Name: سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: تعلم تصوير الأكسجين ثلاثي الأبعاد بدقة ميكرونية حول الخلايا الحية باستخدام مجهر رنين الإلكترون. يُطبق على البكتيريا الزرقاء لدراسة التدرجات الأكسجينية وآثار الضوء على التمثيل الضوئي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل جزئيا من خلال منحة لا. 213/09 من مؤسسة العلوم الإسرائيلية ، ومنحة لا. 2005258 من مؤسسة البنك السعودي الفرنسي ، ومنحة لا. 201665 من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ، وتقنية النانو في معهد روسيل Berrie في التخنيون. نعترف بمساعدة البروفيسور نعوم أدير وفارس سلامة من كلية Schulich الكيمياء في التخنيون بشأن العرض والتعامل مع البكتيريا الزرقاء. يحظى بتقدير كبير في مساعدة ودعم Yoffis سفيتلانا من وحدة التصنيع التخنيون الصغير نانو.

1. نظرة عامة على ESR الصغرى ، التصوير أولا ، نحن نقدم شرحا موجزا ESR ، ESR المجهري ، ومختلف مكونات نظامنا ، ومن ثم فإننا سوف تصف تجارب التصوير الفعلي. الإلكترون تدور الرنين هي تقنية التحليل الطيفي الذي يمتص الإشعاع الكهرومغناطيسي على تردد محدد من جزيئات الإلكترون يدور مع المفردة ، وضعت تحت حقل مغناطيسي خارجي ثابت (الشكل 1). ESR يعمل في مجالات واسعة من العلوم ، مثل الكيمياء والبيولوجيا والفيزياء وعلوم المواد ، من أجل الكشف والتعرف على الجذور الحرة ومراكز ممغطس. انها وسيلة قوية لدراسة البيئة من الجزيئات في الأنواع الحية ممغطس ويوفر معلومات حول الحموضة (PH) ، واللزوجة ، والأكسجين ، وعلى رد الفعل الأوكسجين الأنواع تركيزات 3. للعينات غير متجانسة ، يمكن الحصول على المعلومات الطيفية ESR بطريقة حل مكانيا (أي عن طريق الحصول على صورة) ، من خلال استخدام تدرجات المجال المغناطيسي 4. هذه هي مشابهة جدا لطريقة أكثر شيوعا من التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) الذي يدور أساسا يلاحظ البروتون. حتى الآن ، تم تطبيق تقنيات التصوير مثل ESR لعينات حية مع حجم كبير نسبيا من بضعة سنتيمترات ومم على نطاق القرار. (على سبيل المثال انظر الشكل 2 ، المأخوذ من المرجع 5) وهناك تطور حديث نسبيا في مجال التصوير ESR هو امتداد لقدراتها من النظر إلى الحيوانات الصغيرة الحجم في المليمتر القرار إلى قياسات لعينات من الملليمتر ، وشبه عادية مع الحجم ميكرون على نطاق القرار. ويعرف هذا المجال ، حيث ESR المجهري ، والتي يمكن اليوم تقديم صور ESR 3D مع قرار يقترب 1 2 ميكرون (انظر الأمثلة ممثل في الشكل 3). مجهر ESR يشبه أساسا إلى مطياف ESR التقليدية. انها عامل جذب لتوليد حقل ثابت ، ونظام الميكروويف لتدور الإثارة واكتشاف الإشارات ، تحقيقا لعقد العينة ، وحدة محوسبة للتحكم في عملية اقتناء ومعالجة البيانات. مكونات أخرى فريدة من نوعها التصوير ESR بشكل عام والموجودة أيضا في مصغرة ESR ممغنطة مصادر التدرج الميدانية ، التي هي جزء من النظام الالكتروني ، وملفات الانحدار التي تقع في التحقيق التصوير. ويرد مزيد من التفاصيل حول نظامنا محددة في الفيلم ، ووصف بروتوكول في إشارة 2. 2. ESR إعداد نموذج مايكرو التصوير ويصف هذه المرحلة طريقة لإعداد نموذج للتجربة التصوير ESR متناهية الصغر. في نهاية هذه المرحلة يتم وضع الخلايا في الجزء السفلي من الزجاج ESR أعدت خصيصا لحاوية العينة المجهر جنبا إلى جنب مع حل جذري trityl العازلة 6. يصف هذا البروتوكول قياس خلايا البكتيريا الزرقاء ، وبالتالي ، بالنسبة لأنواع أخرى من الخلايا ، قد تكون هناك حاجة إلى إجراء تعديلات مناسبة على عينة مرحلة التحضير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا ، يتم اتخاذ مربعات قليلة من ورقة ماصة بحجم 400 400 ميكرومتر ~ وإدراجها في أنبوب إيبندورف التي شغلها في وقت لاحق مع 1.2 مل من تعليق البكتيريا الزرقاء (بتركيز 40 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم طرد تعليق لمدة 2 دقيقة عند 6000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذا ، تتم إزالة تماما العازلة طاف باستثناء ميكرولتر 50 ~ التي يتم ترك البكتيريا الزرقاء لتجنب الجفاف. نتيجة لهذه العملية ، مشبعة الآن ورقة ماصة من قبل خلايا البكتيريا الزرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط غرامة ، ويتم استخراج ألياف قليلة من الورق وتوضع في قاع فنجان تشبه الزجاج أعدت خصيصا صاحب العينة 7. بعد أن تتم إضافة 3 ملم من trityl في حل BG - 11 8 ، 9 (انظر المخطط 1) لصاحب العينة من خلال المعونة من حقنة الغرامة. ومن ثم ختم صاحب الأشعة فوق البنفسجية يمكن علاجها باستخدام الغراء ، وترك منفذ الهواء صغيرة مفتوحة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الأسهم 4 </td><td> الأسهم 3 </td><td> الأسهم 2 </td><td> المخزون 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 هبو 4 : 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4 : 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> غ 2 ملغ EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2 : 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> الحديديك سترات الأمونيوم 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4 : 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> حامض الستريك : 1H2O 0.6g/liter </td></tr><tr><td>كبريتات النحاس (4) : 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2 : 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> رمع الفتح المهبطي 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4 : 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> مخطط (1) إعداد المتوسطة BG 11. </li></ol> 3. ESR مايكرو التصوير التجارب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء تجربة التصوير ، وتشغيل نظام التصوير الجزئي ESR وتضاف العينة إلى أن يذهب مرنان داخل مسبار التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، وذلك باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة الكمبيوتر ، وضبط النظام على الوضع "اللحن" والعثور على تردد صدى الميكروويف لجنة التحقيق ، والتي سيتم استخدامها لقياس ESR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك ، تعيين الحقل المغناطيسي ثابتة على القيمة التي تتوافق مع وتيرة الميكروويف التطبيقية ، وتعيين المعلمات توقيت لتسلسل النبض ومراقبة إشارة ESR للتأكد من أن نظام وظائف جيدة والعينة مستعدة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم ، تعيين المعلمات والتصوير ، مثل عدد البكسل ، وقوة من التدرجات ، وطول البقول الانحدار إلى القيم المطلوبة لديهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإعداد ، وجمع ثلاث صور ESR 3D بواسطة تسلسل صدى نبض التصوير هان (الشكل 4) مع فصل interpulse والقيم من 600 ، 500 ، 700 و NS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشغيل الضوء المسقط على عينة أو إيقاف تشغيله اعتمادا على الظروف التجريبية المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال اقتناء وحفظ البيانات تلقائيا. ثم تتم معالجة البيانات الخام الأطروحات الملفات عن طريق برنامج ماتلاب النصي لتوفير صور من تركيز trityl الراديكالية ووقت الاسترخاء T 2 الخريطة ، والتي تترجم الى تركيز الأوكسجين عن طريق صورة موجودة مسبقا المعايرة. </li></ol> 4. ممثل النتائج نتائج