Dechorionation الجنين الميداكا وزرع الخلايا لتوليد الوهم

وتشارك أكثر بسبب المشيماء الثابت والأجنة لينة ، والتلاعب في الأجنة في الميداكا من الزرد. هذا الفيديو يظهر خطوة بخطوة إجراءات لكيفية التعامل مع الأجنة الميداكا ، بما في ذلك dechorionation ، agarose المتصاعد في التصوير وزرع الخلايا لانتاج الوهم. هذه الإجراءات ضرورية لاستخدام الميداكا والزرد في مختبر للاستفادة الكاملة من ميزات التكامل بينهما للتشريح وظائف الجينوم الوراثي للالفقاريات.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج نسخ في الجنين لغرض فحص استقلالية الجين أو البروتين ذي الأهمية. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات على أجنة المتبرعين باستخدام رود دومين ديكستران عن طريق الحقن المجهري في مرحلة الخلية الواحدة كما هو موضح في رفيق هذا الفيديو ، الحقن المجهري لأجنة ماكا. الخطوة الثانية من الإجراء هي تطوير كل من الأجنة المانحة والمتلقية إلى المرحلة الصحيحة.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي طلاء كل من أجنة المتبرع والمتلقي. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي زرع الخلايا من أجنة المتبرع المصنفة إلى أجنة المتلقي. في النهاية ، يمكن الحصول على النتائج من خلال تحليل توزيع وتكاثر وتمايز المستنسخة للخلايا المزروعة من خلال الكشف عن الخلايا المزروعة عن طريق متتبعات التألق أو النسب.

مرحبا ، أنا شون برازينسكي من مختبر الدكتور ماكوتو فكي في قسم الأحياء والكيمياء الحيوية بجامعة باث. أنا أيضا من مختبر زيكي. سنعرض لك اليوم إجراء لزرع الخلايا في أجنة الأسماك الداكنة.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للدراسة باستخدام جين أو طفرة ذات أهمية ، لها وظيفة مستقلة للخلية أو غير الخلية. لذلك دعونا نبدأ. عند طلاء بيض الماكا ، استخدم محاليل وأدوات معقمة لتعزيز نجاح المراقبة والثقافة على المدى الطويل.

ضع قطعة من ورق الصنفرة المقاوم للماء P 2000 في غطاء طبق بتري غير ملتصق بطول تسعة سنتيمترات. استخدم فما واسعا لإشعال ماصة المعكرونة المصقولة لنقل ما يصل إلى 10 بيضات طازجة غير مجعدة ومنظفة وملصقة من طبق من البيض. متوسطة إلى ورق الصنفرة.

قم بإزالة الوسط الزائد ، واترك ما يكفي في الطبق لمنع البيض من الجفاف. استخدم طرف إصبع مرتديا قفازا للف 10 بيضات برفق في المرة الواحدة فوق ورق الصنفرة لمدة 45 إلى 60 ثانية. لإزالة شعر السطح الخارجي وتسجيل سطح كوريان ، ضع ضغطا بسيطا وحافظ على طرف الإصبع موازيا لورق الصنفرة.

انقل البيض إلى الطبق الأصلي المتوسط. قم بإزالة الوسط ، وقم بتغطية البيض بمحلول 20 ملليغرام لكل مليلتر من البرون. غطي الطبق واحتضنه على حرارة 27 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

تأكد من وضع الطبق بزاوية بحيث يتم غمر الأجنة بشكل كاف في الإنزيم. لتقليل الإنزيم المطلوب ، استخدم ماصة نقل البلاستيك لاستعادة البروناز لإعادة استخدامه ووضعها على الجليد. اغسل البيض خمس مرات في وسط الجنين لإزالة جميع آثار التعرض لمنعه من هضم إنزيم الفقس.

أضف ما يكفي من إنزيم الفقس لتغطية البيض المغسول. تأكد من بقاء البيض في طبقة واحدة في قاع الطبق لتجنب السحق أثناء ذوبان الكوريان. احتضن البيض على حرارة 27 درجة مئوية.

تأكد من وضع الطبق بزاوية بحيث يتم غمر الأجنة بشكل كاف في الإنزيم. من أجل تقليل الإنزيم المطلوب تحقق من التقدم تحت مجهر استريو تشريح ، ستظهر ثقوب متشابهة في الطبقة الداخلية من كوريان قبل أن يذوب تماما. قد تستغرق العملية ما يصل إلى 60 دقيقة حسب نشاط الإنزيم.

عندما يذوب جزء صغير من الكوريان ، امتص البويضة الفردية على الفور بماصة لتجنب هضم الجنين بواسطة إنزيم الفقس. انقله إلى طبق نظيف من BSS مرة واحدة عن طريق لمس طرف الماصة برفق إلى طبق نظيف من BSS مرة واحدة وترك البيضة تتدحرج لتقليل إنزيم الفقس المنقول. استخدم الملقط لإزالة باقي الكوري عندما يتم نقل جميع البيض من إنزيم الفقس.

