دراسة التجانس الخلية الدبقية التأثير على النمو أكسون باستخدام أسلوب جديد Coculture

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة تأثير التغاير الدبقي على نمو محور العصب في العقد الجذرية الظهرية (DRG) وموت الخلايا. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استزراع الخلايا الدبقية من قشرة دماغ الجرذ حديث الولادة. والخطوة الثانية من الإجراء هي استزراع وتنقية عصبونات العقد الجذرية الظهرية (DRG) من جنين الجرذ.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة عصبونات DRG المنقاة فوق خلايا glio. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي مراقبة نمو المحاور العصبية في استطالة الخلية وإجراء صبغ الخلايا وتحليل القياس الكمي. وفي النهاية، يمكن الحصول على النتائج.

يوضح هذا الفيديو أن نمو عصبونات العقد الجذرية الظهرية (DRG) يتأثر بالخلايا الدبقية غير المتجانسة من خلال تسجيل التصوير الزمني ومجهر الفلورة المناعية. مرحبًا، أنا من مختبر التصوير العصبي في قسم أمراض الأعصاب بجامعة كاليفورنيا، ريفرسايد (UCRA). سنعرض لكم اليوم إجراءً لدراسة التأثير غير المتجانس للخلايا الدبقية على النمو باستخدام طريقة جديدة لزراعة الخلايا العصبية.

نستخدم في مختبرنا هذه الطريقة الجديدة لدراسة التفاعل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. لذا دعونا نبدأ الدراسة. ومن أجل إنشاء مستنبت مشترك من الخلايا الدبقية وعصبونات العقد الجذرية الظهرية أو DRGs، سنبدأ بزراعة الخلايا الدبقية تحت غطاء استنبات الأنسجة. يتم تبطين قواعد أطباق استنبات ذات 24 بئراً ومعقمة مسبقاً بشرائح غطاء زجاجية مستديرة ومعقمة، ثم تُطلى شرائح الغطاء الموجودة في آبار طبق استنبات ذي 6 آبار بمادة polylysine وتُحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

اغسل شرائح التغطية وأطباق المزرعة مرتين بالماء المقطر واتركها لتجف في الهواء. بعد ذلك، اسحب بواسطة الماصة 200 µL أو 2 mL من وسط DMEM المعدل (DMEM) مع 10% مصل جنين البقر (FBS) في كل طبق ذي 24 بئراً أو 6 آبار على التوالي. حضّن الأطباق عند 37 °C في 5% CO2 في اليوم التالي.

قم بتعقيم غطاء التشريح ذو التدفق الإيجابي. قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 20 دقيقة، ثم رش جميع الأسطح الموجودة أسفل الغطاء بـ 70% ethanol وانتظر لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. ابدأ برؤوس اثنين من جراء الجرذان في المرحلة العمرية P2 إلى P6 التي تم تخديرها عن طريق التبريد.

ثم يتم قطع الرأس من قاعدة الثقبة العظمى باستخدام مقص جراحي. يتم فتح القحف على طول الدرز السهمي باستخدام مقص القزحية وإزالة الجمجمة. يتم استخراج الدماغ الأمامي ووضعه في محلول levo wit's L 15 المبرد، وتكرر العملية مع الرأس الثاني.

بعد ذلك، وبالعمل تحت مجهر ستيريو، قم بإزالة الأم الجافية والأغشية والوعائ الدموية التي تغطي الدماغ بعناية. قم بعزل القشرة المخية وغسلها عدة مرات باستخدام وسط L 15.

استخدم مقصات الجراحة المجهرية لتقطيع القشرة إلى قطع صغيرة. ثم قم بالتحضين في وسط L 15 يحتوي على 0.125% trips in EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، انقل كتل الأنسجة إلى أنبوب سعة 50 milliliter يحتوي على 20 milliliters من وسط DMEM مع 20% FBS.

أضف DS ليصل التركيز النهائي إلى 10 micrograms per milliliter. بعد ذلك، استخدم ماصة باستور مصقولة بالنار لتحريك محلول النسيج حوالي 20 مرة لفصل الخلايا. وأخيراً، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DMEM يحتوي على 10%FBS، ثم حدد عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer).

ثم قم ببذر الخلايا بكثافة تتراوح بين 5,000 إلى 10,000 خلية لكل سنتيمتر مربع وحضنها عند 37 °C و 5% carbon dioxide. استبدل الوسط مرتين أسبوعياً لعزل وتنقية وزراعة DRGs. أولاً، قم بتجهيز أطباق ذات 24 بئراً تحتوي على شرائح غطاء زجاجية مغطاة بالبولي ليسين كما تم توضيحه سابقاً.

