تقييم وظيفة القلب وعلم الطاقة في قلوب معزولة عن طريق الماوس 31 P الرنين المغناطيسي الطيفي
August 31st, 2010
Langendorff وضع التروية القلبية معزولة ، بالاشتراك مع 31 P الرنين المغناطيسي الطيفي ، يجمع بين مجالات الكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في تجربة واحدة. ويسمح البروتوكول لقياس ديناميكية عالية الطاقة محتوى الفوسفات ودوران في القلب في حين رصد في الوقت نفسه وظيفة فيزيولوجية. عندما يقوم بشكل صحيح ، وهذا هو أسلوب قيمة في تقييم علم الطاقة القلبية.
الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة وظائف القلب والطاقة في قلب فأر معزول. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحريك قلب الفأر في وضع LOR. باستخدام المخزن المؤقت اليدوي لاختيار كريبس المخصب بالغلوكوز والبيروفات كخطوة ثانية ، يتم إدخال بالون مملوء بالماء في البطين الأيسر أو lv ، مما يسمح بالمراقبة المستمرة لوظائف القلب أثناء التجربة.
بعد ذلك ، يتم وضع القلب في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 10 ملم وإدخاله في المغناطيس من أجل تقييم طاقة القلب من خلال مراقبة رنين فوسفات الكرياتين الفوسفو ل TP وتم الحصول على نتائج الفوسفات غير العضوي التي تظهر وظائف القلب والطاقة بناء على موجات ضغط الجهد المنخفض و P 31 والتحليل الطيفي الكتلي p. مرحبا، أنا ستيف كيتز من مركز التمثيل الغذائي للكادر في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا في قسم التخدير بجامعة واشنطن. سأريكم اليوم إجراء لتروية القلب المعزولة جنبا إلى جنب مع 31 التحليل الطيفي PNMR.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتقييم وظائف القلب والطاقة في نماذج الفئران المعدلة بيولوجيا. لذلك دعونا نبدأ. لبدء هذا البروتوكول ، قم بإعداد لتر واحد من kres ، ومن ثم الضوء أو المخزن المؤقت KH.
أدخل 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 95٪ فقاعات أكسجين في الخليط لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم أضف اثنين من كلوريد الكالسيوم المليمولي ، متبوعا بالركائز ، 10 ملليمولار جلوكوز و 0.5 مللي مولار بيروفات. في هذه التجارب ، يتم استخدام نظامين منفصلين في وقت واحد لكل اقتناء أطياف P 31.
يتم ربط مغناطيس BRUER 14 T بوحدة التحكم الثلاثة المتقدمة وجهاز كمبيوتر مجهز ببرنامج Top Spin V 2.1 لتقييم وظائف القلب. يتم ربط نظام نضح القلب المصمم خصيصا بمختبر الطاقة. أربعة 30 طلب بيانات.
مجهزة بمخطط المختبر PRO ستة برامج لتحليل البيانات. يشتمل جهاز نضح القلب على مضخة تمعجية ثلاثية النبضات صغيرة يتم التحكم فيها بواسطة وحدة تحكم في مضخة STH تستخدم لنشر المخزن المؤقت KH في تنظيم درجة حرارة القلب أثناء تجربة الرنين المغناطيسي النووي أمر بالغ الأهمية. تستخدم أجهزة الدوران الساخنة للحفاظ على درجة الحرارة بين 37.0 إلى 37.5 درجة مئوية أثناء وجود القلب داخل المغناطيس ويتم مراقبة درجة الحرارة طوال مدة التجربة باستخدام مسبار درجة حرارة الألياف البصرية.
طوال التجربة ، تتم مراقبة ضغط الجهد المنخفض وضغط التروية عبر محولات الضغط المرفقة بنظام الحصول على البيانات وعرضها باستخدام البرنامج المرفق. يتم استخدام محول طاقة فسيولوجي لمراقبة ضغط الجهد المنخفض ويستخدم محول ضغط الدم القابل للتصرف لمراقبة ضغط التروية. أخيرا ، يتم استخدام الحبل السري لتزويد القلب بالمخزن المؤقت المؤكسج الساخن.
بمجرد دخولك إلى المغناطيس ، قبل بدء التجربة ، قم بمعايرة محولات الضغط باستخدام مقياس ضغط عزم الشكل القياسي في المقام الأول ، بدون ضغط في محول الطاقة ، لصفر المعايرة. ثم قم بتضخيم مقياس ضغط وضع التين هذا إلى ضغط أعلى. أدخل هذه القيمة في برنامج الكمبيوتر.