التجربة عدة ثلاثي الأبعاد ESR متناهية الصغر الصور المسجلة على قيم τ مختلفة. يتم توفير البيانات الخام الصور النمطية في الشكل 5. أعلى ثلاث صور ، ويقاس في ظروف مظلمة ، متشابهة جدا ، باستثناء انخفاض في كثافة الإشارة. من ناحية أخرى ، يتغير نمط الصور تحت أشعة ضوء نتيجة اوقات الاسترخاء مختلفة في أجزاء مختلفة من العينة. يمكن معالجة هذه البيانات من 1 إلى الحصول على صورة السعة ، كما هو مبين في الشكل (6) وأيضا صور من الوقت للاسترخاء ، تي 2 (الشكل 7). وتترجم على شكل حرف T 2 الصور في قيم تركيز الأوكسجين عبر منحنى المعايرة قبل القائمة التي تربط بين تركيز الأكسجين إلى وقت الاسترخاء عن طريق المعادلة : <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="المعادلة 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="المعادلة 1"> هنا ، T 2 0 هو وقت الاسترخاء تدور تدور بسرعة التحقيق في ظل ظروف نقص الأكسجين (اعتمادا على تركيز التحقيق ، وجيم ، ومعامل لنشرها ، D) ، و k هو ثابت التناسب. في معظم الحالات ، فإن معامل الانتشار لا تختلف كثيرا عن عينات حية (على الرغم من ذلك ، إذا لزم الأمر ، من حيث المبدأ يمكن أن يكون أيضا من خلال تقييمها مباشرة ESR 6 ، 10) ، ويتم الحصول على تركيز تدور أثناء عملية التصوير. ولذلك ، يمكن استخدام هذه العلاقة لقياس تركيز الأوكسجين مباشرة. بالعودة إلى الشكل (6) ، يتضح من الصورة السعة التي كانت موجودة في خلايا البكتيريا الزرقاء أساسا على الجانب الأيمن لصاحب العينة. وعلاوة على ذلك ، على أساس الشكل 7 ، فمن الواضح أن الضوء يبدأ إنتاج O 2 ويؤدي إلى زيادة كبيرة في تركيز المحلول 2 O ، وأساسا في voxels بالقرب من البكتيريا الزرقاء. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 : مستويات الطاقة في الرنين الالكتروني المغناطيسي. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2 : صورة نموذجية للتركيز الأوكسجين ماوس مع الورم. الصورة على اليسار يظهر المعلومات التشريحية ، استنادا إلى صورة بالرنين المغناطيسي. تم حقن مستقرة خالية العضوية جذرية للفأرة وخصائصها ESR توفير تركيز الأكسجين في بيئتها (يمين). يتم فرضه على أساس النتائج ESR على الصورة التشريحية التصوير بالرنين المغناطيسي. مجال الرؤية هو 32 ملم. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3 : مثالين على صور عالية الصغيرة الحجم القرار ESR من العينة photolithographically ولدت مع مسحوق N @ C 60 (يسار) وLiPcبلورات ممغطس (يمين) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4 : النموذجية هاهن تسلسل نبض التصوير تبين الميكروويف (MW) ، والتدرج ، ومجموعة X ، Y G G والبقول ض. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="الشكل 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 5"> الشكل 5 : نموذجي البيانات الخام ESR متناهية الصغر الصور : أ ، ب ، ج والبيانات الأولية من عينة Cyanobacterium مع عدم وجود إنارة الضوء المقاسة لτ = 500600700 نانوثانية ، على التوالي. البنود د ، ه ، و هي نفس أ ، ب ، ج ، ولكن مع الإضاءة الخفيفة. يتم رسم كثافة في حجم التعسفي (ولكن متناسقة داخل كل مجموعة من ثلاثة الظلام أو الضوء صور البيانات الخام) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="الشكل 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 6"> الشكل 6 : صورة السعة المقابلة لتركيز جذري في حل (مقياس التعسفي). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="الشكل 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 7"> الشكل 7 : T 2 الصور والمناظر و[O 2] القيم في ظل ظروف (يمين) الظلام (يسار) والخفيفة.

