يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

يتم إجراء دراسة استجابة الخلية في الوقت الفعلي للتحفيز الميكانيكي من خلال الخلايا النامية الأولى التي تعبر عن بروتينات اندماج GFP على أطباق القاع الزجاجي لمدة 24 ساعة. الخطوة الثانية هي طلاء طرف A FM بفيبرونكتين بيوتينيل. ثم يتم ملامسة طرف FM الوظيفي مع سطح الخلية للسماح للتصاق بؤري قوي بالتشكل حول طرف FM ، مما يسمح بالتلاعب المباشر بالهيكل الخلوي من خلال ارتباط أكتين مصفوفة إنتجرين بين الطرف المطلي بالفبرونيكتين والخلية.

تتمثل الخطوة الأخيرة في تحفيز الخلية الحية ميكانيكيا عن طريق التحكم في الحركة الصاعدة لطرف A FM ، بحيث يتم تطبيق القوة الرأسية عند نقطة ملامسة الخلية دون كسر الالتصاق البؤري القوي. في النهاية ، تظهر النتائج أن الخلايا تستجيب للتحفيز الميكانيكي عن طريق تعزيز ارتباطها بالركيزة وعن طريق تحفيز إعادة تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين كما هو مسجل في التصوير البصري الفلوري في الوقت الفعلي. مرحبا ، أنا أندريا تراك ، أستاذ مساعد في قسم بيولوجيا الأنظمة والطب الانتقالي في مركز تكساس للعلوم الصحية.

مرحبا ، أنا سوم ليم. أنا زميل ما بعد الدكتوراه في قسم بيولوجيا الأنظمة والطب الانتقالي في مركز تكساس للعلوم الصحية. سنعرض لك اليوم إجراء لدراسة إعادة تشكيل الخلايا التكيفية للتحفيز الميكانيكي.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا للتحقيق في إعادة تشكيل الهيكل الخلوي في الوقت الفعلي في خلايا العضلات الملساء الوعائية الحية. لذلك دعونا نبدأ. بالنسبة لهذه الدراسات ، يتم استخدام مجهر أوليمبوس التاسع 81 المقلوب مع انعكاس داخلي كلي مضان أو مرفق عشب جنبا إلى جنب مع رأس مسح CSU 22 Yokogawa.

تركيب مجهر القوة الذرية SZ ذو النطاق الحيوي أعلى المجهر البصري المقلوب. يتم تثبيت النظام بأكمله على جدول بصري من الدرجة البحثية وقد تم وصفه مسبقا بالتفصيل. يستخدم هذا المجهر المتكامل جهازين مقترنين بالشحنة لمضاعفة الإلكترون الكهرومغناطيسي الكمي أو كاميرات E-M-C-C-D.

أحدهما للتصوير العشب والآخر للتصوير متحد البؤر. يتم تثبيت المجموعة متحدة البؤر ، التي تتكون من عجلة المرشح الخارجية للماسح الضوئي للقرص الدوار ، وكاميرا E-M-C-C-D على لوحة قاعدة من الألومنيوم موضوعة فوق وسادة السيليكون اللازمة لتخميد الاهتزاز. تتصل المجموعة متحدة البؤر بأكملها بالمجهر من خلال شفة ذات طوق ملولب.

وبالتالي يمكن فصل التجميع عن المجهر أثناء الفحص المجهري للقوة الذرية أو قياسات FM لتجنب الاهتزاز من الماسح الضوئي للقرص الدوار. يستخدم ليزر الكريبتون الأرجون كمصدر إثارة لكل من أوضاع التصوير العشب ومتحد البؤر. يمكن أن يقترن الليزر بأي من الألياف الضوئية ، والتي توصل الليزر إلى مرفق العشب أو رأس المسح متحد البؤر.

ثانيا ، تتحكم أجهزة الكمبيوتر في النظام. يستخدم أحدهما برنامج كتاب الشرائح ، الذي يتحكم في التصوير البصري وبرنامج منظار النانو الآخر ، الذي يتحكم في A FM قبل 24 ساعة من تجربة التحفيز الميكانيكي التي تضع الخلايا الحية التي تعبر عن تركيبات GFP التي تستهدف بروتينات معينة في طبق زراعة خلية زجاجي. في يوم التجربة ، استبدل وسط زراعة الخلية بوسط خال من الفينول الأحمر.

نظرا لأن تجربة FM حساسة جدا للضوضاء ، تجنب التحدث أو لمس الطاولة البصرية أو المجهر أثناء التجربة لتقليل الضوضاء. في قياسات FM ، افصل القرص الدوار متحد البؤر عن المجهر. تبدأ التجربة بتركيب طبق زراعة الخلايا على مرحلة FM مع طوق مغناطيسي لتثبيت الطبق على مرحلة المجهر المغناطيسي.

يتم تخصيص الكابولي على شكل حرف V على مسبار A FM بحبة زجاجية ميكرونية بيوتينيل. يمكن رؤية الكابول بسهولة باستخدام المجهر. يتم لصق الخرزة في نهاية الكابولي ، وهذا هو المكان الذي يجب فيه تطبيق محلول الطلاء بالتنقيط.

