Name: عبر الاحليل تحريض العدوى ماوس المسالك البولية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: تعلم طريقة تحريض عدوى المسالك البولية في الفئران عبر الإحليل باستخدام سلالات بكتيرية محددة. يوضح هذا البروتوكول خطوات التلقيح والتحليل الكمي للإصابات لدراسة آليات العدوى البولية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أن نعترف Shelly شيه وباين جنيفر لمساعدتها التقنية للخبراء. وقدم هذا العمل ممكنا من خلال منح مقدمة من جمعية جراحة المسالك البولية للأطفال وأبحاث طب الأطفال الصندوق ستانفورد.

أولا إعداد القسطرات الإحليلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الماوس المثانة والكلى لأخذ عينات ، ومكان 5-6 حبات الفولاذ المقاوم للصدأ (المثانة ، و 1.6 مم أو مزيج 0،9-2،0 ملم) او الخرز أكسيد الزركونيوم (الكلى ، وحجم 0.5 ملم) في أنبوب واحد cryovial ، على التوالي. الأوتوكلاف الأنابيب التي تحتوي على حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أنابيب بارد لدرجة الحرارة المحيطة ، إضافة microliters من 200 برنامج تلفزيوني العقيمة على كل حبة غير القابل للصدأ الأنابيب التي تحتوي على الحديد و 400 microliters من برنامج تلفزيوني العقيمة على كل حبة الزركونيوم الانبوب المحتوية على أكسيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نستعد إحليلي القسطرة كما وصفها المعلق وHultgren 13. الأوتوكلاف زوج نظيف من مسطح الرأس ملقط ومقص غرامة (القزحية أو نوع مشابه) والسماح للصكوك لتبرد لدرجة حرارة المحيط. مسح أسفل الأسطح لتدفق الصفحي هود مع الايثانول 70 ٪. في غطاء المحرك ، وقطع 30 سم (تقريبا) جزء من أنابيب البولي ايثيلين. المكان جو معقم و مطهر إبرة معقمة قياس 30 (إبرة طويلة 1 / 2 بوصة) على محقنة معقمة سم 3. التقط واحدة من نهاية قطع أنابيب البولي ايثيلين مع ملقط تعقيمها ، وحرك الأنبوب على الإبرة حتى يلتقي المحور. قطع الأنابيب بحيث حوالي 2 سم يمتد إلى أبعد من رأس الإبرة. إزالة القسطرة من المحاقن وضعها في طبق بتري معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من احتمالات التلوث المتبادل ، ونحن جعل واحدة لكل القسطرة الماوس. بعد أن يتم بذل كل القسطرة ، تعقيم التعرض لهم من قبل في طبق بتري كشفت اشعة فوق البنفسجية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة. لا تنظر مباشرة في مصابيح الأشعة فوق البنفسجية أو تعريض أي جزء من الجسم في حين يتم تنشيط غطاء المصابيح. بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، يمكن تخزين القسطرة على المدى الطويل في طبق بتري. نوصي ختم الطبق مع Parafilm للمساعدة في الحفاظ العقم. </li></ol> II. تلقيح الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تصل الفئران على الأقل قبل أسبوع من التلاعب التجريبية بغية تجنب التوتر الناجم عن عوامل خارجية. وتستخدم الفئران الإناث لأن مجرى البول الماوس الذكور من الصعب للغاية يقثطر. CBA / J هي المستخدمة عادة ، التهاب المسالك البولية ، عرضة السلالة الفطرية الماوس. وينبغي أن تستخدم الفئران بين 8 و 12 أسبوعا من العمر ، لأن هذا هو الإطار من النضج المناعية قبل الشيخوخة. في اليوم الأول من التجربة ، وتراجع في نهاية حلقة عقيمة بتلقيح إلى قارورة من الأسهم البكتيرية المجمدة. كشط بإعداد قيحة الصغيرة والخروج متتالية على صفيحة آغار المناسبة. عموما ، uropathogenic E. يمكن زراعتها القولونية (UPEC) وغيرها من سلالات بين عشية وضحاها على آجار (LB) ، لوريا Bertani عند 37 درجة مئوية في الهواء المحيط. سلالات UPEC صلبة تنمو المستعمرات الأصفر والأبيض ، وشفافة على آجار LB. العودة فورا للسهم البكتيرية للمجمد. ويمكن للسلالات بكتيرية Uropathogenic تصبح أقل ضراوة مع مرور الوقت مع الثقافات وكرر التسلسلي. وبالتالي ، فإننا نوصي بها لوحة streaking آغار جديدة لكل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 2 من التجربة ، وبعد التأكد من مناسبة مورفولوجيا مستعمرة ، واختيار واحدة من لوحات المستعمرات آغار ومكان في لا يقل عن 5 سم مكعب من ثقافة مرق بين عشية وضحاها. ويمكن استخدام مرق LB عن سلالات بكتيرية أكثر uropathogenic (37 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة في الهواء المحيط). تبقي مباراة دولية فضفاضة على الأنابيب ثقافة مرق للسماح للتهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 من التجربة ، وتأخذ 10 ٪ من حساء الثقافة أولا والثقافة في مرق بين عشية وضحاها مرة أخرى (عادة 37 دورة في الدقيقة و 200 درجة مئوية) ، لتعزيز النوع الأول الشعرة التعبير. مرق الثقافات المسلسل تساعد على تحسين uropathogenicity البكتيرية ، وقد ثبت منذ النوع الأول من الشعرة ليكون عاملا حاسما لuropathogens الفوعة في الجسم الحي 1. تبقي مباراة دولية فضفاضة على الأنابيب ثقافة مرق للسماح للتهوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 4 من التجربة ، وقياس OD 600 من ثقافة مرق من يوم 3. إن لم