<ol><li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution%3A+methodology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li>
<li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR%3A+when%2C+how+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR: when, how and why?</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li>
<li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEaton%2C+GR+%22EPR+imaging+and+in+vivo+EPR%22">EPR imaging and in vivo EPR</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li>
<li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE%5BTitle%5D)+AND+%22ESR.+J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li>
<li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+Assignments%2C+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن تطبيقها ESR التصوير الجزئي لتعيين تركيز الأكسجين بالقرب من عينات صغيرة حية. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، فإنه يمكن تطبيقه بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، وقدرة وسائل أخرى والتي تجد من الصعب جدا تحقيقه. في المستقبل القريب نخطط لزيادة تحسين هذه المنهجية لتقديم عينة من الصور الحية مع قرار من بضعة ميكرونات ، وتوفير معلمات النقيض من مثل تركيز أكسيد عظمى والحموضة (PH) ، نشر وتحقيق معامل ، بالطبع ، وتركيز الأوكسجين. هذه القدرات هي مكملة لمنهجيات البصرية الحالي القائم على حد سواء من حيث النوع ، وكذلك على النقيض من خصائص العينات (مثل عينات غير شفافة وسميكة ، في بعض الحالات ، مقابل قياسات الخلايا خارج الخلية).

<table><tbody><tr><td>جهاز طرد مركزي</td><td>Kendro</td><td>Heraus, 75003235</td><td></td></tr><tr><td>جذر تراي أريل ميثيل (تريتيل) مديتر completely</td><td>Novosibirsk</td><td></td><td>تم تخليقه في Novosibirsk باستخدام الطريقة الموضحة في المرجع &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>منظم BG-11</td><td></td><td></td><td>لتعليمات التحضير، انظر المخطط 1 والمراجع 8، 9.</td></tr><tr><td>حقنة</td><td>Hamilton Co</td><td>Microliter 7000.5</td><td></td></tr><tr><td>معالجة بالأشعة فوق البنفسجية</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA63، أو NOA61.</td><td></td></tr></tbody></table>

سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

يصف هذا البروتوكول الرنين الالكتروني المغناطيسي (ESR) الصغيرة التصوير طريقة لرسم خرائط ثلاثية الابعاد لمستويات الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية مع ميكرون على نطاق القرار 1. الأوكسجين هي واحدة من الجزيئات الأكثر أهمية في دورة الحياة. وهو بمثابة محطة المتقبلة الإلكترون الفسفرة المؤكسدة في الميتوكوندريا ، ويستخدم في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. قياسات الأكسجين هامة لدراسة وظائف الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي ، مما يشير الممرات ، وآثار مختلف المحفزات ، نفاذية الغشاء ، وتمايز المرض. استهلاك الأوكسجين وبالتالي علامة بالمعلومات الأيض الخلوي ، والتي تنطبق على نطاق واسع لمختلف النظم البيولوجية من الميتوكوندريا إلى خلايا للكائنات كلها. نظرا لأهميتها ، وقد وضعت العديد من الأساليب لقياس الأوكسجين في الأنظمة الحية. وتستند المحاولات الجارية لتوفير مستوى عال من الدقة التصوير الأكسجين بشكل رئيسي على مضان البصرية وأساليب تفسفر التي تفشل في تقديم نتائج مرضية كما أنها توظف تحقيقات مع ارتفاع السمية الصورة وحساسية منخفضة الأوكسجين. ومن المعروف ESR ، والذي يقيس إشارة من تحقيقات ممغطس الخارجية في العينة ، لتوفير قياسات دقيقة للغاية من تركيز الأوكسجين. في حالة نموذجية ، والقياسات ESR خريطة توسيع المسبار lineshape و / أو الاسترخاء في الوقت تقصير التي ترتبط مباشرة إلى تركيز الأوكسجين المحلية. (الأوكسجين ممغطس ، وبالتالي ، عندما يصطدم مع التحقيق ممغطس الخارجية ، فإنه ضيق أوقات الاسترخاء والخمسين.) تقليديا ، يتم تنفيذ هذا النوع من التجارب كان خارجا مع القرار منخفضة ، ملليمتر النطاق ESR للتصوير الحيوانات الصغيرة. هنا نبين كيف يمكن أيضا أن يكون التصوير ESR التي نفذت في الحجم ميكرون لفحص عينات حية صغيرة. ESR الدقيقة التصوير منهجية جديدة نسبيا ، والتي تمكن من الحصول على اشارات ESR مكانيا حل مع قرار يقترب 1 ميكرون في درجة حرارة الغرفة 2. الهدف الرئيسي من هذه الورقة هو بروتوكول لاظهار كيف ان هذه الطريقة الجديدة ، جنبا إلى جنب مع مجسات حساسة للأكسجين المطورة حديثا ، يمكن تطبيقها على رسم خرائط لمستويات الأكسجين في عينات حية صغيرة. قرار المكاني لل~ 30 × 30 × 100 ويتجلى ميكرون ، مع قرب micromolar تركيز الأوكسجين حساسية ودون حساسية فيمتومول الأكسجين المطلق لكل فوكسل. استخدام ESR الدقيقة لرسم الخرائط والتصوير بالقرب من الخلايا الأوكسجين يكمل التقنيات المتوفرة حاليا على أساس الدقيقة الأقطاب أو مضان / تفسفر. علاوة على ذلك ، مع التحقيق ممغطس السليم ، سيكون أيضا ينطبق بسهولة لتصوير الخلايا المجهرية الأكسجين ، والقدرة التي تجد وسائل أخرى من الصعب جدا تحقيقه.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصوير ثلاثي الأبعاد ميكرون النطاق للتركيز الأوكسجين في البيئة المباشرة من الخلايا الحية التي تدور الإلكترونات المجهري الرنين.