ثم تأكد من أن محولات الضغط قد تمت معايرتها بشكل كاف عن طريق تضخيم مقياس ضغط عزم التين هذا إلى الضغوط المعروفة والتحقق منها على شاشة الكمبيوتر. بمجرد معايرة محولات الضغط ، قم بمعايرة مسبار الرنين المغناطيسي النووي باستخدام أنبوب رنين مغناطيسي 10 ملم يحتوي على عينة قياسية من فوسفات الصوديوم 150 ملليمول. قم بإجراء المعايرة باستخدام برنامج الدوران العلوي.
أولا ، قم بضبط العينة لضبط تردد رنين الفوسفور. ثم قم بتقطيع العينة لإنشاء مجال مغناطيسي متجانس. تسهل هذه المعايرة الأولية الإشارة وتقلل من الوقت اللازم لبدء فترة الاستحواذ.
بمجرد وضع القلب داخل المسبار لبدء استخراج قلب الفأر ، حقن الفأر ب 200 وحدة من الهيبارين داخل الصفاق لتقليل التخثر. بعد خمس دقائق، قم بتطبيق 175 ملليغرام لكل كيلوغرام من الصوديوم خماسي باربيتال داخل الصفاق. بمجرد تخدير الفأر ، ضعه على ظهره وقم بلصق الذراعين والساقين لكشف منطقة الصدر.
قم بإجراء قرصة إصبع القدم للتأكد من تخدير الماوس بالكامل. قص. افتح التجويف البريتوني والصدر بالمقص واستخدم الملقط لتقشير القفص الصدري وفضح التجويف الصدري بالملقط. تمسك بأنسجة الرئة وارفع القلب برفق باستخدام مقص منحني.
اقطع الأوعية الكبيرة خلف القلب واستمر ببطء نحو رأس الفأر حتى يتحرر القلب. قبض على القلب على الفور في عازلة KH الباردة المثلجة. حافظ على الأعضاء على الجليد وقم بإزالة الرئتين بسرعة.
حدد فصوص الغدة الصعترية وقشرها برفق لكشف الشريان الأورطي. ثم قم بإزالة الغدة الصعترية. أخيرا ، اعزل الشريان الأورطي عن طريق إزالة أي أنسجة محيطة بعناية.
باستخدام ملقط خياطة دقيقة ، أمسك بشكل عام كلا جداري الشريان الأورطي لكشف التجويف. ثم ضع الشريان الأورطي بحذر على القنية. مصنوعة من أنابيب البولي إيثيلين ذات القطر الخارجي 0.965 ملم.
أمسك الشريان الأورطي في مكانه باستخدام مشبك أوعية صغيرة وربط الغرز بسرعة حول الشريان الأورطي. بمجرد ربط الغرز ، قم بإزالة المشبك. استخدم الملقط للتحقق بعناية من أن القنية فوق جذر الأبهر.
أضف أي روابط إضافية ضرورية لتثبيت القلب في مكانه. قم بإزالة أي أنسجة إضافية باستخدام الملقط والمقص الدقيق. ثم قم بعمل شق صغير في أوراكل الأيسر.
أمسك القلب برفق وأدخل بعناية 0.61 ملم من البولي إيثيلين من خلال الأذين الأيسر وتجويف البطين الأيسر وخارجها من خلال القمة. تقليم الأنابيب الزائدة. بعد ذلك ، أدخل بالونا مملوءا بالماء من الهواء من خلال الأذين إلى البطين الأيسر.
امسك البالون في مكانه باستخدام شريط لاصق. ثم قم بزيادة سرعة المضخة التمعجية تدريجيا لتوفير تدفق كاف للقلب. استمر في تقوية القلب باستخدام محلول KH باستخدام تدفق ثابت يعادل حوالي ملليلترين في الدقيقة حتى يتم وضع القلب في مسبار الرنين المغناطيسي النووي.
قم بنفخ بالون الجهد المنخفض بحجم صغير باستخدام حقنة ميكرومتر للتحقق من أن محول ضغط الجهد المنخفض يعمل للتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. أولا ، أدخل القلب بعناية في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 10 ملم. يتم وضع دوار خنزير عريض حول أنبوب الرنين المغناطيسي النووي للمساعدة في توجيه الأنبوب إلى الموضع الصحيح.