تكن معروفة من قبل لسلالة بكتيرية التي يجري اختبارها ، نفذ عشرة أضعاف تخفيف الطلاء على المسلسل لا يقل عن 7 سجلات (التخفيفات تنفيذها مع برنامج تلفزيوني ، والثقافات التي أجريت على آجار LB ، 37 درجة مئوية خلال الليل الحضانة) لتحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 600 و CFU / مل. كقاعدة عامة من الإبهام ، والتطوير التنظيمي 600 من 0،4-0،5 يتوافق عادة إلى 1 2x10 - 7 في 50 CFU microliters. مرة واحدة وقد تم تحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 600 و كفو / مل ، يمكن للمرء أن ضبط ثقافة مرق إلى 600 OD المقابلة لCFU المطلوب في الماوس في 50 microliters من برنامج تلفزيوني. وقد اقترح بعض الأعمال التي تلقيح 10 microliters ، بدلا من 50 ، ويؤدي إلى أقل الجزر في kidneys6. ومع ذلك ، فقد ذكرت معظم المنشورات استخدام 50 microliters في الماوس. عموما ، ويتراوح CFU المنشود بين 10 6 و 108 CFU / الماوس ، ولكن كل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس يحتاج إلى اختبار تجريبي في الجسم الحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمساعدة على ضمان أن لا يفرغ قائح على الفور بعد تقطير ، ينبغي حرمان الفئران من الماء على الأقل 30 دقيقة قبل تحريض التخدير العام. آخر مناورة رئيسية هي للحث على يفرغ قبل تحريض التخدير قبل scruffing الفئران والضغط بلطف السفلي abdomأون. اثنين الى 2.5 ٪ isoflurane هو جرعة آمنة للتحريض 8-12 اسبوع الفئران CBA الإناث ، تليها التخدير الصيانة مع 1،8-2 ٪ isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متى تم تحقيق التخدير ، ويتم وضع الفئران في موقف ضعيف مع رؤوسهم تدرج في الرؤوس متصلة isoflurane المحتوية على الأوكسجين. يتم تدليك أسفل البطن لاجلاء البول من المثانة. إذا كانت المثانة فارغة نسبيا ، وهذا قد لا تسفر عن مناورة البول. هي غارقة في أسفل البطن والعجان مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم حقنة معقمة 1 سم بدون ابرة لوضع اللقاح المطلوب البكتيرية. المقبل ، يتم وضع قسطرة جو معقم و مطهر معقم الإحليل على حقنة. يتم قطع الأنبوب الزائدة قبالة القسطرة مع زوج من مقص بحيث 1-2 ملليمتر فقط من الأنابيب تبقى القاصي إلى رأس الإبرة. ثم ، يتم استغلالها في المحاقن والمكبس من الاكتئاب مع تستقيم حقنة لإزالة جميع الفقاعات. وجبة بوظة من جراثيم التشحيم هلام متدفق على طبق بتري معقمة أو داخل المجمع المحاقن المعقمة. وتراجع غيض من القسطرة (مع حقنة المرفقة) في الهلام. إذا كان يتم اختبار العديد من السلالات البكتيرية في التجربة نفسها ، يجب الحرص على عدم استخدام قطرة من نفس جيلي لتليين القسطرة التي تحتوي على سلالات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر ستيريو (0.8x إلى مجموعة التكبير 5X) للتضخم ، يتم اغتنامها غطاء البظر بلطف من الفأرة تخدير في اليد غير المهيمن مع زوج من غرامة ملقط مسنن وأثار رأسيا لفضح العميق الصماخ الإحليل الوردي ( الشكل 1). واستوعب المحقنة (مع القسطرة المرفقة) في اليد المهيمنة مع قبضة قلم رصاص وتعمل غيض من قسطرة في مجرى البول الصماخ بزاوية 45 درجة. ويمتد غطاء البظر على طول المحور الطويل للحقنة ، على نحو فعال "تحميل" على مجرى البول القسطرة. هذه المناورة هو ضروري منذ الإحليل الماوس زائدة عن الحاجة. ينبغي أن تنزلق بسهولة قسطرة في المثانة (إلى المحور ، الشكل 2) ، ويمكن مدور بلطف للمساعدة في التنقل في طيات زائدة من مجرى البول. بمجرد hubbed القسطرة ، يمكن خفض حقنة حتى يتم بالتوازي مع محور طويل من الماوس. يمكن للجهة غير المهيمنة إسقاط ملقط للمساعدة في استقرار الوضع في القسطرة والمحاقن وجهة المهيمنة تستخدم لحقن اللقاح ببطء (لا يقل عن 5 ثوان). إذا رأيت السوائل المتدفقة حول القسطرة خلال الحقن ، وإما في المثانة ممتلئة أو القسطرة في المهبل (الذيلية لمجرد مجرى البول). وينبغي وقفها على الفور الحقن والقسطرة موقف درست بعناية. إذا كان القسطرة في مجرى البول ، يجب ألا تعطى الماوس يتم تضمينها في التجربة. من ناحية أخرى ، يمكن تعديل أوضاعها قسطرة في غير محله في المهبل ، وحاول إعادة الحقن. بعد الحقن ، ويتم سحب القسطرة ببطء والمحاقن من الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من احتمال يفرغ بعد التلقيح المبكر ، والتي قد تدار اجلاء البكتيريا ويؤدي بالتالي إلى مستويات العدوى متغير ، وبعض المحققين الحفاظ على الفئران تحت التخدير لمدة 30 دقيقة بعد inoculation10 عبر الاحليل. بعد الجراحة ، ويجب استرداد الفئران على بطانية الاحترار نظيفة مع المراقبة المستمرة لتأكيد عودة أنماط التنفس الطبيعي والنشاط. مرة واحدة الحيوانات تعافى تماما من القدرة على الزحف ، قد عادوا إلى الفراش المحتوية على الأقفاص. </li></ol> III. قياس CFU في الأنسجة المصابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأفادت مختلف المنشورات UTI الماوس على النتائج ثقافة في الفترة من 6 ساعات لمدة أسبوع واحد أو أكثر آخر التلقيح. النقاط