يصف هذا البروتوكول طريقة للتصوير المجهري بالرنين المغزلي الإلكتروني (ESR) لرسم خرائط ثلاثية الأبعاد لمستويات الأكسجين في البيئة المباشرة...

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على صور ثلاثية الأبعاد بمقياس الميكرون لتركيز الأكسجين في البيئة المباشرة للخلايا الحية عن طريق مجهر الرنين المغناطيسي للإلكترون أو مجهر ESR. سيتم تطبيق البروتوكول على البكتيريا الزرقاء، وهي خلايا ضوئية شائعة. ويتحقق ذلك من خلال تحضير عينة من خلايا البكتيريا الزرقاء أولاً داخل حامل عينات مجهر ESR.تُغمر العينة في محلول جذور عضوية مستقرة. يوضع حامل العينة داخل مسبار التصوير، والذي يدخل بدوره في المغناطيس الكهربائي الساكن لنظام مجهر ESR. والآن، يتم الحصول على عدة صور مجهرية ثلاثية الأبعاد لمحلول الجذور العضوية بواسطة مجهر ESR.يتم تنفيذ ذلك لعدة متغيرات من تتابعات النبضات وغالباً تحت ظروف خارجية متنوعة، مثل ظروف الإضاءة والظلام. بعد ذلك، تتم معالجة صور البيانات الخام بواسطة الكمبيوتر من أجل استخلاص أزمنة الاسترخاء ذات الدقة المكانية ثلاثية الأبعاد للجذر. توفر أزمنة الاسترخاء هذه مقياساً مباشراً لتركيز الأكسجين من خلال معايرة مسبقة، مما يؤدي إلى الحصول على خرائط أكسجين ثلاثية الأبعاد كاملة للعينات المقاسة تحت ظروف خارجية مختلفة.تُظهر النتائج التي تم الحصول عليها بوضوح عدم إنتاج الأكسجين بواسطة البكتيريا الزرقاء عند غياب الضوء. علاوة على ذلك، تبيّن أنه تحت الإشعاع الضوئي، يتكون تدرج ملحوظ في الأكسجين وعدم تجانس في توزيعه بالقرب من خلايا البكتيريا الزرقاء. مرحباً، أنا al من مختبر BLA في كلية الكيمياء بجامعة التخنيون، معهد إسرائيل للتكنولوجيا في حيفا.سنعرض لكم اليوم إجراءً لرسم خرائط تركيزات الأكسجين بالقرب من الخلايا الحية بطريقة ثلاثية الأبعاد وبدقة مكانية عالية باستخدام مجهر القوة الذرية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة معدل استهلاك الأكسجين والنشاط الأيضي للخلايا. لذا، فلنبدأ.يُعد رنين الغزل الإلكتروني (Electron spin resonance) أو ESR تقنية مطيافية يتم فيها امتصاص الإشعاع الكهرومغناطيسي بتردد محدد بواسطة الأنواع البارامغناطيسية التي تمتلك غزلاً إلكترونياً غير مزدوج عند وضعها تحت مجال مغناطيسي استاتيكي خارجي. وهي طريقة قوية لدراسة بيئة الجزيئات البارامغناطيسية في الكائنات الحية، بما في ذلك تركيزات الأكسجين وأنواع الأكسجين التفاعلية. تظهر هنا صورة نموذجية لتركيز الأكسجين في فأر مصاب بورم لعينات غير متجانسة.يمكن الحصول على معلومات طيف ESR بطريقة ذات دقة مكانية من خلال استخدام تدرجات المجال المغناطيسي. وقد تم حقن جذر عضوي حر ومستقر في الفأر، وتوفر خصائص ESR الخاصة به تركيز الأكسجين في بيئته. تظهر النتائج القائمة على ESR متراكبة على صورة تشريحية بالرنين المغناطيسي MRI.حتى الآن، كانت تقنيات تصوير ESR هذه للعينات الحية تُجرى فقط على عينات كبيرة نسبياً بمقياس المليمتر. أما مجهر ESR عالي الدقة فيتضمن قياسات لعينات بحجم المليمتر وما دون المليمتر، مما يوفر صور ESR ثلاثية الأبعاد بدقة تقترب من 1 micron.إليك مثالان لصور رنين مغناطيسي إلكتروني (ESR) عالية الدقة بمقياس ميكروني، لعينة مُحضرة باستخدام مسحوق NNC 60 وبلورات سيانيد الليثيوم البارامغناطيسية. يشبه مجهر ESR جهاز مطياف ESR التقليدي، حيث يحتوي على مغناطيس لتوليد المجال الساكن، ونظام ميكروويف لإثارة السبيّن وكشف الإشارة، ومسبار لتثبيت العينة، ووحدة تحكم محوسبة للتحكم في عملية الاستحواذ ومعالجة البيانات. وتشمل المكونات الأخرى للنظام مشغلات تدرج المجال المغناطيسي، والتي تُعد جزءًا من النظام الإلكتروني، وملفات التدرج الموجودة في مسبار التصوير.تحتوي ملفات التدرج أيضًا على فتحة للسماح بتسليط الضوء على العينة. ويتم تعريض العينة لهواء رطب بدرجة حرارة مضبوطة لضمان الحد الأدنى من الجفاف أثناء التجربة. وتتمثل الميزات الفريدة الرئيسية لمجهر ESR في الحجم الصغير للمسبار وملفات التدرج، والحساسية المغزلية الأعلى للنظام، والقوة العالية لمحركات تدرج المجال المغناطيسي. قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير معلق من البكتيريا الزرقاء بتركيز 40 mg/mL.