تصنيع مواد حقن المشتقة بيولوجيا للهندسة الأنسجة عضلة القلب

تحتفظ هلامات المصفوفة المُنتجة من أنسجة التأمور وعضلة القلب منزوعة الخلايا بمكونات المصفوفة خارج الخلوية الأصلية، بما في ذلك البروتينات والببتيدات والغلوزامينو غليكانات المتنوعة. ويمكن استخدام مصفوفات الأنسجة هذه في هندسة الأنسجة. وفي هذا الفيديو، يتم تصنيع هلامات المصفوفة عن طريق نزع الخلايا من نسيج التأمور للحصول على مصفوفة خارج خلوية غير خلوية.

تتم بعد ذلك معالجة المادة الخلالية خارج الخلوية لإنتاج نسخة سائلة ذائبة. ثم تُختبر المادة الخلالية الذائبة في نموذج حيواني صغير لتحديد مدى جدواها كسقالة قابلة للحقن. ويُظهر التحليل النسيجي والكيميائي النسيجي المناعي أنه في الجسم الحي، تشكل المادة المحقونة سقالة ليفية مسامية تسمح بتسلل الخلايا الوعائية.

مرحباً، اسمي سونيا زكي. أنا طالبة دراسات عليا في مختبر الدكتورة كارين كريسمان بجامعة كاليفورنيا سان دييغو. سنقوم اليوم بتصنيع مصفوفة خارج خلوية (ECM) ذائبة من أنسجة منزوعة الخلايا، وسنوضح كيفية الاختبار داخل الجسم الحي (in vivo) لتطبيقات هندسة أنسجة القلب.

تعد هذه التقنيات مهمة لتطوير علاج باستخدام المواد الحيوية القابلة للحقن لعلاج فشل القلب. سيقوم بـ Pam, shoot McGuffin، وهو جراح أعصاب بيطري في مختبرنا، باستعراض الإجراء الجراحي لما بعد احتشاء عضلة القلب. لذا، فلنبدأ.

ابدأ هذا البروتوكول بإزالة الخلايا من النسيج لترك المصفوفة خارج الخلوية (ECM) فقط؛ أولاً، ضع التأمور الخنزيري في دورق من الماء منزوع الأيونات واغسله عن طريق التحريك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل، ضع النسيج في محلول PBS بتركيز 1x يحتوي على 1% SDS و1% penicillin streptomycin، مع التحريك المستمر لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وفي اليوم التالي، أعد النسيج إلى الماء منزوع الأيونات وحركه باستمرار لمدة خمس ساعات، ثم رجه في أنبوب سعة 50 milliliter حتى تختفي جميع الرغوات.

يجب أن يكشف صبغ الهيماتين والإيوسين عن غياب النوى في الأنسجة منزوعة الخلايا. ضع ما تبقى من الأنسجة منزوعة الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 إلى 50 milliliter. ثم ضع الأنسجة في مجمد بدرجة حرارة -80 °C.

قم بتجفيد العينات المجمدة عن طريق التجفيف بالتجميد تحت ضغط منخفض جداً ودرجة حرارة منخفضة جداً حتى تجف تماماً. وبناءً على النظام المستخدم ومحتوى الماء في العينات، قد تستغرق هذه العملية مدة تتراوح بين 12 إلى 72 ساعة. وبمجرد أن يجف النسيج منزوع الخلايا تماماً، انقله إلى مطحنة Wiley Minim.

باستخدام مصفاة ذات مشبك قياس 40، اطحن النسيج حتى يصبح مسحوقاً ناعماً. وبمجرد مرور غالبية العينة عبر المرشح، قم بإزالة وعاء التجميع. يُشار إلى هذه العينة الآن باسم مسحوق المصفوفة خارج الخلية أو ECM powder.

يمكن إجراء خطوة تجفيف بالتجميد ثانية في هذا الوقت، إذا لم يتم الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية. يضمن ذلك دقة الوزن المسجل لإذابة الـ ECM. قم بوزن الكمية المطلوبة من مسحوق الـ ECM في قارورة تعقيم معقمة.

أضف محلول حمض الهيدروكلوريك المُرشح والمعقم الذي يحتوي على 1 mg/mL من Pepcid إلى قارورة الوميض التي تحتوي على مسحوق الـ ECM بحيث يكون تركيز الـ ECM هو 10 mg/mL. أضف قضيب تحريك وضع القارورة على لوح التحريك.