الوقت الأمثل يجب أن يتم تحديد تجريبيا لكل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس. يتم الحصول على البول للثقافة باطلة scruffing بواسطة الماوس فوق طبق بتري معقمة. يجب أن تبقى البول التي جمعت على الجليد في جميع الأوقات. قد محاولات عدة للحصول على البول على مدى عدة ساعات باطلة يكون ضروريا ، لأن يفرغ الماوس بشكل متكرر ، وحجم منخفض (3-10 microliters في الفراغ) ، والتي تعتمد على الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على عينات البول باطلة ، ونحن نضحي الفئران باستخدام خلع isoflurane وعنق الرحم. جو معقم و مطهر فتح البطن. إذا لم تكن عينة البول التي تم الحصول عليها بنجاح باطلة في وقت سابق ، ويمكن في كثير من الأحيان كمية صغيرة من البول يمكن أن يستنشق عبر جدار المثانة باستخدام إبرة قياس 30 و المحاقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم إزالة إحدى الكليتين أو كليهما ، المفروم إلى ما لا يقل عن 4 قطع (كل قطعة يجب أن تكون أقل من 50 ميكروغرام) على طبق بتري معقمة ، ووضعها في الزركونيوم حبة / PBS cryovials المحتوية على الجليد. يتم إزالة المثانة ، المفروم إلى ما لا يقل عن 4 قطع ، ووضعها في الفولاذ المقاوم للصدأ حبة / PBS cryovials المحتوية على الجليد. نسيج / حبة / PBS المحتوية cryovials يتم وضعها في خلاط رصاصة الخالط والمتجانس الأنسجة باستخدام "8" وضع السرعة لمدة دقيقة واحدة. ومن الشائع لبعض أجزاء الأنسجة لتبقى بعد التجانس. طالما يمكن pipetted 5-10 microliters جناسة من السائل ، وشظايا صلبةليست بالضرورة مشكلة. إذا زاد الوقت عن تجانس بعض العينات ، من المهم جدا أن تفعل ذلك بالنسبة لجميع الأنسجة من أجل الحفاظ على اتساق التجانس. نحن نستخدم رصاصة خلاط الخالط لأنه يتجنب احتمال التلوث المتبادل ، وأكثر سرعة من تجهيز العينات الفردية واحدة تلو الأخرى باستخدام الخالط القياسية ، وليس الحرارة بشكل كبير من العينات التي يجري المتجانس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي بذل ما لا يقل عن اثنين أو ثلاثة من عشرة أضعاف التخفيفات البول التي تم جمعها والنسيج الخليط في طبق microtiter. لإجراء التجارب الأولية قد يكون من الحكمة لجعل لا يقل عن سبعة عشرة أضعاف التخفيفات. ثقافة ما يصل الى 100 microliters البول والمثانة ، و / أو الكلى الخليط على أجار المناسبة. منذ البول العينات قد تكون محدودة الحجم ، قد يكون من الضروري جلب كميات ل100 microliters قبل تنفيذ عشرة أضعاف التخفيفات. إذا تطلب الأمر ذلك ، فإن التخفيف الأولي (قبل عشرة أضعاف تمييع) ضرورة أن يؤخذ في الاعتبار الحسابات النهائية للغلة البكتيرية. نحن نفضل UPEC على زراعة يوزين - الميثيلين الأزرق أو آغار ماكونكي (حضانة ليلا 37 درجة مئوية) ، لأن هذه وسائل الاعلام هي انتقائية للكائنات سلبية الغرام. سلالات UPEC تنمو على آغار ماكونكي كما مسرر مركزيا المستعمرات الأحمر الوردي ، وذلك بسبب قدرتها على تخمر اللاكتوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الثقافة بين عشية وضحاها ، عد CFU عن كل لوحة. لعينات المخفف متسلسل ، تعتبر لوحة تحتوي على تخفيف 5-10 المستعمرات العد الأكثر دقة. "عودة" حساب CFU في الأنسجة ، ولكل مليغرام من الأنسجة ، أو لكل مليلتر. </li></ol> رابعا. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. الصماخ الإحليلي (النسيج وردي غامق) كشفها بواسطة رفع غطاء البظر رأسيا مع ملقط (خارج أعلى الصورة) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. مقسطر مجرى البول. ويمكن رؤية مشقوق البظر فقط فوق القسطرة. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. CFU المثانة التهم 2 بعد أيام من العدوى عبر الاحليل من 8 اسابيع الفئران CBA / J أنثوية E. uropathogenic القولونية. وكانت متجانسة والعزم قربة كفو / مل بواسطة الطلاء تخفيف تسلسلي على آغار ماكونكي. الماس تشير كفو / مل الفئران الفردية ، شريط أفقي يشير متوسط ​​CFU / مل.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
<li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li>
<li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+LettM%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li>
<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li>
<li>Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li>
<li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li>
<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحريض البولية عدوى المسالك الماوس بواسطة التلقيح عبر الاحليل من البكتيريا هو إجراء المنشأة منذ فترة طويلة لكنه طالب تقنيا 11. وعلقت Hultgren نشرت مؤخرا استعراضا ممتازة من التقنيات عبر الاحليل العدوى الماوس المسالك البولية 13. في هذه الورقة ، ونحن نحاول توضيح مزيد من النقاط الدقيقة لهذا النهج التجريبي. قد المبتدئين الممارسة تقنيتهم ​​البطن عن طريق أداء خط الوسط لفضح المثانة ، حقن محلول مخفف م...