لبدء تحضير عينة التصوير المجهري بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (ESR)، خذ بضع مربعات من الورق الماص بحجم 400 في 400 ميكرون تقريباً باستخدام ملاقط دقيقة. ثم أدخلها في أنبوب einor. بعد ذلك، املأ الأنبوب بـ 1.2 milliliters من معلق البكتيريا الزرقاء (cyanobacteria).ثم قم بطرد المعلق مركزياً لمدة دقيقتين بسرعة 6,000 RPM في جهاز طرد مركزي دقيق، وبعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة الرائق تماماً باستثناء 50 microliters تقريباً، والتي تُترك لتجنب جفاف البكتيريا الزرقاء. تؤدي هذه العملية إلى تشبع الورق الماص بخلايا البكتيريا الزرقاء. بعد ذلك، قم بتجهيز حامل عينات زجاجي على شكل كوب مُعد خصيصاً، واستخرج بضع ألياف من الورق باستخدام ملقط دقيق، وضعها في قاع حامل العينات.بعد ذلك، أضف 3 mM من محلول tridel وBG 11، الذي تم تحضيره كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، باستخدام ثمن سرنجة. ثم قم بإغلاق حامل العينة باستخدام غراء قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (UV) عن طريق وضع الغراء بين حواف حامل العينة الزجاجي وقطعة غطاء الزجاج المطابقة له، مع ترك فتحة صغيرة لخروج الهواء. وأخيرًا، قم بمعالجة الغراء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثانيتين.لبدء تجربة التصوير، قم بتشغيل نظام التصوير المجهري بالرنين المغناطيسي الإلكتروني (ESR) وأدخل العينة في الرنان الموجود داخل مسبار التصوير. الآن، باستخدام برنامج التحكم في الكمبيوتر، اضبط النظام على وضع الضبط (tune mode) وحدد تردد الميكروويف الرنيني للمسبار، والذي سيتم استخدامه في قياسات ESR. بعد ذلك، اضبط المجال المغناطيسي الساكن على القيمة التي تتوافق مع تردد الميكروويف المطبق.اضبط معلمات التوقيت لتسلسل النبضات وراقب إشارة ESR للتأكد من أن النظام يعمل بشكل جيد وأن العينة قد حُضِّرت بشكل سليم. بعد ذلك، اضبط معلمات التصوير مثل عدد البكسلات، وقوة التدرجات، وطول نبضات التدرج وفقاً للقيم المطلوبة. بعد الانتهاء من الإعداد، اجمع ثلاث صور ESR ثلاثية الأبعاد باستخدام تسلسل نبضات التصوير بصدى Han مع قيم فاصل زمني بين النبضات tau تبلغ 500 و600 و700 نانومتر.عند هذه النقطة، قم بتشغيل إسقاط الضوء على العينة إذا كان ذلك مطلوباً للظروف التجريبية طوال فترة الحصول على البيانات، حيث يتم حفظ البيانات تلقائياً. بعد عملية الحصول على البيانات، يتم التعامل مع ملفات البيانات الخام عبر نص برمجي (script) في برنامج MATLAB. باستخدام البرنامج، قم بتوليد صور لتركيز الجذور الحرة ووقت الاسترخاء.يتم رسم خريطة T two ثم ترجمة هذه الصور إلى صورة تركيز أكسجين عبر منحنى معايرة مسبق يربط تركيز الأكسجين بزمن الاسترخاء. هنا T two zero هو زمن استرخاء سبين-سبين للمسبار تحت ظروف نقص الأكسجين، والذي يعتمد على تركيز المسبار C ومعامل انتشاره D. تظهر هنا صور البيانات الخام النموذجية من عدة تجارب تصوير ESR ثلاثية الأبعاد أجريت على البكتيريا الزرقاء. وقد تم الحصول على هذه الصور بقيم tau مختلفة تحت ظروف الظلام أو الإضاءة.في الظروف المظلمة، تكون النتائج متشابهة جداً باستثناء انخفاض الشدة لقيم T الأكبر بسبب اللف المغزلي، وزمن استرخاء اللف المغزلي T2. وعلى العكس من ذلك، يتغير نمط الصورة تحت التشعيع الضوئي بسبب اختلاف أزمنة الاسترخاء في جميع أنحاء العينة. يتم بعد ذلك معالجة هذه البيانات للحصول على صورة سعة من هذه الصورة.من الواضح أن البكتيريا الزرقاء تتركز بشكل أساسي في الجانب الأيمن من حامل العينة. يتم تحويل الصورتين إلى قيم تركيز الأكسجين عبر منحنى معايرة مسبق يربط تركيز الأكسجين بزمن الاسترخاء. وتظهر النتائج للبكتيريا الزرقاء في وجود الضوء وغيابه.من الواضح أن إنتاج الأكسجين يبدأ مع التعرض للضوء ويتسبب في زيادة ملحوظة في تركيز الأكسجين في المحلول. ويؤدي ذلك إلى انخفاض في الجذر الحر T2، وبشكل أساسي في الفوكسلات القريبة من ألياف الورق الماصة التي تحتوي على البكتيريا الزرقاء. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير عينة تحتوي على خلايا حية مع جذر حر مستقر لرسم خريطة تركيز الأكسجين باستخدام مجهر EESR. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقائه قصيراً قدر الإمكان لضمان ثبات S وتجنب تدهور العينة.هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذه التقنية تتيح استخدام السحر زاوية عالية الدقة الغزل بروتون MR الطيفي (HRMAS 1H - MRS) لتوصيف الجزيئي...