لتحضير مسبار FM للتجربة ، قم أولا بتركيب الطرف في حامل الزجاج ثم ضع الحامل الزجاجي على حامل الطاولة لتغطية الحافة. اغسل الطرف عن طريق تقطير 10 ميكرولترات من محلول ملحي أو DPBS أو فوسفات docos بعناية في نهاية الطرف ، ثم استخدم مناديل كيم لتجفيف الحافة. كرر هذا الإجراء خمس مرات بعد الغسيل باستخدام DPBS بمعدل واحد ملليغرام لكل مليلتر.

متعطش في الحل. إسقاط فوق الحافة. اترك الطرف يحتضن لمدة خمس دقائق بعد طلاء أفادون.

اغسل الطرف خمس مرات أخرى باستخدام DPBS. ثم قم بربط الفيبرونيكتين البيوتينيل على أفادون عن طريق إضافة مليغرام واحد لكل محلول مليلتر. قطري على الحافة واحتضانها لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، اغسل الطرف مرة أخرى خمس مرات مع ترك DPBS آخر قطرة على الحافة. بمجرد تحضير الطرف ، قم بتركيب الطرف على ماسح ضوئي FM. بعد تركيب طرف FM ، ضع تنورة واقية من السيليكون حول الحامل.

ثم قم بإعداد مجهر مشاهدة الفيديو. بعد ذلك ، قم بمحاذاة طرف FM في وسط مجال الرؤية. اضبط الذراع البصري عن طريق وضع شعاع الليزر في نهاية الكابولي.

ثم قم بتغيير الهدف إلى هدف التكبير العالي المناسب لتصوير الخلية الواحدة. ثم أحضر الخلية ، التي سيتم تحفيزها ميكانيكيا في مجال الرؤية واختر مكانا يجب أن يهبط فيه طرف FM على سطح الخلية. أخيرا ، قم بخفض طرف FM حتى يلطمس إلى تلك الخلية المحددة.

بعد ملامسة الحافة للخلية ، انتظر لمدة 20 دقيقة تقريبا. هذا يسمح بتكوين التصاق بؤري قوي عند نقطة تلامس FM على سطح الخلية. بعد فترة الانتظار ، يمكن أن يبدأ إجراء التحفيز الميكانيكي في التحضير لتجربة التحفيز الميكانيكي.

قم بالتبديل من كاميرا الفيديو إلى كاميرا E-M-C-C-D للسماح بعرض الخلايا الفلورية للتصوير. ثم احصل على صورة أولية للخلية في حالة راحة. استخدم القرص الدوار والفحص المجهري الصوتي لتصور الفعل في الهيكل الخلوي في جميع أنحاء جسم الخلية.

على العكس من ذلك ، استخدم العشب لتصور الالتصاقات البؤرية لتحفيز الخلية. استخدم الكابول لتطبيق حركة تصاعدية متحكم فيها بخطوات منفصلة كل ثلاث إلى خمس دقائق. أثناء الحصول على بيانات A FM ، من المهم أن يراقب المشغل باستمرار جهد موضع Z piso لتحديد التوقيت المناسب للقطب الرأسي.

بالتزامن مع الحصول على بيانات FM ، قم بتسجيل صورة متحد البؤر أو العشب للخلية بعد كل سحب رأسي باستخدام برنامج كتاب الشرائح. أخيرا ، اسحب طرف FM من الخلية عند الانتهاء من تجربة التحفيز. خلية عضلية ملساء وعائية متعمدة مع الأكتين MRFP و vcul.

تم تصوير GFP باستخدام FM على سطح الخلية القمية. تم تصوير نفس الخلية باستخدام العشب على سطح الخلية القاعدية. هنا تتداخل الصورتان.

تم أيضا الحصول على صورة لنفس الخلية باستخدام قرص دوار متحد البؤر في جميع أنحاء جسم الخلية ويظهر كحد أقصى للإسقاط لكومة ثلاثية الأبعاد. يتم عرض تداخلات جيدة بين A FM والصور متحدة البؤر للقرص الدوار. تم تحفيز خلية العضلات الملساء الوعائية المنقولة باستخدام الأكتين MRFP ميكانيكيا بواسطة A FM وتم تصويرها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر للقرص الدوار.

تشير الأخطاء إلى ألياف تعمل تظهر إعادة هيكلة ملحوظة عند تحفيز FM. تتبلمر بعض الألياف بينما يتبلمر البعض الآخر بسبب التحفيز الميكانيكي ، وتتجمع الألياف الأخرى معا. نظرا لإعادة هيكلة الفعل ، أوضحنا لك للتو كيفية تحفيز ثقافة بيع الحياة ميكانيكيا باستخدام EFM مع تسجيل إعادة ترتيب CY في نفس الوقت باستخدام طرق التصوير البصري.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تجربة FM صاخبة للغاية وحساسة. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في بياناتك.