الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

أعراض مرض باركنسون ، بما في ذلك الخلل الحركي والكلام ، ناتجة عن انخفاض نشاط خلايا إفراز الدوبامين في الدماغ. الجهاز العصبي المعوي والبصلة الشمية هما أكثر الهياكل العصبية تعرضا وأول الهياكل التي تتأثر. ارتبط مرض باركنسون بالتعرض لمبيدات الآفات.

من أجل تحليل آثار المبيدات الحشرية على الجهاز العصبي المعوي ، يتم إعطاء مبيد الآفات رون للفئران عن طريق التزقيم الفموي. ثم يتم تغذية الفئران داخل القلب بنسبة 4٪ بارافورم ودماغ ألدهيد والجهاز العصبي المعوي. يتم استخراج الأنسجة وتحضيرها وصبغها المناعي للبروتينات المرتبطة بمرض باركنسون.

تظهر صور بيتا ثلاثة توبولين وألفا سينوكلين التي تم الحصول عليها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر تراكم ألفا سينوكلين داخل الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المعوي في المعرضة لمبيدات الآفات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الإدارة الجهازية للروتينون ، هي أنه باستخدام هذه التقنية ، يتم التأكد من أن تأثير الروتينون يقتصر على الجهاز العصبي المعوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مرض باركنسون، مثل مسبراته والآليات الكامنة وراء تطوره.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الأبراج وتشخيص مرض باركنسون لأنها ستسمح بتطوير أهداف علاجية وطرق تشخيصية جديدة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل دراسة تأثير السموم البيئية الأخرى على الجهاز العصبي المعوي والودي والبارالسمبتاوي وكذلك جدار الأمعاء. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الأساليب لأن الأمر يستغرق بعض الوقت لإتقان التزقيم.

خطرت لي فكرة هذه الأساليب لأول مرة عندما قرأت عن العلاقة بين المبيدات الحشرية ومرض باركنسون. كان من المفيد أيضا رؤية مؤتمر CORAs الرفيع المستوى في المؤتمر العالمي لباركنسون في برلين في عام 2005. من الضروري التوضيح السلمي لهذه الطريقة.

طريقة إدارة ol مع التزقيم صعبة لأن الفئران لديها تشريح مختلف عن البشر على الجانب الآخر ، تم إجراء تحليل الصور بخطوات مخصصة لهذه الصور. ابدأ البروتوكول بوزن. احسب الحجم المناسب من الروتينون.

هناك حاجة إلى 0.01 مل لكل جرام من وزن ، وهو ما يعادل خمسة ملليغرام لكل جرعة كيلوغرام رون. اشحن حقنة سعة مليلتر واحد بالمحلول الروني ، ثم اشحن حقنة ثانية بمحلول السيارة. التقط الماوس وأمسك ذيل الماوس بيد واحدة.

قم بتمديد جلد الرقبة عن طريق سحبه بأول إصبعين من اليد الأخرى. بمجرد تثبيت الرأس بين الإصبعين ، قم بإمالته على راحة اليد وقلبها رأسا على عقب. إصلاح الذيل.

باستخدام الإصبعين الرابع والخامس ، مع إبقاء الرأس باتجاه الخلف ، اضغط على الحنك لفتح فم الفأر. أدخل التزقيم برفق في الفم. حرك التزقيم ببطء في اتجاه المعدة حتى يتم إدخال طوله بالكامل.

من أجل تجنب دخول المواد إلى الرئتين ، قم بإدارة محلول الرون أو السيارة عن طريق الضغط برفق على الصمة. عند الانتهاء ، قم باستخراج التزقيم ببطء ، ثم ضع مرة أخرى في قفص آخر حتى تنضج جميع من قفص واحد. بعد العلاج ، يتم إغراق الفئران داخل القلب بنسبة 4٪ ألدهيد بارافورم.

