف إلى أنابيب fax التي تم تحضيرها مسبقًا لإنشاء عينة الزمن T = 0. قم بحضن معلقات الخلايا مع كاشف الكشف لمدة خمس دقائق.في درجة حرارة الغرفة، أضف واحد ملليلتر من خليط كاشف الكشف عن معلق الخلايا إلى أنبوب fax المُعد مسبقاً والذي يحتوي على واحد ملليلتر من 1%paraform aldehyde لإنتاج عينة T equals five. استمر في تحضين معلقات الخلايا المتبقية مع خليط الكشف لمدة خمس دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة. بعد مرور خمس دقائق، انقل واحد ملليلتر آخر من معلق الخلايا إلى أنبوب fax مُعد يحتوي على واحد ملليلتر من 1%Paraform aldehyde.هذه هي النقطة الزمنية T تساوي 10 دقائق. بعد ذلك، كرر مقايسة cal pain على 30 خلية من مجموعة 2D kit التي عولجت بالمثبطات. قم بتغطية الرف بورق الألمنيوم.ثبت الخلايا طوال الليل في الظلام عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، قم بترسيب الخلايا عن طريق طردها مركزياً عند 725 Gs لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 15 °C. بعد عملية الطرد المركزي، اشفط السائل الطافي ثم أعد تعليق الخلايا في 750 µL من PBS.ضع الخلايا على الثلج واحفظها في الظلام حتى يحين وقت إجراء قياس التدفق الخلوي. يتم هنا عرض عملية اكتساب البيانات للخلايا المثبتة. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي باستخدام جهاز LSR two.اضبط المرشحات لخط إثارة الموجة الضوئية أو إثارة ليزر UV عند 355 nanometers، وقدرة الليزر عند 25 milliwatts، مع انبعاث عند 405 و450 nanometers للمادة الخاضعة والتفاعل الناتج على التوالي. يجب أن تكون مرشحات BAM pass المستخدمة للمادة الخاضعة والنواتج هي 405 over 20 و450. ويجب أن تكون مرشحات longpass للمادة الخاضعة والنواتج 405 و450.اضبط جهد أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) بين 350 و375 للمادة المتفاعلة، وبين 325 و350 للمادة الناتجة. قم بإعداد تجربة BD facs diva وفق المعايير التالية: التشتت الأمامي (Forward scatter)، التشتت الجانبي (side scatter)، وIndo one blue باستخدام مقياس لوغاريتمي، وواحد violet.استخدام مقياس لوغاريتمي أيضاً في ورقة العمل. قم بإعداد الرسوم البيانية التالية: مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي مع تحديد بوابة للخلايا الحية.يتم معايرة جهاز LSR 2 باستخدام خرزات LineFlow وLineFlow Plus الفلورية، وذلك من خلال مدرج تكراري للون Indo 1 blue، ومدرج تكراري للون Indo 1 violet، ومخطط نقطي يقارن بين Indo 1 blue وIndo 1 Violet. يجب ضبط جهد PMT لوضع ذروة المدرج التكراري لفلورية الخرزات في نفس القناة قبل كل تجربة. ابدأ في جمع البيانات باستخدام 30 خلية من مجموعة 2D عند النقطة الزمنية صفر دقيقة.اضبط فولتية المعلمات حسب الضرورة. اجمع وسجل 10,000 حدث لكل عينة. اشطف الجهاز باستخدام fax buffer وكرر عملية الجمع لكل عينة.قم بتصدير البيانات بعد عملية الحصول عليها. تأكد من تنظيف جهاز LSR II وفقاً لإرشادات المعهد. قم بتحضير معلقات الخلايا كما سبق دون إضافة كاشف الكشف أو مثبط calpain.انقل العينات إلى جهاز LSR two وقم بضبط المرشحات والمعايير كما في السابق. قم بإعداد ورقة العمل كما سبق. قم بتضمين مخطط نقطي كبير يوضح العلاقة بين Indo one blue والزمن.اضبط البرنامج لجمع أكبر عدد ممكن من الأحداث. لا تضع بوابة إيقاف. أضف 50 µM من مثبط الكالبين إلى أحد معلقات الخلايا من خلايا مجموعة 32 G.