داخل المسبار ، قم بإبطال الجهاز بأكمله بالحبل السري بشريط لاصق. بعد ذلك ، قم بخفض الحبل السري ببطء في التجويف العلوي للمغناطيس حتى يصبح أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الذي يحتوي على القلب داخل ملف مسبار الرنين المغناطيسي النووي 10 ملم. بمجرد أن يصبح القلب في الموضع المناسب داخل المسبار ، اضبط تدفق المضخة الطفيلية من أجل تحقيق ضغط نضح يبلغ 80 ملم من الزئبق.
حافظ على ضغط التروية عن طريق تمكين آلية التثبيت على وحدة التحكم في المضخة. السماح بفترة توازن للقلب من 15 إلى 20 دقيقة. خلال فترة التوازن ، اضبط حجم بالون الجهد المنخفض لتحقيق ضغط انبساطي نهائي من ثمانية إلى 10 ملليمترات من الزئبق.
ثم قم بتحسين معلمات مقياس الطيف من أجل الحصول على أفضل إشارة فوسفورية ممكنة. قم بضبط أداة الرنين المغناطيسي النووي عن طريق ضبط نبضة الراديو، بحيث يكون التردد الذي يتردد به صدى نواة الفوسفور. ثم قم بتقطيع العينة لجعل المجال المغناطيسي متجانسا بعد فترة التوازن.
ابدأ الاستحواذ على العديد من P 31 NMR Spectra. تعتمد فترة الاقتناء لكل طيف على شدة مجال المغناطيس وحجم العينة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء المطلوبة لتجربة معينة. هنا يتم الحصول على الأطياف باستخدام مغناطيس 14 تسلا عن طريق حساب متوسط الإشارة التي تم الحصول عليها من 256 نبضة تردد لاسلكي بمقدار 20 ميكروثانية بزاوية قلب 60 درجة وتأخيرات قدرها 2.0 ثانية.
ستتطلب هذه التجربة حوالي 10 دقائق. مقياس نموذجي لوظيفة القلب ، يتم الحصول على الضغط المطور LV عن طريق طرح الضغط الانبساطي النهائي أو EDP من الضغط الانقباضي. في الفأر العادي C 57 الأسود ستة ، يتراوح ضغط القلب LV عادة بين 100 إلى 110 ملليمترات من الزئبق عند ضغط انبساطي ثابت من ثمانية إلى 10 ملليمترات من الزئبق.
تظهر منحنيات التصميم التمثيلية من الفئران ذات النطاقات الأبهرية والتحكم والأبهر. يتم تمثيل الوظيفة الانقباضية من خلال الضغط المطور LV على زيادة أحجام الجهد المنخفض كما هو محدد من خلال حجم بالون الجهد المنخفض. يتم تمثيل الوظيفة الانبساطي بواسطة EDP على زيادة أحجام الجهد المنخفض.
توفر أطياف P 31 NMR لقلب فأر معزول إشارات PHOSPHOCREATINE أو PCR ، والفوسفات الثلاثة من TP والفوسفات غير العضوي أو pi. هنا ، ذروة PI صغيرة نسبيا. هذا نموذجي للقلب الغزير الهوائية المزود بالبيروفات أو الأحماض الدهنية.
بالإضافة إلى الجلوكوز خلال فترات نقص التروية ، تزداد هذه الذروة بينما تنخفض ذروة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لقد أوضحت لك للتو كيفية تحضير قلب الفأر للتروية بحيث يمكن قياس كل من وظائف القلب والطاقة في وقت واحد أثناء التجربة. من المهم التأكد من أن القلب متدفق بشكل كاف.
خلاف ذلك ، لن تكون بيانات الرنين المغناطيسي النووي الخاصة بك موثوقة. هذا كل شيء. شكرا لك ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
نظرة عامة
توضح هذه المقالة بروتوكولًا لتحضير القلب المعزول في وضع Langendorff مع طيفه الكيميائي المغناطيسي النووي 31P، مما يمكّن من القياس الديناميكي للطاقة القلبية. تسمح الطريقة بالمراقبة المتزامنة لمحتوى الفوسفات عالي الطاقة والوظيفة القلبية في قلب فأر معزول.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- فيزيولوجيا القلب
- الكيمياء الحيوية
- الطيفي الكيميائي المغناطيسي النووي
الخلفية
- تعد تقنية Langendorff من التقنيات المستخدمة لدراسة وظيفة القلب.
- يوفر الطيفي الكيميائي المغناطيسي النووي 31P رؤى حول التمثيل الغذائي للطاقة في الأنسجة القلبية.
- تسمح هذه الطريقة بالتقييم في الوقت الحقيقي للطاقة القلبية.
