سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على صور ثلاثية الأبعاد بمقياس الميكرون لتركيز الأكسجين في البيئة المباشرة للخلايا الحية عن طريق مجهر الرنين المغناطيسي للإلكترون أو مجهر ESR. سيتم تطبيق البروتوكول على البكتيريا الزرقاء، وهي خلايا ضوئية شائعة. ويتحقق ذلك من خلال تحضير عينة من خلايا البكتيريا الزرقاء أولاً داخل حامل عينات مجهر ESR.

تُغمر العينة في محلول جذور عضوية مستقرة. يوضع حامل العينة داخل مسبار التصوير، والذي يدخل بدوره في المغناطيس الكهربائي الساكن لنظام مجهر ESR. والآن، يتم الحصول على عدة صور مجهرية ثلاثية الأبعاد لمحلول الجذور العضوية بواسطة مجهر ESR.

يتم تنفيذ ذلك لعدة متغيرات من تتابعات النبضات وغالباً تحت ظروف خارجية متنوعة، مثل ظروف الإضاءة والظلام. بعد ذلك، تتم معالجة صور البيانات الخام بواسطة الكمبيوتر من أجل استخلاص أزمنة الاسترخاء ذات الدقة المكانية ثلاثية الأبعاد للجذر. توفر أزمنة الاسترخاء هذه مقياساً مباشراً لتركيز الأكسجين من خلال معايرة مسبقة، مما يؤدي إلى الحصول على خرائط أكسجين ثلاثية الأبعاد كاملة للعينات المقاسة تحت ظروف خارجية مختلفة.

تُظهر النتائج التي تم الحصول عليها بوضوح عدم إنتاج الأكسجين بواسطة البكتيريا الزرقاء عند غياب الضوء. علاوة على ذلك، تبيّن أنه تحت الإشعاع الضوئي، يتكون تدرج ملحوظ في الأكسجين وعدم تجانس في توزيعه بالقرب من خلايا البكتيريا الزرقاء. مرحباً، أنا al من مختبر BLA في كلية الكيمياء بجامعة التخنيون، معهد إسرائيل للتكنولوجيا في حيفا.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لرسم خرائط تركيزات الأكسجين بالقرب من الخلايا الحية بطريقة ثلاثية الأبعاد وبدقة مكانية عالية باستخدام مجهر القوة الذرية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة معدل استهلاك الأكسجين والنشاط الأيضي للخلايا. لذا، فلنبدأ.

يُعد رنين الغزل الإلكتروني (Electron spin resonance) أو ESR تقنية مطيافية يتم فيها امتصاص الإشعاع الكهرومغناطيسي بتردد محدد بواسطة الأنواع البارامغناطيسية التي تمتلك غزلاً إلكترونياً غير مزدوج عند وضعها تحت مجال مغناطيسي استاتيكي خارجي. وهي طريقة قوية لدراسة بيئة الجزيئات البارامغناطيسية في الكائنات الحية، بما في ذلك تركيزات الأكسجين وأنواع الأكسجين التفاعلية. تظهر هنا صورة نموذجية لتركيز الأكسجين في فأر مصاب بورم لعينات غير متجانسة.

يمكن الحصول على معلومات طيف ESR بطريقة ذات دقة مكانية من خلال استخدام تدرجات المجال المغناطيسي. وقد تم حقن جذر عضوي حر ومستقر في الفأر، وتوفر خصائص ESR الخاصة به تركيز الأكسجين في بيئته. تظهر النتائج القائمة على ESR متراكبة على صورة تشريحية بالرنين المغناطيسي MRI.

حتى الآن، كانت تقنيات تصوير ESR هذه للعينات الحية تُجرى فقط على عينات كبيرة نسبياً بمقياس المليمتر. أما مجهر ESR عالي الدقة فيتضمن قياسات لعينات بحجم المليمتر وما دون المليمتر، مما يوفر صور ESR ثلاثية الأبعاد بدقة تقترب من 1 micron.

إليك مثالان لصور رنين مغناطيسي إلكتروني (ESR) عالية الدقة بمقياس ميكروني، لعينة مُحضرة باستخدام مسحوق NNC 60 وبلورات سيانيد الليثيوم البارامغناطيسية. يشبه مجهر ESR جهاز مطياف ESR التقليدي، حيث يحتوي على مغناطيس لتوليد المجال الساكن، ونظام ميكروويف لإثارة السبيّن وكشف الإشارة، ومسبار لتثبيت العينة، ووحدة تحكم محوسبة للتحكم في عملية الاستحواذ ومعالجة البيانات. وتشمل المكونات الأخرى للنظام مشغلات تدرج المجال المغناطيسي، والتي تُعد جزءًا من النظام الإلكتروني، وملفات التدرج الموجودة في مسبار التصوير.

تحتوي ملفات التدرج أيضًا على فتحة للسماح بتسليط الضوء على العينة. ويتم تعريض العينة لهواء رطب بدرجة حرارة مضبوطة لضمان الحد الأدنى من الجفاف أثناء التجربة. وتتمثل الميزات الفريدة الرئيسية لمجهر ESR في الحجم الصغير للمسبار وملفات التدرج، والحساسية المغزلية الأعلى للنظام، والقوة العالية لمحركات تدرج المجال المغناطيسي. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير معلق من البكتيريا الزرقاء بتركيز 40 mg/mL.