<table><tbody><tr><td>أنابيب حفظ بالتبريد، 2.0 مل بولي بروبيلين (بدون أغطية)</td><td>هـ&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>أغطية لأنابيب الحفظ بالتجميد، مع &amp;rsquo;أو&amp;rsquo; حلقة</td><td>هـ&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>خلاط بوليت (Bullet Blender)</td><td>التقدم التالي</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>كرات أكسيد الزركونيوم (0.5 ملم)</td><td>التقدم التالي</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>خرز من الفولاذ المقاوم للصدأ (1.6 مم)</td><td>التقدم التالي</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>مزيج حبيبات الفولاذ المقاوم للصدأ (0.9-2.0 مم)</td><td>التقدم التالي</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>فئران من سلالة CBA/J، إناث تتراوح أعمارها بين 8 و12 أسبوعاً</td><td>مختبر جاكسون (Jackson Laboratory)</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي منظم بالفوسفات (NaCl 137mM، KCl 2.7mM، Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4.3 ملي مولار، KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;أمر شراء&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; ١.٤ ملي مولار)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (كلوريد الصوديوم NaCl) EM-PX1405-1 (كلوريد البوتاسيوم KCl) EM1.06585.0 (صوديوم Na)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;التحسين المفرط للمعاملات (HPO)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>آجار LB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>مرق LB</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>إيزوفلوران (Aerrane)</td><td>Baxter International Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>عروات التلقيح</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>مسحوق آغار الإيوزين والميثيلين الأزرق (EMB)</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>مسحوق آجار ماكونكي</td><td>مختبرات Difco</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>مسحوق أغار LB</td><td>مختبرات Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب بولي إيثيلين غير ظليلة للأشعة من Intramedic، طراز PE10 [القطر الداخلي 0.28 مم (0.011 بوصة)؛ القطر الخارجي 0.61 مم (0.024 بوصة)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>إبر قياس 30، بطول 1/2 بوصة</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>حقنة توبيركولين سعة 1 مل ذات طرف انزلاقي (Slip-Tip)</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>حقنة Luer-Lock سعة 3 مل</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