احفظ العينة في الظلام واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة أثناء فترة تحضن الخلايا. ابدأ في جمع البيانات عن معلق الخلايا في طقم 30 2D بدون مثبط cal pain. استخدم معدل تدفق منخفض يتراوح من 200 إلى 300 حدث في الثانية.بعد مرور 30 ثانية إلى دقيقة واحدة، أخرج الأنبوب من الجهاز. أضف 20 micromolar من Bach LMC mac إلى الخلايا. هذا هو كاشف الكشف.يتم شطره تحديدًا بواسطة calpain، ويؤدي هذا الشطر إلى زيادة في فلورة الركيزة؛ قم بالرج الدوامي (vortex)، ثم استمر بإيجاز في جمع البيانات. اجمع البيانات لمدة تتراوح من 10 إلى 20 دقيقة أو حتى تستقر نشاطية calpain.بعد ذلك، كرر عملية الاستحواذ باستخدام 32 خلية gki معالجة بمثبط cal pain. وعند الانتهاء، قم بتصدير البيانات لتحليلها. ابدأ مقايسة الخلايا المختلطة باستخدام معلق خلوي تم تحضيره من طحال فأر.قسّم كل معلق خلوي إلى جزئين. عالج أحد المعلقات الخلوية بـ 50 micromolar من مثبط calpain، ثم غطِّ الأنابيب برقائق الألومنيوم واحضنها لمدة تتراوح بين 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد إجراء مقايسة calpain كما تم وصفه مسبقًا للخلايا المثبتة، غطِّ الأنابيب برقائق الألومنيوم واحضن الخلايا طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في الظلام.في اليوم التالي، يتم إجراء الطرد المركزي عند 725 Gs لمدة خمس دقائق عند 15 درجة مئوية. يتم سحب السائل الطافي، ثم غسل الخلايا في 500 µL من PBS وسحب السائل الطافي مرة أخرى، ثم إعادة تعليق الخلايا في 200 µL من محلول صبغ يحتوي على 2% BSA والتحضين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم تحضير الجسم المضاد الأولي، ZI anti-US.يتم تحضير CD one 17 في محلول صبغ بحيث يكون التخفيف النهائي 1 إلى 200. تأكد من حفظ الأجسام المضادة في الظلام. أضف 200 µL من الجسم المضاد الأولي إلى الخلايا، ثم قم بالتحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.بعد ذلك، أضف 400 µL من PBS لزيادة الحجم من أجل قياس التدفق الخلوي. ضع الخلايا على الثلج واحفظها في الظلام. قم بجمع البيانات باستخدام نفس إجراء قياس التدفق الخلوي الموضح للخلايا المثبتة.أضف ZI إلى المعلمات وأدرج مخططاً تكرارياً لـ ZI في ورقة العمل بعد الحصول على البيانات بواسطة مقياس التدفق الخلوي. قم بالتحليل باستخدام بوابات FlowJo للخلايا الحية بناءً على ملف التشتت الأمامي والجانبي. حدد متوسط الفلورسنت لـ Indo Blue من بوابة الخلايا القابلة للحياة.في هذا المخطط، يشير الخط الأحمر إلى متوسط فلورة الركيزة عند الدقيقة صفر، بينما يشير الخطان الأزرق والأخضر إلى متوسط فلورة الركيزة عند الدقيقتين 5 و10. بالنسبة لمجتمع الخلايا المختلط، استخدم فلورة FXI في المخططات التكرارية والمخططات النقطية لتحديد مجتمع 30 2D kip. حدد متوسط فلورة endo blue لمجتمع 30 2D kip.وأخيرًا، استخدم برنامج Microsoft Excel لتمثيل متوسط الفلورة بيانياً. احسب ميل الخط المستقيم بين الدقيقتين الخامسة والعاشرة. ثم مَثِّل الميل في مخطط شريطي لتحديد نشاط cal pain في الخلايا.تشير البيانات المعروضة هنا إلى أن 30 خلية ثنائية الأبعاد (2D cells) تتميز بمستويات عالية من نشاط cal pain، وأن هذا النشاط يمكن تثبيطه بواسطة مثبطات MEK. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية قياس نشاط cal pain في الخلايا المثبتة والحية. عند تطبيق هذه التقنية، من المهم إعداد جهاز LSR two بشكل صحيح ومعايرة الجهاز باستخدام الخرزات الفلورية.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