الرنين المغناطيسي الطيفي للعيش ذبابة الفاكهة السوداء البطن غزل باستخدام زاوية ماجيك

كان يعمل الإلكترون ممغطس صدى (EPR) التحليل الطيفي للكشف عن اكسيد النيتريك من الخلايا البطانية الأورطي البقري وأنيون دسموتاز الراديكالية من العدلات الإنسان باستخدام الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون...

اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

الوقت الفاصل بين المجهري من علامات الالتهام الذاتي fluorescently المسمى يسمح رصد استجابة الالتهام الذاتي ديناميكية مع القرار الزماني عالية. باستخدام الالتهام الذاتي محددة وعلامات عضية في مزيج من 3 ألوان مختلفة، ونحن يمكن أن يتبع مساهمة بروتين لتشكيل جسيم بلعمي ذاتي في سياق المكاني والزماني قوية.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

طريقة جديدة ممغطس الإلكترون الرنين (الثوري) وسريعة مسح الثوري (RS-EPR)، ويتضح لل2D التصوير المكاني الطيفي الذي يتفوق على الأسلوب التقليدي موجة مستمرة (CW) ويفتح مجالات جديدة للتصوير في الجسم الحي. وأظهرت النتائج في 250 ميغاهيرتز، ولكن هذه التقنية قابلة للتطبيق في أي تردد.