عبر الاحليل تحريض العدوى ماوس المسالك البولية

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

تزرع سلالات بكتيرية Uropathogenic الفائدة على أجار. عموما ، uropathogenic<em&gt; E. القولونية</emيمكن زراعتها&gt; (UPEC) وغيرها من سلالات بين عشية وضحاها على لوريا ، Bertani (LB) أغار عند 37 درجة مئوية في الهواء المحيط. سلالات UPEC تنمو المستعمرات الأصفر والأبيض الشفاف على أجار LB. بعد تأكيد مورفولوجيا مستعمرة المناسبة ، ثم يتم اختيار واحد لتكون مستعمرات المستزرعة في المرق. ويمكن استخدام مرق LB لمعظم السلالات البكتيرية uropathogenic. ويمكن استخدام اثنين من المسلسل ، وبين عشية وضحاها مرق LB الثقافات لتعزيز التعبير عن النوع الأول من الشعرة ، وهذا عامل الفوعة واضحة المعالم للبكتيريا uropathogenic. مخففة الثقافات مرق للتركيز المطلوب في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). وضعت ثمانية إلى 12 أسبوع من العمر إناث الفئران تحت التخدير isoflurane وطعمت transurethrally مع البكتيريا باستخدام أنابيب البولي ايثيلين المغطاة قياس 30 المحاقن. قائح النموذجية ، التي يجب أن يتحدد تجريبيا لكل تركيبة سلالة بكتيرية / الماوس ، هي 10<sup&gt; 6</sup&gt; إلى 10<sup&gt; 8</sup&gt; CFU في الماوس في 10-50 microliters من برنامج تلفزيوني. بعد فترة العدوى المطلوب ويتم حصاد (يوم واحد لعدة أسابيع) ، وعينات البول والمثانة والكلى على حد سواء. غير مفروم كل جهاز ، وضعت في برنامج تلفزيوني ، والمتجانس في الخالط رصاصة الأزرق. مخففة متسلسل البول والانسجة الخليط في برنامج تلفزيوني ومثقف على أجار المناسبة. في اليوم التالي ، يتم حساب وحدات تشكيل مستعمرة.

وهذا الفيديو شرح طرق للحث على transurethrally التهابات المسالك البولية والماوس تحديد مدى الإصابات الناجمة عن ذلك.