في PBS ، يتم بعد ذلك استخراج الشجاعة عن طريق التشريح ووضعها في 15٪ سكروز بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يتم نقل الأنسجة إلى 30٪ من السكروز وتحضنها مرة أخرى بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. ثم توضع الأنسجة في ثلاجة 80 درجة مئوية تحت الصفر وتخزن حتى الاستخدام باستخدام أمعاء ناظمة 20 ميكرون.

يتم نقل المقاطع العرضية إلى الشرائح الخشبية ، وإجراءات الحجب والتلوين المناعي. باستخدام الأجسام المضادة لبيتا الثلاثة توبولين وأنتيفا سينوكلين ثم يتم إجراؤها. يوصى بأن يقوم شخص خارجي بإجراء تحليل أعمى للبيانات.

لبدء التحليل ، افتح برنامج فيجي. افتح ملف الصورة متحد البؤر. ثم قم بتقسيم القنوات بحيث يمكن العمل على كل قناة بشكل مستقل.

أغلق تلك القنوات التي لن يتم استخدامها وحدد حجم البكسل وتحليله وتعيينه وقم بقياسه وتعيينه إلى واحد. اضبط المسافة المعروفة على 0.13 وانقر فوق عمومي. سيظهر حجم الصورة الآن بالميكرون.

حدد قناة ألفا سينوكلين وحدد العقدة. تأكد من أن الاختيار يحيط بالعقدة في جميع الشرائح. قم بتكرار الصورة مع تحديد العقدة فقط صورة بحجم العقدة سيتم تكرارها.

اضغط على تحرير واضح خارج جزء الصورة خارج المنطقة المحددة سيصبح أسود. قم بتكرار الصورة مرة أخرى لتحديد مدى جودة سير الإجراء. لا ينبغي استخدام الصور ذات نسبة ضوضاء الإشارة إلى الخلفية منخفضة لتحليل الصور.

حدد عتبة ضبط الصورة. ثم حدد أقصى إنتروبيا. ثم حرك فوق الشرائح الموجودة في الصورة المقصوصة والصورة الأصلية للتأكد من أن الإجراء سار على ما يرام.

تحدد العتبة الاستوائية مستوى إشارة شدة بناء على الرسم البياني للصورة ، وسيتم عرض وحدات البكسل ذات الشدة الأعلى من هذه العتبة فقط في عملية تحديد صورة بيضاء فوق سوداء. ثم انقر فوق السلس. تقوم هذه الخطوة بتحويل الحواف المنقطة للصور إلى عملية تحديد حواف ناعمة.

ثم انقر فوق ثنائي واختر Make binary. سيتم عرض الصورة كصورة مكررة باللون الأسود فوق الأبيض لتنفيذ الخطوة التالية على الصورة المكررة ، انقر فوق تحليل ، تحليل الجسيمات. ثم حدد إظهار الخطوط العريضة وانقر فوق تلخيص.

يجب ترك باقي الإعداد افتراضيا. تتعرف هذه الوظيفة على العدد الإجمالي لوحدات البكسل ذات الإشارة وتلك التي يتم تجميعها معا السطح الكلي للبكسل مع الإشارة. بالإضافة إلى عدد مجموعات وحدات البكسل ومتوسط الحجم يتم الإبلاغ عنه.

قارن وحدد الشريحة ذات المساحة الإجمالية الأكبر التي يتم ضبطها جيدا. سيتم وضع علامة على الشريحة. انسخ جدول البيانات مع إجمالي سطح ألفا سينوكلين وعدد الشوائب ومتوسط حجم الجسيمات.

الصق البيانات في جدول بيانات Excel أو التعليقات التوضيحية في مكان آخر. العودة إلى فيجي. ابحث عن الشريحة المحددة السابقة في قناة بيتا توبولين وحددها.

حدد منطقة العقدة وانقر فوق تحليل. ثم حدد قياس. سيظهر جدول آخر يوضح السطح الكلي للعقدة.