سرعة المسح الضوئي الكترون ممغطس الرنين تفتح آفاقا جديدة للالتصوير الناحية الفسيولوجية معلمات هام<em&gt; في فيفو</em

ونحن نقدم وصفا لاستخدام الرواية ، والتردد-المجال التلالؤ كاميرا مدي الحياة لرسم الخرائط 2D O2 التوزيعات مع رقائق الاستشعار البصرية. يتم وصف نظام الكاميرا وإجراءات تحليل الصور إلى جانب اعداد ومعايره وتطبيق رقائق الاستشعار لتصور البيئة الدقيقة O2 في جذور النباتات المائية.

التلالؤ التصوير مدي الحياة من O2 مع تردد-نظام الكاميرا المستندة إلى المجال

يصف البروتوكول توليد كروي عالي الإنتاجية للطباعة الحيوية باستخدام التحليل متعدد المعلمات للأكسجين وموت الخلايا على مجهر فلوري قياسي. يمكن تطبيق هذا النهج للتحكم في صلاحية الكرويات وإجراء التوحيد القياسي ، وهو أمر مهم في نمذجة الأنسجة 3D ، والبيئة الدقيقة للورم ، والتصنيع الحيوي الناجح (الدقيق) للأنسجة.

التصنيع الحيوي بمساعدة الأكسجين بمساعدة الأكسجين بأسعار معقولة للكرويات متعددة الخلايا

تصف هذه الورقة استخدام جهاز تصوير بصري جديد وسريع لتصوير عمر التلألؤ الضوئي العياني للعينات الباعثة للاضمحلال الطويل. يتم وصف إجراءات التكامل والحصول على الصور والتحليل ، جنبا إلى جنب مع إعداد وتوصيف مواد الاستشعار للتصوير وتطبيق التصوير في دراسة العينات البيولوجية.

تصوير ماكرو مضان مدى الحياة للتطبيقات الطبية الحيوية

نقدم بروتوكولا لتصور الأنشطة الأيضية مباشرة في الخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية باستخدام المجهر المجهري لتشتت رامان المحفز(DO-SRS) ، والذي يتكامل مع المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PEF).

التصوير الكيميائي المتعامد الحيوي لعملية التمثيل الغذائي للخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية العطرية

تم تصوير خرائط الأكسجين الكمية ثلاثية الأبعاد لأورام الفئران بشكل غير جراحي باستخدام الرنين المغناطيسي النبضي للإلكترون. تم استخدام الموجات فوق الصوتية ب الوضع و Power Doppler للتشريح وهيكل الأوعية الدموية. تم تركيب صور من كلتا الطريقتين مما يتيح تحليل الورم متعدد المعلمات.

تقييم نقص الأكسجة في الورم: تصوير الأكسجين ثلاثي الأبعاد في الجسم الحي من خلال الرنين المغناطيسي الإلكتروني 

باستخدام منصة متعددة الوسائط تجمع بين طرائق التصوير البصري الخالية من الملصقات ، قمنا بتطوير بروتوكول لتصور وقياس الديناميكيات الخلوية والتمثيل الغذائي. من خلال التصوير عبر التألق متعدد الفوتون ، والجيل التوافقي الثاني ، والفحص المجهري المشتت رامان المحفز ، يمكننا إنشاء نظرة عامة شاملة على البيئة الخلوية والجزيئية.

منصة التصوير البصري متعدد الوسائط لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي

قدمنا تقنية تصوير جديدة تسمى التصوير المقطعي متعدد الطبقات البصري (OMLIT)، والتي تتيح التصوير غير المتحيز لجميع الخلايا في عينات الدماغ على المستوى المتوسط ويمكن دمجها بسلاسة في سير عمل التصوير الخاص بالمجهر الإلكتروني الماسح التسلسلي المعتمد على الشريط على نفس العينة.

طريقة تصوير بصري متوافقة مع المجهر الإلكتروني الماسح لرسم خرائط الدماغ لجميع الخلايا بالمنظار

تعلم تصوير الأكسجين ثلاثي الأبعاد بدقة ميكرونية حول الخلايا الحية باستخدام مجهر رنين الإلكترون. يُطبق على البكتيريا الزرقاء لدراسة التدرجات الأكسجينية وآثار الضوء على التمثيل الضوئي.

سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

استكشف المزيد من الفيديوهات