تُنمّى السلالات البكتيرية المسببة لالتهابات المسالك البولية والمستهدفة بالدراسة على وسط آغار. وبشكل عام، يمكن تنمية بكتيريا الإشريكية القولونية المسببة لالتهابات المسالك البولية (UPEC) والسلالات الأخرى طوال الليل على...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز عدوى المسالك البولية لدى الفأر عن طريق الإحليل. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تنمية السلالات البكتيرية المستهدفة وتخفيف المزارع البكتيرية للوصول إلى التركيز المطلوب. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تلقيح مثانة الفأر بالسلالات البكتيرية المستهدفة عبر الإحليل.تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في جمع عينات البول واستئصال الكلى والمثانة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تلقيح أطباق آجر (auger plates) بالبول وعينات الكلى والمثانة المتجانسة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر نجاح إصابة المسالك البولية بناءً على وجود مستعمرات بكتيرية في العينات المزروعة.مرحباً، أنا مايكل شيا وأهلاً بكم في مختبري في قسم المسالك البولية بكلية الطب بجامعة ستانفورد. وأنا أنو، أيضاً من مختبر شيا. سنعرض لكم اليوم إجراء القسطرة عبر الإحليل للفئران.نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تحريض عدوى المسالك البولية في الفئران. لذا، لنبدأ الآن. في غطاء تدفق هوائي صفائحي، قص قطعة طولها 30 centimeter من أنابيب البولي إيثيلين، وثبّت إبرة بقياس 30 gauge على حقنة معقمة سعتها 3 cubic centimeter.استخدم ملقطاً معقماً لالتقاط أحد طرفي الأنبوب المقطوع وقم بتمريره فوق الإبرة حتى يصل إلى القاعدة. اقطع الأنبوب بحيث يبرز منه حوالي سنتيمترين تقريباً بعد طرف الإبرة؛ حيث يساعد ذلك في منع إصابة الفئران أثناء عملية القسطرة.قم بإزالة القسطرة من المحقنة ووضعها في طبق بتري معقم. قم بتجهيز قسطرة واحدة لكل فأر سيتم إصابته. عقم القساطر باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل.قم بإغلاق الطبق باستخدام فيلم البرافيل للحفاظ على تعقيم القسطرة أثناء التخزين طويل الأمد. يتم تخطيط طبق آغار مناسب باستخدام لقاح من المخزون المجمد للسلالة البكتيرية المطلوبة. هنا، يتم تخطيط لقاح من بكتيريا E coli المسببة للمسالك البولية أو UPEC لنموها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.اختر مستعمرات فردية ذات المورفولوجيا المناسبة، والتي تكون في حالة UPEC عبارة عن مستعمرات صفراء باهتة وشبه شفافة على وسط LB agar، وضعها في خمسة مللي لتر على الأقل من المرق السائل للاستزراع طوال الليل عند 37 درجة Celsius مع الرج بسرعة 200 revolutions per minute. أضف 10% من مستنبت المرق الأول إلى وسط غذائي جديد، وقم بتنميته طوال الليل. ومرة أخرى، لتعزيز تعبير type one pili، المرتبط بـ pathogenesis لـ E. coli في الجسم الحي، قم بقياس OD 600 للمستنبت لتحديد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات.وحدة CFU المختصرة لكل ملليلتر من المزرعة. يتم تخفيف المزرعة باستخدام 1 XPBS معقم بحيث يكون التركيز النهائي بين 10⁶ و 10⁸ CFU في 10 إلى 50 µL لضمان عدم إفراغ المثانة فوراً بعد التلقيح. بعد التثبيت، يتم منع الفئران من شرب الماء لمدة 30 دقيقة قبل التخدير، ثم يتم إمساك الفأر من منطقة الرقبة والضغط بلطف على أسفل البطن لتحفيز عملية التبول.ضع الفأر المخدر على ظهره مع إدخال رأسه في مخروط أنفي متصل بالأكسجين المحتوي على isof fluorine. قم بتدليك البطن لإفراغ أي بول متبقٍ في المثانة. استخدم زجاجة رذاذ لترطيب أسفل البطن والعجان بـ 70% ethanol.بعد ذلك، استخدم محقنة معقمة سعة 1 mL لسحب اللقاح البكتيري. ثم قم بتثبيت قسطرة معقمة ومجهزة على المحقنة. استخدم مقصاً لقص الأنبوب بحيث يبرز فقط من 1 إلى 2 mm بعد طرف الإبرة.يساعد هذا في منع إصابة الفئران أثناء عملية القسطرة، انقر على المحقنة واضغط على المكبس. ولإزالة فقاعات الهواء، قم بتزييت القسطرة عن طريق غمسها في كمية صغيرة من هلام تزييت مضاد للبكتيريا. تأكد من استخدام كمية مختلفة من الهلام لكل سلالة بكتيرية سيتم اختبارها تحت مجهر تشريحي ستيريو.