يوضح هذا الفيديو تصنيف الخلايا العصبية بالأجسام المضادة لمجمعات السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ، والبروتين المرتبط بالحمض النووي للميتوكوندريا ، وبروتين الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، متبوعا بقياس التدفق الخلوي لتحديد مستوياتها.

قياس معلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا العصبية باستخدام قياس التدفق الخلوي

قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

يصف هذا البروتوكول مقايسة السمية الخلوية الحساسة القائمة على الخلية. من خلال تعداد الانخفاض في تواتر الخلايا التائية CD4 + المستهدفة الحية في وجود عدد متزايد من الخلايا التائية المستجيبة CD8 + ، يسمح هذا الاختبار بالتقييم المباشر للنشاط المحلل للخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد.

مقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا لقياس النشاط السام للخلايا

ويشارك الكالسيوم في العديد من مسارات الإشارات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. تصوير الخلايا الحية يتطلب معدات متخصصة ويمكن أن يكون مضيعة للوقت. تم تحسين A، طريقة بسيطة سريعة باستخدام عداد الكريات تدفق لتحديد التغيرات النسبية في الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية ملتصقة جلبت الى تعليق.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

وغالبا ما يسبب عدم انتظام ضربات القلب ورثت من الطفرات التي تغير تسليم سطح القنوات الأيونية واحد أو أكثر. هنا، علينا أن نكيف التدفق الخلوي المقايسات لتوفير الكمي من إجمالي وسطح الخلية بروتين تعبير نسبي من القنوات الأيونية المؤتلف وأعرب في TSA-201 الخلايا.

تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

قد تورط في التوازن المتقدرية ميتوفاجي، تدهور انتقائية من الميتوكوندريا، وهو رفع الضوابط التنظيمية في مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. ومع ذلك، ملاءمة الأساليب التجريبية لقياس النشاط ميتوفاجي محدودة للغاية. هنا، نحن نقدم مقايسة حساسة لقياس نشاط ميتوفاجي باستخدام التدفق الخلوي.

قياس ميتوفاجي الحساسة بالتدفق الخلوي استخدام تعتمد على درجة الحموضة "مراسل الفلورسنت" طن متري-كيما

مطلوب للحفاظ على التوازن افيروسيتوسيس، إزالة متجولة للخلايا أبوبتوتيك، ويسر مستقبلات ومسارات الإشارات التي تسمح للاعتراف، والإحاطة، واستيعاب الخلايا أبوبتوتيك. وهنا، نقدم بروتوكول الفحص المجهري الأسفار لتقدير افيروسيتوسيس ونشاط مسارات إشارات افيروسيتيك.

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

توفير حساسية خلية واحدة، قياس التدفق في الوقت الحقيقي مناسبة فريدة لتحديد وظائف مستقبلات المتعدد الثقافات الحية. باستخدام خلايا السلف العصبية الكبار، تم تقييم وظيفة مستقبلات P2X7 عن طريق تدفق الكالسيوم الكشف عنها بواسطة الكالسيوم مؤشر صبغ، تشكيل المسام transmembrane اثيديوم بروميد امتصاص، واستخدام الخرز مطاط الفلورسنت البلعمه.

في الوقت الحقيقي يعيش خلية تدفق الخلوي للتحقيق في تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام والبلعمه من مستقبلات P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار

هنا ، نصف مجموعة من الطرق لتوصيف تفاعل البروتينات مع أغشية الخلايا أو الحويصلات الدقيقة.

تحليل تفاعل البروتينات ذات العلامات الفلورية مع الحويصلات الدقيقة الفوسفاتية الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي

يصف البروتوكول الحالي طريقتين لقياس نشاط الكاسباس من خلال ركيزة فلورية باستخدام قياس التدفق الخلوي أو مقياس الطيف الفلوري.

قياس نشاط كاسباز باستخدام مقايسة الفلورومترية أو قياس التدفق الخلوي

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد البقاء على قيد الحياة بعد الإجهاد في عينات الخميرة. يستخدم الاختبار صبغتين فلوريتين ، SYTO 9 ويوديد البروبيديوم (PI) ، لتحديد سلامة غشاء البلازما. يستخدم قياس التدفق الخلوي لتوفير تقديرات كمية وقابلة للتكرار لكسور الخلايا الحية والميتة والتالفة لعينات ما بعد الإجهاد التأكسدي.

مقايسة LIVE / DEAD محسنة إلى جانب قياس التدفق الخلوي لقياس البقاء على قيد الحياة بعد الإجهاد في خلايا الخميرة

تعلم قياس نشاط الكالباين في الخلايا الثابتة والحية باستخدام التدفق الخلوي. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة دور البروتياز في أمراض الدم والأورام.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات