نقرا الإسفار في الموقع التهجين في أقسام المخ طازجة

مرحباً، أنا JA، زميل أبحاث ما بعد الدكتوراه في مختبر AL المساعد في جامعة روتشستر. سنعرض لكم عملية الهضم الهجين (hybrid digestion) في مقاطع الدماغ المجمدة الطازجة للكشف عن اثنين من نسخ mRNA في آن واحد بدقة الخلية الواحدة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعدكم في الإجابة على تساؤلات في مجال علوم الأعصاب، مثل الدراسات المتعلقة بالتنظيم التشريحي والوظيفي والجزيئي والكيميائي العصبي لدائرة دماغية محددة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول تخثر الجينات في عصبونات دماغ AV، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل القوارض، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من الأنسجة العصبية. لبدء هذا الإجراء، قم بترطيب كمية كافية من مسحوق SDX G 50 مع RNAs باستخدام الماء.

امزج المحلول لفترة وجيزة واحفظه في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق. تفصل هذه الخطوة حبيبات SDX عن الدكستروز الموجود في مسحوق sedex التجاري بعد عملية ترسيب Sedex G 50. قم بإزالة الراسب وكرر العملية من ثلاث إلى خمس مرات، وبعد الغسلة النهائية، أعد تعليق محلول SX G 50 في منظم TE بنسبة حجمي واحد إلى واحد من المنظم إلى الحبيبات، واحفظه عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت الاستخدام.

بعد ذلك، قم بتجهيز الأعمدة. ضع الصوف الزجاجي المعقم بجهاز التعقيم (autoclave) في محقنة معقمة سعة 1 مل، واضغطه بالمكبس لتكوين طبقة مدمجة في القاع. ثم ضع المحقنة في أنبوب فالكون سعة 15 مل.

املأ الأعمدة بمحلول Sedex G 50 عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية باستخدام جهاز طرد مركزي Beckman مجهز بدوار ثابت الزاوية من طراز C 0 6 5 0. بعد الطرد المركزي، اغسل كل عمود بإضافة 200 µL من محلول غسل الأعمدة المنظم ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقتين بسرعة 1000 دورة في الدقيقة.

كما سبق. أخيرًا، ضع 200 µL من محلول حجب العمود (column blocking buffer) في كل عمود، ثم قم بالتدوير لمدة دقيقتين بسرعة 1000 rpm. كرر هذه الخطوة من أربع إلى خمس مرات لموازنة العمود.

تُحفظ الأعمدة المُجهزة عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم وسم مسبار RIBA وجاهزيته للتنقية لإجراء التهجين الفلوري المزدوج في C أو إجراء D FISH الموضح هنا، حيث يتم تحضير مسبارين من RNA، أحدهما موسوم بـ digoxigenin أو DIG والآخر بـ biotin. ابدأ بوسم المسابير عن طريق تحضير محاليل وسم مسبار ribo وتحضين تفاعلات الوسم في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعتين. وفي نهاية فترة التحضين التي استمرت ساعتين، أضف 1 µL من TRNA بتركيز 20 µg/µL و 39 µL من محلول حجب الأعمدة (column blocking buffer) إلى كل تفاعل وسم.

بعد ذلك، قم بتجهيز أعمدة EDEX G 50 لتنقية المسبار عن طريق إضافة 50 µL من محلول الحجب إلى كل عمود والتدوير لمدة ثلاث دقائق بسرعة 2000 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة من مرتين إلى ثلاث مرات لموازنة الأعمدة. وعندما تصبح الأعمدة جاهزة، ضع أنبوب EEND orph جديداً في أسفل العمود.

ضع محلول المسبار على عمود Sedex G 50 وقم بالتدوير لمدة ثلاث دقائق بسرعة 2000 دورة في الدقيقة. وللحصول على 50 µL من محلول مسبار Ribo المنقى، قم بتقييم جودة وإنتاجية مسبار ribo المسمى والمنقى. وقبل البدء في عملية التهجين باستخدام الميكروتوم المجمد (cryostat)، قم بجمع مقطعين أو ثلاثة من مقاطع الدماغ على شرائح charge super frost plus.

يجب أن يتراوح سمك المقطع بين 10 إلى 12 ميكرون. يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة -80 °C حتى وقت الاستخدام. يتم تحضين المقاطع في محلول 3% para formaldehyde بارد ومُحضّر حديثاً لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، اشطف المقاطع سريعاً مرتين في PBS. ثم، قم بتجفيف المقاطع عبر سلسلة كحولية قياسية من محاليل ethanol بتركيزات 70 و 95 و 100% لمدة دقيقتين في كل محلول. بعد تجفيف المقاطع، حضنها في محلول أستلة (acetylation) مُحضّر حديثاً لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، اشطف المقاطع ثلاث مرات في محلول SSPE بتركيز 2×، ثم جفف المقاطع بعد عملية الأستلة مرة أخرى من خلال سلسلة الكحول القياسية كما تم توضيحه للتو. ابدأ الآن عملية التهجين باستخدام المسبار الريبوزي (ribo probe). ضع حجماً مناسباً من محلول التهجين على النسيج، وغطِّ الشرائح بصفائح تغطية، ثم ضع الشرائح في حامل شرائح معدني.

اغمر حامل الشرائح في حمام من الزيت المعدني مضبوط عند 65 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، أخرج حامل الشرائح بعناية من حمام الزيت المعدني واشطفه سريعاً في الكلوروفورم لإزالة الزيت الزائد من الشرائح.

ضع الشرائح في محلول SSPE بتركيز 2x لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق لإزالة غطاء الشريحة. بعد إزالة الغطاء، انقل الشرائح إلى محلول SSPE جديد بتركيز 2x واتركها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في بداية خطوة الحضن هذه، قم بتسخين محلول SSPE بتركيز 2x مضافاً إليه 50% form aide مسبقاً إلى نفس درجة حرارة خطوة التهجين. في نهاية فترة الحضن التي استمرت ساعة واحدة.

انقل الشرائح إلى محلول SSPE بتركيز 2× الذي تم تدفئته مسبقاً واتركها للحضانة لمدة 1.5 ساعة. في بداية خطوة الحضانة هذه، قم بتدفئة محلول SSPE بتركيز 0.1× مسبقاً ليصل إلى نفس درجة الحرارة المستخدمة في خطوة التهجين. أتمِم عمليات الغسل ما بعد التهجين بنقل الشرائح إلى محلول SSPE بتركيز 0.1× المُدفأ مسبقاً واتركها للحضانة لمدة 30 دقيقة.

كرر عملية الغسل هذه مرة واحدة. أصبحت مقاطع الدماغ الآن جاهزة للكشف عن مسابير ribo المهجنة وتصويرها؛ أضف 0.3% hydrogen peroxide إلى TNT buffer واحضن الشرائح في هذا المحلول لمدة 10 minutes. ثم اغسل الشرائح في TNT buffer ثلاث مرات لمدة 10 minutes في كل مرة باستخدام deco pen.

ارسم حدود بئر حول المنطقة التي تحتوي على قطاعات الدماغ. ضع 150 µL من محلول TNB المنظم على كل شريحة، واترك القطاعات في هذا المحلول لمدة 30 دقيقة. تأكد من عدم جفاف القطاعات خلال هذه الخطوة.

بعد ذلك، ضع 150 µL من محلول TT NB الذي يحتوي على جسم مضاد لـ DIG مقترن بإنزيم البيروكسيداز، واحفظ الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعتين. وفي نهاية فترة الحضن التي استمرت ساعتين، اغسل المقاطع في محلول TNT المنظم ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. وفي كل مرة، ضع 150 µL من محلول عمل T IDE المقترن بـ Alexa 594 على كل شريحة، واحفظ الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة.

في نهاية الساعة الأولى، اغسل المقاطع في محلول TNT المنظم ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. وفي كل مرة، قم بتحضين المقاطع في محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 0.3% في محلول TNT المنظم لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة. وتعتمد مدة التحضين في محلول بيروكسيد الهيدروجين على وفرة mRNA ويجب اختبارها قبل إجراء D fish.

بعد ذلك، اغسل المقاطع في محلول TNT buffer ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. ضع 150 microliters من محلول TMB buffer لكل شريحة، واحفظ الشرائح في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة محلول TMB الزائد عن طريق إمالة الشرائح.

أضف 150 µL من محلول TMB الذي يحتوي على جسم مضاد للـ anin مقترن ببيروكسيديز، واحفظ الشرائح في غرفة رطبة لمدة ساعتين. بعد ذلك، اغسل المقاطع في محلول TNT المنظم ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. وفي كل مرة، ضع 150 µL من محلول عمل Alexa 488 المقترن بـ mite على الشرائح واحضن المقاطع لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، اغسل المقاطع في محلول TNT buffer ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. والآن، بما أن كلا مسباري الريبونوكلييك (ribo probes) قد تم وسمهما بالأجسام المضادة، قم بحضن المقاطع في 150 microliters من المحلول المضيف لمدة دقيقتين. ثم اغسل المقاطع في محلول TNT buffer ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة، وأضف وسط تثبيت متوافق مع الفلورة مثل vector shield أو prolonged antifa إلى المقاطع، ثم غطها بشريحة غطاء وافحصها تحت مجهر فلوري.

تُظهر هذه الصور المجهرية التمثيلية من تجربة على أسماك D لمقاطع من دماغ طائر Zebra finch، وتحديداً من منطقة NCM، وهي المنطقة المناظرة للقشرة السمعية في الثدييات لدى الطيور المغردة. تم تهجين مقاطع الدماغ باستخدام مسبارين: مسبار ribo مرتبط بالبيوتين موجه ضد par albumin، وهو علامة لمجموعة فرعية من العصبونات المثبطة، ومسبار ribo موسوم بـ DIG موجه ضد الجين zinc المعتمد على النشاط، وهو علامة موثوقة للعصبونات التي يحفزها الغناء. يوضح تراكب الصورتين مجموعة من الخلايا من العصبونات المثبطة التي يتم تنشيطها من خلال الخبرة السمعية.

تشير رؤوس الأسهم إلى الخلايا التي تم وسمها حصرياً بمسبار ribo الخاص بـ par. وتشير أسهم الألبومين إلى الخلايا التي تم وسمها حصرياً بمسبار RIBA الخاص بالزنك في عصبونات تمثيلية. أما الخلايا التي تعبر بشكل مشترك عن كلتا النسختين المستهدفتين فقد تم تمييزها بنجمة. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على نظافة طاولة المختبر واستخدام محاليل وبلاستيك وأوانٍ زجاجية خالية من الملوثات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف المتزامن عن نوعين من MA بدقة الخلية الواحدة في مقاطع الدماغ المجمدة حديثاً لدراسة التنظيم المشترك للجينات في دماغ الجرذان. شكراً لمشاهدتكم الفيديو، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.