قم بإجراء نقل نهائي إلى طبق جديد من مرة واحدة BBSS. أضف المضادات الحيوية إذا كان سيتم إحضار الأجنة إلى مرحلة لاحقة من التطور الجنيني بعد زخرفة هذا الإجراء ، ابدأ مرحلة طلاء Dec 12 الأجنة قبل 1.5 ساعة من الزرع. استخدم طرف ماصة لإضافة كمية صغيرة من 3٪ ميثيل السليلوز إلى وسط مجهر التجويف.

انزلق في طبق بتري طوله تسعة سنتيمترات. انشر السائل بشكل رقيق على سطح الاكتئاب. جفف ميثيل السليلوز لمدة دقيقتين.

املأ المنخفض المنزلق ب 350 ميكرولتر من المعقم مرة واحدة BSS تحت مجهر تشريح. استخدم ماصة زجاجية مصقولة واسعة الفم لنقل متبرع واحد وما يصل إلى أربعة أجنة متلقية إلى الشريحة. استخدم حلقة شعر لتوجيه الأجنة بحيث يكون الجلد الناسف متجها لأعلى.

اتكئ الأجنة على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار إذا لزم الأمر. أدخل إبرة دقيقة برفق في مكبر المتبرع. ديرم. امتصاص ببطء من 10 إلى 20 خلية.

الآن أدخل الإبرة برفق في المنطقة ذات الصلة من الجلد المتلقي لمكبر الجنين ، وطرد الخلايا المانحة ببطء. لا تزعج حدود كيس التشيلو. املأ طبق بتري بعناية بحوالي 30 مل من المعقمة مرة واحدة BSS لغمر الأجنة وتخفيف الأجنة من ميثيل السليلوز.

تصب على جانب الطبق حتى لا تعطل الأجنة. أضف 100 ميكرولتر من البنسلين ستربتومايسين إلى الطبق بتركيز تقريبي قدره 0.3٪ قم بتغطية الطبق. راقب الأجنة بشكل دوري حسب الضرورة.

لدراسات التصوير الأطول مثل الفاصل الزمني والملاحظات التفصيلية ، قم بتضمين الأجنة المغلفة الحية في مخدر الأجنة الحية لمنع الحركة عن طريق إضافة مخدر مناسب للمرحلة إلى الوسط الذي يحتوي على الأجنة يذوب ما يقرب من ملليلتر واحد من 3٪ نشأت نقطة انصهار منخفضة في مرة واحدة BSS والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. إذا لزم الأمر ، أضف كمية مناسبة من المخدر إلى الوخزف لمنع الوخز من العمل بسرعة لمنع التصلب ، استخدم ماصة المعكرونة ذات الفم الواسع لملء الغطاء. انخفاض أنبوب الطرد المركزي الصغير مع aros.

استخدم ماصة واسعة الفم لنقل جنين مغلف ومخدر إلى الغطاء الموجود في الغطاء. نقل أقل قدر ممكن من الوسط مع الجنين. قم بتحديث الأروس والجنين على الفور وانقلهما إلى طبق بتري زجاجي بحجم 3.5 سم.

انقل الطبق إلى طبق 14 سم مملوء بثلث الطريق بمزيج من الثلج والماء. أمسك الطبق الأصغر بإحكام إلى قاع الطبق الأكبر تحت مجهر ستيريو تشريح. استخدم حلقة شعر لتوجيه الجنين بسرعة حسب الرغبة.

امسك الجنين ثابتا حتى يتجمد الزرع. يمكن الآن تصوير الجنين. تظهر الصورة أ جنينا متبرعا ومتلقيا بعد الزرع مباشرة.

يظهر الجنين المتبرع على اليمين مع جلد جبس أحمر بالكامل. يظهر الجنين المتلقي على اليسار ويمكن التعرف عليه بسهولة من خلال الكتلة الصغيرة من الخلايا الحمراء المزروعة المرئية في صورة الجلد الناسف B تظهر جنينين متلقيين بعد سبع ساعات تقريبا من الزرع. لاحظ أن الخلايا المزروعة قد هاجرت من موقع الزرع وهي الآن منتشرة عبر الناسف.

تظهر صورة الأدمة C جنين المتلقي في المرحلة 29. لاحظ التصبغ في العين ووجود mefor في منطقة الجذع والدماغ. يمكن رؤية الخلايا المسماة بقضيب دومين على أنها تستعمر العديد من الهياكل الجنينية في الإشارة إلى الإنتاج الناجح للوهم.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية تناول أجنة أسماك الميكا وتنفيذها في مرحلة جنينية مبكرة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر زرع خلايا المتبرع في المنطقة الصحيحة من المتلقي الذي تم تفجيره. سيسمح ذلك للخلايا المانحة بالتمايز إلى نوع الخلية الصحيح.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.