استمر في التقليب لمدة تتراوح من 48 إلى 60 ساعة، مع كشط جوانب القارورة بشكل دوري باستخدام ملعقة أو ملعقة مسطحة (spatula) معقمة من نوع WHE، وذلك لضمان هضم مسحوق الـ ECM بالكامل. ومع هضم الـ ECM، سيتحول إلى محلول.

بمجرد إذابة المادة الخلالية خارج الخلية (ECM)، ضع العينة على الثلج واضبط قيمة الـ pH لتصل إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. بعد ضبط الـ pH، أضف محلول PBS بتركيز 10x بحيث يصبح التركيز النهائي للمحلول 1x PBS. على سبيل المثال، إذا كان لديك 900 µL من محلول ECM، يجب إضافة 100 µL من محلول PBS بتركيز 10x بعد ضبط قيمة الـ pH.

حدد تركيز محلول المصفوفة خارج الخلوية (ECM) المذاب عن طريق حساب إجمالي الأحجام المضافة للمعادلة والأحجام التي تمت إزالتها لفحص الرقم الهيدروجيني pH. ثم أضف محلول PBS بنسبة واحد إلى واحد للوصول إلى التركيز النهائي المطلوب هنا، وهو 6 mg/mL.

في يوم الجراحة، قم بتحضير حقنة بحجم 75 µL من ECM المُذاب في سرنجة سعة 0.1 mL مزودة بإبرة قياس 30 gauge. حافظ على تخدير أنثى جرذ من سلالة Harlan dolly مُنْبوبة باستخدام 2.5% من isoflurane. أضف eye، ثم تحقق من التخدير عن طريق إجراء اختبار قرصة الإصبع.

يتم حقن ثلاثة ملليلتر من محلول رينجر لاكتات حقناً تحت الجلد في أسفل البطن لترطيب الجسم. بعد ذلك، يوضع الحيوان في وضعية الاستلقاء الظهري على طاولة الجراحة وتُثبت الأطراف برفق باستخدام الشريط اللاصق. تُستخدم ماكينة حلاقة لإزالة الشعر من منطقة البطن، ثم يُشفط الشعر المتساقط باستخدام المكنسة الكهربائية.

قم بإجراء سلسلة من الحقن بحجم 50 µL من lidocaine بتركيز 2% على طول خط قطري من النتوء الخنجري إلى الجانب الأيمن السفلي من البطن. بعد ذلك، قم بتطهير المنطقة ثلاث مرات باستخدام Betadine، بدءاً من المنتصف والتحرك نحو الخارج. كرر عملية التطهير باستخدام isop profile alcohol.

بعد ذلك، قم بتغطية الحيوان باستخدام غطاء جراحي به فتحة دائرية جاهزة. ثبته باستخدام غطاء جراحي. وباستخدام مشرط رقم 10.

قم بإجراء شق بطول ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات من الناتئ الخنجري إلى الجانب الأيمن السفلي من البطن. حدد موقع الناتئ الخنجري وقم بالتشريح عمودياً لأسفل عبر العضلة جهة اليمين، مع الحرص على تجنب الوعاء الدموي الكبير الموجود على اليمين. بعد ذلك، استخدم المقص للقص عرضياً عبر العضلة لكشف الحجاب الحاجز.

يجب توخي الحذر لتجنب الكبد باستخدام خيط جراحي من نوع Vicryl بمقاس 3-0 وطول 36 بوصة وزوج من الملاقط المرقئة. يتم تمرير إبرة واحدة عبر الناتئ الخنجري وسحب الخيط إلى منتصف المسافة. يتم لصق طرفي الخيط معاً وتثبيتهما في نقطة فوق وخلف الحيوان، مع رفع الناتئ الخنجري وكشف الحجاب الحاجز باستخدام قطعة أخرى من خيط Vicryl بمقاس 3-0 وطول 36 بوصة.

مرر إبرة عبر العضلة الأقرب إلى الناتئ الخنجري، ثم اسحبها وثبّت طرفها في نقطة أخرى إلى يمين طاولة الجراحة، بحيث يتم كشف التجويف الجراحي بالكامل. بعد ذلك، وباستخدام ملقط دقيق صغير من نوع rat tooth، أمسك بمركز الحجاب الحاجز واسحبه للخارج، ثم قم بإجراء شق صغير جداً باستخدام مقص غير حاد. وبمجرد إحداث هذا الثقب، ستنكمش الرئتان.

أجرِ شقاً عمودياً بطول يتراوح بين سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات عبر الحجاب الحاجز لرؤية القلب. بعد ذلك، أدخل مسحة بطول ثلاث بوصات إلى يسار التجويف وادفع الرئتين بعيداً. ثبت المسحة في مكانها باستخدام مشبك مناشف.