استخدم ملاقط دقيقة الأسنان باليد غير المهيمنة للإمساك بلطف بغطاء البظر ورفعه للكشف عن فتحة الإحليل ذات اللون الوردي الداكن في اليد المهيمنة. أمسك بالمحقنة المتصلة بالقسطرة. وبقبضة تشبه قبضة القلم، أدخل طرف القسطرة في فتحة الإحليل بزاوية 45 درجة بالنسبة لبطن الفأر.في المستوى السهمي الناصف. يتم شد غطاء البظر على طول المحور الطولي للمحقنة. وذلك لتحميل الإحليل بفعالية على القسطرة.يجب أن ينزلق القثطار بسهولة إلى داخل المثانة إذا لزم الأمر. أدر القثطار برفق للمساعدة في تجاوز الثنيات الزائدة في الإحليل. وعندما يستقر القثطار وصولاً إلى الصرة، أنزل المحقنة بحيث تكون موازية لبطن الفأر.ضع الملقط واستخدم اليد غير المهيمنة لتثبيت القسطرة والمحقنة. قم بحقن اللقاح ببطء على مدى خمس ثوانٍ على الأقل. إذا لوحظ تدفق السائل حول القسطرة أثناء الحقن، فهذا يعني أن المثانة ممتلئة أو أن القسطرة موجودة في المهبل.أوقف عملية الحقن وافحص موضع القسطرة. أعد وضع القسطرة في الإحليل إذا لزم الأمر. بعد الانتهاء من الحقن، اسحب القسطرة ببطء.أبقِ الفأر تحت التخدير لمدة نصف ساعة بعد التلقيح. ولتقليل خطر التبول بعد الجراحة، اسمح للفأر بالتعافي على بطانية تدفئة نظيفة مع المراقبة المستمرة للتأكد من عودة أنماط التنفس والنشاط الطبيعية. وبمجرد تعافيه تماماً، وقدرته على الزحف، أعد الفأر إلى قفص يحتوي على فرش مخصص.اعتماداً على مزيج السلالات البكتيرية وسلالات الفئران، قد يستغرق حدوث العدوى الكاملة مدة تتراوح بين ست ساعات وأسبوع. ولتطوير العملية، ضع طبق بتري معقماً على الثلج لكل فأر مصاب على مدار عدة ساعات. قم بتثبيت رقبة الفأر فوق الطبق لجمع البول من أجل المزرعة.سيكون 50 µL من البول كافية. انقل البول بواسطة الماصة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق، ثم أغلقه وأبقِ البول على الثلج. تحت مجهر التشريح، ضع فأراً تم القتل الرحيم له على ظهره في صينية التشريح.رُش البطن بـ 70%ethanol. استخدم المقص لعمل شق يتراوح طوله بين ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات في الجلد وجدار البطن الأساسي. إذا لزم الأمر، استخدم الدبابيس لإبعاد جدار البطن عن محتويات البطن.إذا باءت المحاولات السابقة لجمع البول بالفشل، استخدم إبرة مقاس 30 ومحقنة لسحب البول مباشرة عبر جدار المثانة. استخدم الملقط والمقص لإزالة الكليتين، ثم انقلهما إلى طبق بتري معقم وقم بتقطيع كل واحدة منهما إلى أربع قطع على الأقل، بحيث يتراوح حجم كل قطعة ما بين 2 إلى 3 مليمتر تقريبًا.انقل كل قطعة من الكلية إلى أنبوب تجميد يحتوي على خمس إلى ست خرزات من أكسيد الزركونيوم المعقمة بقطر 0.5 millimeters، و400 microliters من محلول PBS المعقم. حافظ على عينات الكلى في الثلج. استخدم الملاقط والمقص لإزالة المثانة.قم بفرم المثانة باستخدام نفس الطريقة المتبعة مع الكلى. انقل كل قطعة من المثانة إلى أنبوب تجميد (cryo vial) يحتوي على حبيبات من الفولاذ المقاوم للصدأ بحجم 1.6 millimeter و200 microliters من PBS المعقم، واحفظ الأنابيب على الثلج. ضع الأنابيب في مجانس bullet blender وقم بتجانس الأنسجة عند إعداد السرعة الثامنة لمدة دقيقة واحدة على الأقل.من الشائع بقاء بعض شظايا الأنسجة بعد عملية التجانس. يجب تجنيس جميع العينات لنفس المدة الزمنية في لوحة معايرة دقيقة. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف للبول المجموع ومجانس الأنسجة باستخدام الثلج.نشر محلول PBS البارد. انتهى التخفيف. تُحضن أطباق الآغار المناسبة طوال الليل عند 37 درجة مئوية.يمكن حساب عدد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) لكل عضو أو ملليغرام من النسيج أو مللي لتر من البول رجعيًا من خلال عدد المستعمرات الموجودة في كل طبق. لقد استخدمنا هذه التقنيات لدراسة كيف تؤثر الطفرات في استجابات الإجهاد البكتيرية على قدرة UPEC على التسبب في عدوى المسالك البولية (UTI) في الجسم الحي، وكذلك مقاومة المضادات الحيوية المعطاة للفئران المصابة. يوضح هذا الجدول قدرة سلالة UPEC البرية على إصابة مثانة الفأر بعد التلقيح عبر الإحليل.لقد قدمنا لكم للتو كيفية إحداث عدوى المسالك البولية بشكل عرضي في الفئران. عند إجراء هذه العملية، من المهم تركيب القسطرة للفئران برفق. ترتبط التقنية الصحيحة بسهولة عملية القسطرة ولكنها قد تتطلب التدريب.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

