تقييم وظيفة القلب وعلم الطاقة في قلوب معزولة عن طريق الماوس ³¹ P الرنين المغناطيسي الطيفي

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة الوظيفة القلبية وطاقة القلب في قلب فأر معزول ومعطر. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تروية قلب الفأر في وضع LOR. وبكاستخدام محلول Krebs المنظم المختار والمعزز بالجلوكوز والبيروفات كخطوة ثانية، يتم إدخال بالون مملوء بالماء في البطين الأيسر أو lv، مما يسمح بالمراقبة المستمرة للوظيفة القلبية أثناء التجربة.

بعد ذلك، يوضع القلب في أنبوب NMR سعة 10 مليمتر ويتم إدخاله في المغناطيس من أجل تقييم طاقة القلب عبر مراقبة رنينات فوسفات الفوسفوكرياتين وATP، وتم الحصول على نتائج الفوسفات غير العضوي التي توضح وظيفة القلب وطاقته بناءً على موجات ضغط LV وP 31 وكتلة طيف p. مرحباً، أنا ستيف كيتز من مركز MIT Cadre Metabolism في قسم التخدير بجامعة واشنطن. اليوم سأعرض لكم إجراءً لتروية القلب المعزول مقترناً بتقنية 31 PNMR spectroscopy.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لتقييم وظائف القلب وطاقته في نماذج الفئران المهندسة حيويًا. لذا، لنبدأ العمل. لبدء هذا البروتوكول، قم بتحضير لتر واحد من محلول كريس-هينسلايت (Kres-Henseleit) أو محلول KH المنظم.

قم بإدخال فقاعات من 5% ثاني أكسيد الكربون و95% أكسجين إلى الخليط لمدة تتراوح من 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، أضف كلوريد الكالسيوم بتركيز 2 millimolar، تليها الركائز: جلوكوز بتركيز 10 millimolar وبيروفات بتركيز 0.5 millimolar. في هذه التجارب، يتم استخدام نظامين منفصلين في آن واحد لكل عملية استحصال لأطياف P 31.

يتم ربط مغناطيس BRUER 14 T بوحدة تحكم متقدمة ثلاثية وبجهاز كمبيوتر مجهز ببرنامج top spin V 2.1 لتقييم وظيفة القلب. كما يتم ربط نظام تروية قلب مصمم خصيصًا بجهاز power lab. أربعة 30 طلب بيانات.

مجهزة ببرنامج lab chart PRO six لتحليل البيانات. يتضمن جهاز تروية القلب مضخة تمعجية mini pulse three يتم التحكم فيها بواسطة وحدة تحكم بالمضخة STH تُستخدم لتروية منظم KH في القلب. يعد تنظيم درجة الحرارة أثناء تجربة NMR أمراً بالغ الأهمية؛ لذا تُستخدم دوارات حرارية للحفاظ على درجة الحرارة بين 37.0 إلى 37.5 درجة Celsius بينما يكون القلب داخل المغناطيس، ويتم مراقبة درجة الحرارة طوال مدة التجربة باستخدام مسبار درجة حرارة من الألياف الضوئية.

خلال التجربة، يتم مراقبة ضغط البطين الأيسر (LV) وضغط التروية عبر محولات ضغط متصلة بنظام تجميع البيانات ويتم عرض النتائج باستخدام البرنامج المرفق. يُستخدم محول فسيولوجي لمراقبة ضغط البطين الأيسر (LV)، بينما يُستخدم محول ضغط دم مخصص للاستخدام مرة واحدة لمراقبة ضغط التروية. وأخيرًا، يُستخدم حبِل سري لتزويد القلب بالمحلول المنظم المؤكسج والمسخن.

بمجرد وضع العينة داخل المغناطيس، وقبل بدء التجربة، قم بمعايرة محولات ضغط القياس باستخدام مقياس الضغط القياسي؛ أولاً، لا تضع أي ضغط في محول القياس لتصفير المعايرة. بعد ذلك، قم بنفخ مقياس الضغط هذا للوصول إلى ضغط أعلى، ثم أدخل هذه القيمة في برنامج الكمبيوتر.