أضف 100 µL من وسط NVF إلى كل غطاء شريحة، واحفظ الأطباق في درجة حرارة 37 °C حتى اليوم التالي. قم بتعقيم غطاء التدفق الإيجابي كما سبق. ثم ابدأ باستخدام أجنة جرذان في المراحل من E 12 إلى E 15، والتي تم عزلها من رحم جرذ حامل تم القضاء عليه باستخدام ثاني أكسيد الكربون تحت المجهر المجسم.

اعزل الحبال الشوكية مع عقد الجذور الظهرية المتصلة بها وانقلها إلى أطباق قطرها 35 مليمتر تحتوي على وسط L 15 المبرد. وباستخدام ملاقط الجراحة المجهرية، قم بتشريح عقد الجذور الظهرية المتصلة بعناية من الحبال الشوكية في وسط L 15 المبرد دون إصابة عقد الجذور الظهرية، ثم اقطع المحاور العصبية المتصلة.

عادةً ما يتم عزل من 20 إلى 30 من العقد الجذرية الظهرية (DRGs) من نخاع شوكي واحد عند عزل جميع هذه العقد من النخاع الشوكي. توضع جميع العقد الجذرية الظهرية المعزولة في 0.125% trypsin في EDTA وتُحضن لمدة 20 دقيقة عند 37 °C و 5% CO2، ثم تُغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DMEM مع 20% FBS، وبعد ذلك تضاف DNAs وتُنقل بالماصة عدة مرات باستخدام ماصة باستور مصقولة بالنار لتكوين معلق خلوي متجانس كما هو موضح مع الخلايا الدبقية. يتم إجراء غسلة ثانية في وسط MBF، ثم تُعد الخلايا، وبعد ذلك تُزرع الخلايا على شرائح التغطية المجهزة في أطباق ذات 24 بئراً بمعدل 5,000 خلية لكل بئر، وتُحضن طوال الليل لتنقية عصبونات العقد الجذرية الظهرية.

بعد 18 إلى 24 ساعة من الاستزراع. استبدل الوسط بوسط Neurobasal يحتوي على 20 µM من 5-fluoro-2'-deoxyuridine، ثم بعد 72 ساعة، استبدل نصف الوسط بوسط Neurobasal خالٍ من FUDR.

يتم بعد ذلك استبدال الوسط الغذائي يوماً بعد يوم. وبعد حوالي 20 يوماً من استزراع الخلايا الدبقية، ستصل هذه الخلايا إلى مرحلة الالتحام وتصبح جاهزة للاستزراع المشترك مع الخلايا العصبية قبل 24 ساعة من دمج نوعي الخلايا.

استبدل وسط الخلايا الدبقية بوسط MBF. قم بتحضير معلق خلوي أحادي من العقد الجذرية الظهرية (DRGs) المنقاة كما تم توضيحه سابقاً. حدد كثافة الخلايا.

بعد ذلك، قم باستزراع الخلايا العصبية بكثافة 500 cells per centimeter square فوق الخلايا الدبقية. ويمكن تحليل بقاء الخلايا العصبية ونمو الاستطالات العصبية على الخلايا الدبقية في نقاط زمنية مختلفة باستخدام برنامج لتحليل الصور والكيمياء المناعية مع أجسام مضادة خاصة بنوع الخلية. إليك أمثلة على الخلايا الدبقية وعصبونات DRG المستزرعة بشكل منفصل وكزراعة مشتركة؛ حيث تصبح الخلايا الدبقية متلاحمة بعد 20 days.

في المزرعة، تبين تحت مجهر تباين الأطوار أن المجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا الدبقية تشكل أنماط نمو ومورفولوجيات متميزة. وأظهر الكيمياء النسيجية المناعية أن الخلايا النجمية الإيجابية لـ GFAP شكلت أكثر من 90% من المزرعة.

باستخدام طريقتنا في المعالجة بـ FUDR لمدة 72 ساعة، ستصل نقاوة عصبونات DRG إلى 99% في غضون ستة أيام، وستظهر مورفولوجياتها الفريدة مع كثافة عالية من نمو الزوائد العصبية في المزرعة المشتركة من العصبونات والخلايا الدبقية. حدث تمايز عصبونات DRG ونمو الزوائد العصبية بسهولة على الخلايا الدبقية في غضون أربع ساعات بعد الاستزراع، وقد تأثر تمايز العصبونات ونمو الزوائد العصبية بالمجموعات الفرعية للخلايا الدبقية، والتي تشكل بنيات فرعية لأنماط نمو خاصة يمكن التعرف عليها بسهولة تحت مجهر تباين المرحلة. ومن خلال الكيمياء النسيجية المناعية، سأوضح لكم كيفية استزراع عصبونات DRG مع الخلايا الدبقية لدراسة تأثير عدم تجانس الخلايا الدبقية على النمو العصبي.

عند إجراء هذه الجلسة، من المهم جداً تذكر التعامل مع النسيج بحذر شديد والحفاظ على الخلايا في الوسط الغذائي. لا تعرضها للهواء أبداً ولا تتركها تجف. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.