استهداف المنشآت الدماغ العميق مع Microinjections لتسليم المخدرات وناقلات فيروسية ، أو زرع الخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء حقنات مجهرية عالية الدقة في هياكل الدماغ العميقة لإيصال الأدوية، أو النواقل الفيروسية، أو زراعات الخلايا. يتم تحقيق ذلك من خلال إنتاج إبر شعيرية زجاجية ذات تجويف بقطر 50 micrometer أولاً. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ملء 50% من الإبرة بالزيت المعدني عن طريق الخاصية الشعيرية وإدخال المكبس من الطرف الأوسع للأنبوب.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تعبئة الإبرة بالمادة أو بمعلق الخلايا المراد حقنه. والخطوة النهائية من الإجراء هي إدخال طرف الإبرة وحقن المادة بمعدل تدفق منخفض جداً في بنية عميقة من الدماغ. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر استهدافاً دقيقاً للغاية للمواد داخل الدماغ من خلال الحقن المجهري باستخدام أنبوب شعري زجاجي.

أهلاً بكم، أنا أوسكار غونزاليس من مختبر علوم الأعصاب في كلية علم النفس بجامعة كوليما، المكسيك. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ الحقن المجهري باستخدام أنبوب شعري زجاجي لإيصال الأدوية إلى دماغ الفأر. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الخلايا الجذعية العصبية البالغة.

لنبدأ الآن. إن استخدام الإبر الشعرية الزجاجية بقطر تجويف 50 micrometer للحقن المجهري في الدماغ يقلل بشكل كبير من تلف الدماغ، ويقلل من الانتشار السلبي للأدوية، ويتيح استهدافاً دقيقاً في دماغ القوارض. وقبل البدء في عملية الحقن المجهري، يجب تصنيع الإبر الزجاجية.

ابدأ بوضع أنبوب الزجاج الشعري في قطب سحب عالي المقاومة الخاص بجهاز سحب الماصات الدقيقة. بعد ذلك، قم بتشغيل قطب جهاز سحب الماصات الدقيقة. ولتسخين منتصف الأنبوب الزجاجي بهدف تليينه موضعياً، قم بشد الأنبوب الزجاجي على طول محوره الطولي بمسافة أولية تتراوح من ثلاثة إلى خمسة مليمترات، وهي مسافة كافية لإحداث تقليل في قطر الأنبوب الزجاجي في المنطقة المحددة.

استمر في سحب الأنبوب الزجاجي حتى ينكسر. كرر هذه الخطوات لصنع إبرتين متطابقتين أحاديتي الدفعات. الآن، ضع الإبر الزجاجية في فرن صهر دقيق.

تعد زاوية 30 درجة كافية لشطب الطرف. وأخيرًا، ضع الإبر تحت المجهر وتحقق من أن كلتيهما تمتلكان القطر الداخلي الصحيح. وبالنسبة لمعظم الأدوية المحبة للماء، فإن قطرًا داخليًا يتراوح بين 30 إلى 50 micrometer يعد مثاليًا للإبر التي تم تصنيعها.

دعونا نرى كيفية استخدامها في عمليات الحقن المجهري. للبدء، املأ الإبرة المصنعة بالزيت المعدني من الطرف الأوسع. اترك الزيت المعدني يدخل عن طريق الخاصية الشعرية حتى يصل إلى حوالي 50% من طول الأنبوب الشعري.

ضع شحم التفريغ العالي حول الطرف الأوسع للإبرة ثم أدخل المكبس من خلاله. ادفع الزيت المعدني بلطف حتى تخرج قطرة صغيرة من الطرف المدبب للإبرة الزجاجية. الآن قم بتثبيت الإبرة في حامل المحقن الدقيق وابدأ في تحضير الحيوان للحقن.

أولاً، ضع وسادة تسخين على حامل الحيوانات للتوجيه التجسيمي للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان. وعند درجة حرارة 37 °C، قم بحلق رأس الفأر المخدر، ثم وضعه وتثبيته في جهاز التوجيه التجسيمي. وباستخدام قضبان الأذن وحامل الأسنان، استخدم شفرة جراحية لشق الجلد من الأذنين وصولاً إلى خط Lambda في الجمجمة.

قم بتلميع الجمجمة باستخدام مسحة قطنية لتجفيفها، ثم اسحب الجلد بعيداً عن المجال الجراحي. بعد ذلك، استخدم طرف الإبرة الزجاجية للإشارة إلى قمة درز bgma وتحديد موضع الحقن الأولي هناك. الآن، حدد النقطة المراد ثقبها في الجمجمة عن طريق تحريك المحورين x و Y للجهاز التجسيمي فوق الجمجمة.

باستخدام مثقاب دقيق للأبحاث، قم بحفر ثقوب بعناية عند الإحداثيات المحددة باستخدام ملاقط دقيقة. قم بإزالة أعمق طبقة من العظم بعناية وخرق غشاء الأم الجافية. ستلاحظ تسرب بعض السائل الدماغي الشوكي.

للتأكد من إمكانية مرور الإبرة عبر الثقوب المحفورة، قم بخفض الإبرة الزجاجية ببطء باستخدام المحور Z في الجهاز التجسيمي. الآن، اسحب ميكرولتر واحد 1 µL من العقار المراد حقنه وضعه على قطعة صغيرة من ورق الترشيح. ضع ورق الترشيح فوق الجمجمة.

اسحب العقار عن طريق تدوير عجلة المحقن الدقيق مع التحقق عبر المجهر من صعود السائل إلى الإبرة الزجاجية. قم بإزالة غشاء البارافيلم (para film) وأعد ضبط إحداثيات الصفر. الآن، حرك الإبرة إلى الإحداثيات المختارة وخفض الحامل حتى يلامس طرف الإبرة الزجاجية سطح الدماغ برفق، ثم اضبط الإحداثي Z.Coordinate عند الصفر.

أدخل الإبرة الزجاجية في متنه الدماغ وصولاً إلى العمق المطلوب. احقن العقار ببطء وبمعدل نانولتر واحد تقريباً في الثانية. وعند حقن الحجم المطلوب، اترك العقار ينتشر في المتنه لمدة دقيقتين، ثم ابدأ بإزالة الإبرة بسلاسة وببطء.

أخيرًا، قم بلصق الجرح الجراحي وأخرج الحيوان من الجهاز التجسيمي. ضع الحيوان في قفص مدفأ مسبقًا للتعافي من التخدير. سنعرض الآن بعض نتائج الحقن المجهري.

تم حقن الليسوفوسفاتيديل كولين أو الليين في الجسم المخطط (corpus cossum) مما يؤدي إلى إزالة الميالين من حزم المادة البيضاء لتقليل إصابة الدماغ الناتجة عن الإبرة الزجاجية. تم حقن 20 liters فقط من الليين. وتتمثل عملية إزالة الميالين في غياب تعبير البروتين الأساسي للميالين في حزم المادة البيضاء، وقد تم الحصول على حقن دقيق للغاية، كما يقلل مسار الإبرة الضيق جداً من إصابة الدماغ.

لقد شرحنا لكم للتو كيفية تصنيع الإبر الزجاجية لإجراء الحقن المجهري في بنيات الدماغ العميقة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجهيز جميع المعدات والمواد لتكون جاهزة للاستخدام في غرفة الجراحة. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.