ثم تأكد من معايرة محولات ضغط القياس بشكل كافٍ عن طريق نفخ مقياس الضغط هذا إلى ضغوط معلومة والتحقق منها على شاشة الكمبيوتر. وبمجرد معايرة محولات ضغط القياس، قم بمعايرة مسبار NMR باستخدام أنبوب NMR بسعة 10 مليمتر يحتوي على عينة قياسية من فوسفات الصوديوم بتركيز 150 ملي مولار. نَفذ عملية المعايرة باستخدام برنامج TopSpin.

أولاً، قم بضبط العينة لتحديد تردد رنين الفوسفور. ثم قم بعملية التشميم (shim) للعينة لإنشاء مجال مغناطيسي متجانس. تسهل هذه المعايرة الأولية الإشارة وتقلل الوقت اللازم لبدء فترة الحصول على البيانات.

بمجرد وضع القلب داخل المسبار لبدء عملية استخراج قلب الفأر، احقن الفأر بـ 200 وحدة من الهيبارين داخل الصفاق لتقليل التخثر. بعد خمس دقائق، أعطِ 175 ملليغرام لكل كيلوغرام من بنثوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق. وبمجرد تخدير الفأر، ضعه على ظهره وثبت الذراعين والساقين بالشريط اللاصق لكشف منطقة الصدر.

أجرِ اختبار قرص إصبع القدم للتأكد من تخدير الفأر بشكل كامل. قم بالقطع، ثم افتح التجويف البريتوني والصدر باستخدام المقص، واستخدم الملاقط لإرجاع القفص الصدري وكشف التجويف الصدري. أمسك بأنسجة الرئة وارفع القلب برفق باستخدام مقص منحني.

اقطع الأوعية الدموية الكبيرة خلف القلب واستمر ببطء باتجاه رأس الفأر حتى يتحرر القلب. قم بإيقاف ضربات القلب فوراً في محلول KH المنظم المبرد بالثلج. حافظ على الأعضاء مبردة على الثلج وقم بإزالة الرئتين بسرعة.

حدد فصوص الغدة الزعترية وقم بإزاحتها برفق للكشف عن الشريان الأورطي. ثم قم بإزالة الغدة الزعترية. وأخيرًا، اعزل الشريان الأورطي عن طريق إزالة أي أنسجة محيطة به بعناية.

باستخدام ملقط خياطة دقيقة، أمسك عادةً بكلا جداري الشريان الأورطي لكشف التجويف. ثم ضع الشريان الأورطي بعناية فوق القنية. هذه القنية مصنوعة من أنبوب بولي إيثيلين بقطر خارجي يبلغ 0.965 millimeter.

ثبّت الشريان الأبهر في مكانه باستخدام مشبك أوعية دقيقة واربط الغرز بسرعة حول الشريان الأبهر. وبمجرد ربط الغرز، قم بإزالة المشبك. استخدم الملقط للتحقق بعناية من أن القنية تقع فوق جذر الشريان الأبهر.

أضف أي روابط إضافية ضرورية لتثبيت القلب في مكانه. قم بإزالة أي أنسجة زائدة باستخدام الملاقط والمقصات الدقيقة. ثم قم بعمل شق صغير في الأذينة اليسرى.

أمسك القلب برفق وأدخل بعناية أنبوب بولي إيثيلين بقطر خارجي 0.61 millimeter عبر الأذين الأيسر وتجويف البطين الأيسر، وصولاً إلى الخروج من القمة. قم بقص الجزء الزائد من الأنبوب. بعد ذلك، أدخل بالوناً مفرغاً من الهواء ومعبأً بالماء عبر الأذين إلى البطين الأيسر.

ثبّت البالون في مكانه باستخدام شريط لاصق. ثم زد سرعة المضخة 연동ية تدريجياً لتوفير تدفق كافٍ إلى القلب. استمر في تروية القلب باستخدام محلول KH المنظم بتدفق ثابت يعادل 2 mL تقريباً في الدقيقة، حتى يتم وضع القلب في مسبار NMR.

قم بنفخ بالون البطين الأيسر (LV) بحجم صغير باستخدام محقنة ميكرومترية للتحقق من أن محول ضغط البطين الأيسر يعمل بشكل صحيح من أجل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR). أولاً، أدخل القلب بعناية في أنبوب رنين مغناطيسي نووي بقطر 10 مليمتر. يتم وضع دوارة واسعة الفتحة حول أنبوب الرنين المغناطيسي النووي للمساعدة في توجيه الأنبوب إلى الموضع الصحيح.