- فهم الطاقة القلبية أمر حاسم لتقييم صحة القلب ومرضه.
هدف الدراسة
- لمراقبة الوظيفة القلبية والطاقة في قلب فأر معزول.
- لتقييم تأثير مختلف الركائز على الأداء القلبي.
- لتطوير بروتوكول موثوق به لدراسات الطاقة القلبية في المستقبل.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول Krebs-Henseleit مع الجلوكوز والبيروفات.
- إدخال بالون مملوء بالماء في البطين الأيسر لمراقبة الضغط.
- استخدام أنبوب NMR بحجم 10 مم لتقييم الطاقة القلبية.
- معايرة أجهزة استشعار الضغط ومسابر NMR لإجراء قياسات دقيقة.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح والتروية للقلب الفأري.
- مراقبة الضغط البطين الأيسر وضغط التروية في الوقت الحقيقي.
- قياس ديناميكي للفوسفات عالي الطاقة أثناء التجربة.
- رؤى حول العلاقة بين توافر الركيزة والوظيفة القلبية.
الاستنتاجات
- يجمع البروتوكول بشكل فعال بين التقييمات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية.
- يوفر أداة قيّمة لدراسة الطاقة القلبية في بيئة البحث.
- يمكن للدراسات المستقبلية أن تعتمد على هذه المنهجية لاستكشاف صحة القلب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts, providing a physiologically relevant system for evaluating molecular modifications in cardiovascular disease models. By integrating Langendorff perfusion with 31P NMR spectroscopy, researchers can obtain real-time, quantitative readouts of high-energy phosphate metabolites alongside hemodynamic parameters, supporting mechanistic de-risking in target validation and preclinical screening workflows. The approach enhances predictive confidence by linking molecular alterations to functional and metabolic phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring how genetic or pharmacological interventions affect cardiac energetics and function in intact, beating hearts.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous monitoring of LV developed pressure and phosphocreatine/ATP levels under physiological or pathologic stress.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds or genetic modifications that preserve energetic homeostasis during ischemia/reperfusion or high-workload challenges.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline cardiac function and metabolite levels in a reproducible, Langendorff-perfused format.
- Quantitative Outputs: Generates simultaneous, real-time measurements of hemodynamic function (LV pressure) and biochemical energetics (PCr, ATP, Pi) for multi-parametric assay development.
- Scalability & Reuse: The isolated heart platform can be adapted across disease models (e.g., aortic banding, transgenic models) to enable consistent, cross-project evaluation of cardiac safety and efficacy signals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly assesses the functional and energetic significance of molecular modifications in transgenic models of cardiac pathology, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical evaluation by providing a quantitative, physiologically anchored readout of cardiac health.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by detecting early energetic dysfunction that may predict late-stage clinical failure in cardiovascular programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical assessment, offering a reusable platform for evaluating cardiac liability and target engagement in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in cardiac energetics and contractile function.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through controlled perfusion conditions, real-time pressure monitoring, and consistent NMR spectral acquisition.
- Analytics: Delivers quantitative, multi-parametric readouts (LV developed pressure, end-diastolic pressure, PCr/ATP ratios, Pi shifts) that allow objective comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by maintaining physiological relevance while enabling biochemical interrogation of metabolic pathways in intact hearts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, cross-functional capability applicable to cardiovascular, metabolic, and mitochondrial toxicity programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating molecular changes with direct measurements of cardiac function and high-energy phosphate metabolism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized buffer preparation, temperature control, pressure transducer calibration, and NMR shimming procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic or metabolically disruptive compounds early, reducing late-stage attrition in cardiovascular drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets and leads by providing early insight into energetic reserve and stress resilience in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in isolated heart perfusion, NMR spectroscopy, and pressure transducer calibration.
- Dependent on access to high-field NMR spectrometers (e.g., 14T) and specialized perfusion hardware compatible with magnet bore constraints.
- Necessitates cross-team standardization between physiology, pharmacology, and NMR analytics teams for consistent data acquisition and interpretation.
- Adaptation considerations include model-specific adjustments to perfusion pressure, balloon volume, and substrate composition based on disease phenotype or genetic background.
- Practical limitations include signal-to-noise constraints in low-abundance metabolite detection and the need for rigorous exclusion of ischemic artifacts during setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![التحقيق في استقلاب القلب في قلب الفأر المعزول مع التحليل الطيفي للتصوير بالرنين المغناطيسي النووي [1-13 C] و 13C / 31P NMR](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A46%253A50.867Z&w=384&q=75)