المصدر: لويتس، ن. وآخرون. المتابعة الطولية لالتهابات المسالك البولية وعلاجها في الفئران باستخدام التصوير التوهج الحيوي. J. Vis. Exp. (2021).يوضح هذا الفيديو تحفيز وتتبع عدوى المسالك البولية في نموذج فأر باستخدام إشريكية كولوم متوهجة حيويا تحقن في المثانة، حيث يحدث التصاق البكتيريا والغزو والتكاثر داخل الخلية. يعمل الضوء المنبعث من الأوبيرون المضيء الحيوي كمؤشر فوري على حمل البكتيريا أثناء تقدم العدوى.

تصور عدوى المسالك البولية في نموذج فأر باستخدام التوهج الحيوي

المصدر: كونوفر، م. س. وآخرون، ج. تأسيس وتوصيف التهابات المسالك البولية وCAUTI في نموذج الفأر. J. Vis. Exp. (2015)يوضح هذا الفيديو عملية تجميع وزرع قسطرة عبر الإحليل في فأرة أنثى، تليها التلقيح البكتيري لتحديد عدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة ودراسة التفاعلات بين المضيف والممرض بواسطة الفيلم الحيوي.

عدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة في نموذج الفأر

المصدر: كونوفر، م. س. وآخرون، تأسيس وتوصيف التهابات المسالك البولية وCAUTI في نموذج فأر. J. Vis. Exp. (2015)يوضح هذا الفيديو كيفية اكتشاف المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا (IBCs) في نسيج المثانة المصابة بالإشريكية القولونية التي تعبر عن β-جالاكتوزيداز. بعد تثبيت الأنسجة، والنفاذ، والتلوين ب X-gal، تظهر خلايا IBC كبونكتا زرقاء تحت المجهر التشريح، مما يؤكد غزو بكتيريا أثناء عدوى المسالك البولية.

تصور المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا في مثانة الفأر المصاب

في هذا الفيديو ، نصف تقنية الإدارة داخل المثانة للبكتيريا المسببة للبول لتوليد نموذج عدوى المسالك البولية في الفئران. يمكن استخدام هذا النموذج لفهم انتشار العدوى البكتيرية المسببة للبول داخل الجهاز البولي والآليات التي تحدد قابلية الإصابة بالتهاب المسالك البولية.

نموذج توليد عدوى المسالك البولية: تقنية لإدارة البكتيريا المسببة للمسالك البولية في الفئران لتطوير نموذج عدوى المسالك البولية

يوضح هذا الفيديو تأسيس عدوى الإشريكية القولونية المسببة للبول في مثانة الفئران الأنثوية من خلال تقطير القسطرة عبر الإحليل. نجحت البكتيريا المحقونة في إنشاء عدوى في المسالك البولية داخل المثانة ، مما يوفر منصة قيمة لدراسة الأمراض المرتبطة بالرعاية الصحية المتعلقة بالمسالك البولية.

القسطرة عبر الإحليل والتلقيح البكتيري لتوليد نموذج عدوى المسالك البولية في ذكور الفئران

إنشاء نموذج لعدوى المسالك البولية في إناث الفئران

تعد القدرة على نمذجة التهابات المسالك البولية (UTI) أمرا بالغ الأهمية حتى تتمكن من فهم التسبب في المرض البكتيري وإنتاج تطوير علاجات جديدة. الهدف من هذا العمل هو إظهار نماذج الفئران لالتهاب المسالك البولية التجريبي والتهاب المسالك البولية المرتبط بالقسطرة والتي تلخص وتتنبأ بالنتائج التي شوهدت في البشر.

إنشاء وتوصيف UTI وCAUTI في نموذج الفأر

نموذج المنشأة transurethral قسطرة للفئران يسمح دراسة أمراض المثانة، بما في ذلك عدوى المسالك البولية، ولكن يمكن أن يتم فقط في الإناث. نموذج جديد لتقطير transurethral الذكور، المعروضة هنا، سيمكن البحث في منطقة تتسم بالاختلافات السريرية والوبائية قوية بين الجنسين.

عدوى المسالك البولية في نموذج حيوانات صغيرة: قسطرة Transurethral من الفئران الذكور والإناث

تقطير transurethral هو إجراء صعبة ولا يوصف كذلك في الأدب. والهدف من هذه المخطوطة لوصف تقنية لإدخال قسطرة لتسليم إينترافيسيكال من السوائل المحتوية على المواد النشطة في المثانة و/أو البروستاتا في الفئران الذكور البالغين ترانسوريثرال.

تقطير ترانسوريثرال الداخلي في الماوس الذكور البالغين

تم إثبات نموذج الفأر للتلقيح عبر الإشريكية القولونية المسببة للأمراض البولية (UPEC) لإنشاء خزانات المثانة الكامنة داخل الخلايا والتعرض اللاحق للمثانة ل G. vaginalis للحث على UPEC UTI المتكرر. كما ثبت تعداد البكتيريا ، وعلم خلايا البول ، وتثبيت المثانة في الموقع ومعالجتها للمجهر الإلكتروني الماسح.

عدوى الإشريكية القولونية المتكررة في المسالك البولية الناجمة عن التعرض للمثانة المهبلية Gardnerella في الفئران

تصف هذه المخطوطة الإدارة داخل الجسم البولي للبكتيريا المسالك البولية مع لوكس أوبرون للحث على عدوى المسالك البولية في الفئران والتحليل الطولي اللاحق في الجسم الحي للعبء البكتيري باستخدام التصوير الإضاءة الحيوية.

المتابعة الطولية لالتهابات المسالك البولية وعلاجها في الفئران باستخدام التصوير الإضاءة الحيوية

تعلم طريقة تحريض عدوى المسالك البولية في الفئران عبر الإحليل باستخدام سلالات بكتيرية محددة. يوضح هذا البروتوكول خطوات التلقيح والتحليل الكمي للإصابات لدراسة آليات العدوى البولية.

عبر الاحليل تحريض العدوى ماوس المسالك البولية

استكشف المزيد من الفيديوهات