داخل المسبار، قم بتثبيت الجهاز بالكامل بإحكام في الحبل السري باستخدام شريط لاصق. بعد ذلك، أنزل الحبل السري ببطء في الثقب العلوي للمغناطيس حتى يصبح أنبوب NMR الذي يحتوي على القلب داخل ملف مسبار NMR الذي يبلغ قطره 10 millimeter. بمجرد استقرار القلب في الموضع الصحيح داخل المسبار، اضبط تدفق المضخة الطفيلية لتحقيق ضغط تروية يبلغ 80 millimeters of mercury.

حافظ على ضغط التروية عن طريق تفعيل آلية التثبيت في وحدة التحكم في المضخة. اترك القلب لفترة موازنة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة. وخلال فترة الموازنة، اضبط حجم بالون البطين الأيسر (LV) لتحقيق ضغط نهاية الانبساط يتراوح بين 8 إلى 10 millimeters of mercury.

بعد ذلك، قم بتحسين معلمات المطياف من أجل الحصول على أفضل إشارة ممكنة للفوسفور. قم بضبط جهاز الرنين المغناطيسي النووي (NMR) عن طريق تعيين النبضة الراديوية، بحيث يتم تحديد التردد الذي تتجاوب عنده نواة الفوسفور. ثم قم بإجراء عملية الموازنة (shim) للعينة لجعل المجال المغناطيسي متجانساً بعد فترة التوازن.

ابدأ عملية اكتساب أطياف P 31 NMR المتعددة. تعتمد فترة الاكتساب لكل طيف على قوة مجال المغناطيس، وحجم العينة، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء المطلوبة لتجربة معينة. يتم هنا الحصول على الأطياف باستخدام مغناطيس بقوة 14 Tesla عن طريق حساب متوسط الإشارة الناتجة عن 256 نبضة تردد راديوي مدتها 20 microseconds وبزاوية قلْب قدرها 60 درجة وفترات تأخير تبلغ 2.0 seconds.

ستتطلب هذه التجربة حوالي 10 دقائق. يتم الحصول على ضغط تطور البطين الأيسر (LV developed pressure)، وهو مقياس نموذجي لوظائف القلب، عن طريق طرح ضغط نهاية الانبساط (EDP) من الضغط الانقباضي. في فأر C 57 black six سليم، يتراوح ضغط تطور البطين الأيسر عادةً بين 100 إلى 110 millimeters of mercury عند ضغط نهاية انبساط ثابت يتراوح بين 8 إلى 10 millimeters of mercury.

تظهر منحنيات التشكيل التمثيلية من الفئران الضابطة والفئران التي خضعت لربط الأبهر. تُمثَّل الوظيفة الانقباضية بضغط البطين الأيسر المُطور مقابل زيادة أحجام البطين الأيسر، كما تم تحديدها من خلال حجم بالون البطين الأيسر. وتُمثَّل الوظيفة الانبساطية بضغط نهاية الانبساط مقابل زيادة أحجام البطين الأيسر.

توفر أطياف الرنين المغناطيسي النووي P 31 لقلب فأر معزول ومروي إشارات لـ PHOSPHOCREATINE أو PCR، والمجموعات الفوسفاتية الثلاث من TP، والفوسفات غير العضوي أو pi. وفي هذه الحالة، تكون ذروة PI صغيرة نسبياً، وهذا أمر نموذجي في حالة القلب المروي هوائياً والمزود بالبيروفات أو الأحماض الدهنية.

بالإضافة إلى الجلوكوز خلال فترات نقص التروية، تزداد هذه الذروة بينما تنخفض ذروة PCR. لقد أوضحت لكم للتو كيفية تحضير قلب فأر للتروية بحيث يمكن قياس كل من وظيفة القلب وطاقة القلب في وقت واحد أثناء التجربة. ومن المهم التأكد من تروية القلب بشكل كافٍ.

وإلا، فلن تكون بيانات الرنين المغناطيسي النووي (NMR) موثوقة. هذا كل شيء، شكرًا لكم وبالتوفيق في تجاربكم.