لبدء تحضير عينة التصوير المجهري بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (ESR)، خذ بضع مربعات من الورق الماص بحجم 400 في 400 ميكرون تقريباً باستخدام ملاقط دقيقة. ثم أدخلها في أنبوب einor. بعد ذلك، املأ الأنبوب بـ 1.2 milliliters من معلق البكتيريا الزرقاء (cyanobacteria).

ثم قم بطرد المعلق مركزياً لمدة دقيقتين بسرعة 6,000 RPM في جهاز طرد مركزي دقيق، وبعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الرائق تماماً باستثناء 50 microliters تقريباً، والتي تُترك لتجنب جفاف البكتيريا الزرقاء. تؤدي هذه العملية إلى تشبع الورق الماص بخلايا البكتيريا الزرقاء. بعد ذلك، قم بتجهيز حامل عينات زجاجي على شكل كوب مُعد خصيصاً، واستخرج بضع ألياف من الورق باستخدام ملقط دقيق، وضعها في قاع حامل العينات.

بعد ذلك، أضف 3 mM من محلول tridel وBG 11، الذي تم تحضيره كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، باستخدام ثمن سرنجة. ثم قم بإغلاق حامل العينة باستخدام غراء قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (UV) عن طريق وضع الغراء بين حواف حامل العينة الزجاجي وقطعة غطاء الزجاج المطابقة له، مع ترك فتحة صغيرة لخروج الهواء. وأخيرًا، قم بمعالجة الغراء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثانيتين.

لبدء تجربة التصوير، قم بتشغيل نظام التصوير المجهري بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (ESR) وأدخل العينة في الرنان الموجود داخل مسبار التصوير. الآن، باستخدام برنامج التحكم في الكمبيوتر، اضبط النظام على وضع الضبط (tune mode) وحدد تردد الميكروويف الرنيني للمسبار، والذي سيتم استخدامه في قياسات ESR. بعد ذلك، اضبط المجال المغناطيسي الساكن على القيمة التي تتوافق مع تردد الميكروويف المطبق.

اضبط معلمات التوقيت لتسلسل النبضات وراقب إشارة ESR للتأكد من أن النظام يعمل بشكل جيد وأن العينة قد حُضِّرت بشكل سليم. بعد ذلك، اضبط معلمات التصوير مثل عدد البكسلات، وقوة التدرجات، وطول نبضات التدرج وفقاً للقيم المطلوبة. بعد الانتهاء من الإعداد، اجمع ثلاث صور ESR ثلاثية الأبعاد باستخدام تسلسل نبضات التصوير بصدى Han مع قيم فاصل زمني بين النبضات tau تبلغ 500 و600 و700 نانومتر.

عند هذه النقطة، قم بتشغيل إسقاط الضوء على العينة إذا كان ذلك مطلوباً للظروف التجريبية طوال فترة الحصول على البيانات، حيث يتم حفظ البيانات تلقائياً. بعد عملية الحصول على البيانات، يتم التعامل مع ملفات البيانات الخام عبر نص برمجي (script) في برنامج MATLAB. باستخدام البرنامج، قم بتوليد صور لتركيز الجذور الحرة ووقت الاسترخاء.

يتم رسم خريطة T two ثم ترجمة هذه الصور إلى صورة تركيز أكسجين عبر منحنى معايرة مسبق يربط تركيز الأكسجين بزمن الاسترخاء. هنا T two zero هو زمن استرخاء سبين-سبين للمسبار تحت ظروف نقص الأكسجين، والذي يعتمد على تركيز المسبار C ومعامل انتشاره D. تظهر هنا صور البيانات الخام النموذجية من عدة تجارب تصوير ESR ثلاثية الأبعاد أجريت على البكتيريا الزرقاء. وقد تم الحصول على هذه الصور بقيم tau مختلفة تحت ظروف الظلام أو الإضاءة.

في الظروف المظلمة، تكون النتائج متشابهة جداً باستثناء انخفاض الشدة لقيم T الأكبر بسبب اللف المغزلي، وزمن استرخاء اللف المغزلي T2. وعلى العكس من ذلك، يتغير نمط الصورة تحت التشعيع الضوئي بسبب اختلاف أزمنة الاسترخاء في جميع أنحاء العينة. يتم بعد ذلك معالجة هذه البيانات للحصول على صورة سعة من هذه الصورة.

من الواضح أن البكتيريا الزرقاء تتركز بشكل أساسي في الجانب الأيمن من حامل العينة. يتم تحويل الصورتين إلى قيم تركيز الأكسجين عبر منحنى معايرة مسبق يربط تركيز الأكسجين بزمن الاسترخاء. وتظهر النتائج للبكتيريا الزرقاء في وجود الضوء وغيابه.

من الواضح أن إنتاج الأكسجين يبدأ مع التعرض للضوء ويتسبب في زيادة ملحوظة في تركيز الأكسجين في المحلول. ويؤدي ذلك إلى انخفاض في الجذر الحر T2، وبشكل أساسي في الفوكسلات القريبة من ألياف الورق الماصة التي تحتوي على البكتيريا الزرقاء. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير عينة تحتوي على خلايا حية مع جذر حر مستقر لرسم خريطة تركيز الأكسجين باستخدام مجهر EESR. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقائه قصيراً قدر الإمكان لضمان ثبات S وتجنب تدهور العينة.

هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.