باستخدام مسحة أخرى، أزح الرئة اليمنى جانباً لتحديد موقع كيس التأمور. بعد ذلك، وباستخدام ملقط دقيق وزوج من الملاقط المسننة الكبيرة، مزق كيس التأمور للكشف عن قمة القلب. أمسك بقمة القلب باستخدام الملقط الدقيق ذو الأسنان اليمنى، وأدخل الإبرة لحقن المادة المصفوفة المُذابة بحيث تكون الحافة المائلة متجهة نحو اليسار.

على بُعد ثلث المسافة صعوداً من القمة وبشكل موازٍ لسطح النخاب. تأكد من تجنب الوريد التاجي الكبير. احقن هلام المصفوفة المذاب وانتظر لبضع ثوانٍ قبل سحب الإبرة.

يجب أن يتبيّض النسيج عند موقع الحقن، ثم يتم مسح الدم من التجويف، وإزالة مشبك المنشفة والمسحة التي تثبت الرئة اليمنى باستخدام ملقط مرقئ دقيق منحني، وعمل عقدة أولية باستخدام خيط جراحي من البرولين بمقاس 5-0 وطول 30 بوصة. بعد ذلك، استخدم ملقط أسنان الفأر الدقيق لإغلاق الحجاب الحاجز بغرزة مستمرة وإبرة مستدقة قبل الإغلاق التام. أدخل أنبوب شفط PE 160 وأغلق حوله باستخدام حقنة سعة 10 milliliter لتفريغ التجويف الصدري.

عند شد الغرزة، يجب أن يكون الحجاب الحاجز مقعراً. قم بخفض تركيز الفلورين إلى 1%. قم بإزالة غرزتي Vicryl 3-0 اللتين تبقيان التجويف مفتوحاً. قم بترطيب العضلة مع مسح الكمية الزائدة باستخدام مسحة أو قطعة شاش معقمة.

استخدم قطعة جديدة من خيوط الجراحة مقاس 3-0 لإغلاق طبقة العضلات بغرز متقطعة. بعد ذلك، قم بإيقاف تدفق isof fluorine. نظف المنطقة واستخدم الدبابيس الجراحية لإغلاق الجلد.

بعد ذلك، ضع مرهم مضاد حيوي ثلاثي على موقع الشق. اترك الجرذ ليتعافى تحت نسبة 100% oxygen. عندما يبدأ الحيوان في التنفس بشكل مستقل عن جهاز التنفس الاصطناعي، قم بإزالة أنبوب الرغامي.

بمجرد استعادة الحيوان لقدرته على الوقوف، يتم إعطاؤه حقنة تحت الجلد من مسكن buprenorphine hydrochloride بجرعة 0.05 milligrams per kilogram، ثم يُعاد إلى القفص المخصص له على منشفة معقمة. تم تقطيع أنسجة القلب من الجرذان التي حُقنت بهلامات المصفوفة القابلة للذوبان وصبغها بـ hemat, toin, and eoin لإجراء تحليل نسيجي عام في نقاط زمنية مختلفة. فبعد الجراحة في النقاط الزمنية المبكرة، تظهر المنطقة المحقونة كشبكة ليفية وردية اللون، بينما تنتشر بشكل خلالي في النقاط الزمنية اللاحقة.

يُلاحظ تدفق الخلايا بعد أسبوعين، كما يُلاحظ تحلل المصفوفة المحقونة. وإذا تم وسم المصفوفة خارج الخلوية (ECM) بالبيوتين قبل الحقن، فيمكن تصورها بشكل أكثر مباشرة عن طريق صبغ البيوتين باستخدام الستريبتاديفين المقترن بإنزيم HRP لتصور نمو الأوعية الدموية وتكوينها في منطقة حقن المصفوفة.

تم صبغ الشرائح هنا صبغاً مزدوجاً باستخدام صبغة fitzy. يظهر السيلكتين المقترن، والذي يرتبط بالخلايا البطانية، باللون الأخضر، بينما يظهر الجسم المضاد لـ smooth muscle actin باللون الأحمر، وقد يمكن أيضاً تحديد الخلايا الجذعية بالقرب من منطقة الحقن.

هنا تم تصورها باستخدام صبغ الكيمياء النسيجية المناعية لـ C kit. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء ECM مُذاب من أنسجة منزوعة الخلايا واختباره في vivo لتطبيقات هندسة أنسجة القلب. لا تنسَ أنه بينما نستخدم أنسجة التامور، فإن هذا الإجراء العام يمكن تعديله ليتم استخدامه مع أي مصدر نسيجي.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.