استخرج البيانات من الجدول إلى جدول بيانات Excel بالقرب من قياس ألفا سينوكلين أو انسخها في مكان آخر باستخدام Excel. قسم المعلمات المختلفة التي تم الحصول عليها في قياس ألفا سينوكلين على سطح العقدة للحصول على إجمالي سطح ألفا سينوكلين ورقم التضمين الذي تم تطبيعه حسب حجم العقدة من أجل تحليل تأثيرات الرون الذي يعمل محليا على الجهاز العصبي المعوي ، خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام من تعفن المبيد المعروف تم إعطاؤه عن طريق التزقيم الفموي لستة فئران سوداء تبلغ من العمر عاما واحدا. يظهر الكروماتوجرام الموضح هنا وجود ذروة روتان معروفة بعد ساعة واحدة من التحكم في الإعطاء الفئران المعالجة ب 20 ملليغرام لكل كيلوغرام من الروتينون 10 وخمسة ملليغرام لكل كيلوغرام من الروتينون.

تم تحديد مستويات Rotenone لاستخراج الدم والدماغ وجذع الدماغ بواسطة HPLC كما هو موضح هنا. لا يؤدي إعطاء خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام من التزقيم الفموي إلى مستويات قابلة للقياس في الدم بعد ساعة أو ساعتين أو ثلاث ساعات من العلاج على النحو الذي يحدده H plc. يوضح هذا الرسم مستويات العفن في الدماغ وجذع الدماغ للفئران المعالجة.

بعد ساعة واحدة من استخراج إعطاء 10 ملليغرام لكل كيلوغرام أو أقل من روتينوني يظهر ، لا توجد مستويات روتون في عينات الدماغ أو جذع الدماغ. بعد ساعة واحدة من إعطاء مجمع الميتوكوندريا ، تم تقييم نشاط واحد في عينات العضلات والدماغ للفئران المعالجة لمدة 1.5 شهر. لا يوجد فرق كبير بين المجموعات التي تظهر عدم وجود تثبيط لمركب الميتوكوندريا ، مما يؤكد عدم وجود رون في هذه المناطق.

يسمح تحليل مرض باركنسون ، ومكون جسم ليوي ألفا سينوكلين بعد إعطاء الرون بتحديد موثوق به لكمية السطح الإجمالية لألفا سينوكلين ، ووجود شوائب ألفا سينوكلين ، ونمط ألفا سينوكلين في الخلية. يوضح هذا الشكل تلطيخ مضاد بيتا ثلاثة توبولين ، ألفا سينوكلين ، وتلوين DAPI في أقسام الاثني عشر والدقاق كما يتضح هنا. 1.5 شهر العلاج مع الصراصير المعروف تسبب في زيادة نمط ثقب ألفا سينوكلين داخل عقد الجهاز العصبي المعوي ، حتى واحدة مقارنة بثلاثة أشهر من الضوابط.

يمكن رؤية هذا النمط في كل من الدقاق والاثني عشر. بعد ثلاثة أشهر من تكوين العلاج لشوائب ألفا سينوكلين أكبر يمكن رؤية تلطيخ الفلورسنت المناعي باستخدام سينوكلين ألفا المضاد ، و theof ، و flavin ، و DPI يوضح تجميع تراكم تراكم ألفا سينوكلين أكبر فقط في ثلاثة أشهر. تم تحليل هذه التجربة باستخدام طرق التجزئة التلقائية والعتبة القائمة على الانتروبيا.

في الرسم البياني الموجود على اليسار ، يمثل كل عمود إجمالي سطح ألفا سينوكلين إلى سطح العقدة. في الرسم البياني الموجود على اليمين ، يمثل كل عمود العدد الإجمالي لشوائب ألفا سينوكلين لكل سطح عقدي مأخوذ. تشير هذه البيانات معا إلى أن الإدارة المحلية للروتينون تحفز فسفرة ألفا سينوكلين وتراكمه وتجميعه مع الدبقة في عقد الجهاز العصبي المعوي بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في دقيقة واحدة لكل إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إدخال التزقيم برفق ، وإذا تم العثور على أي عقبات ، فمن الأفضل إخراجها وإدخالها مرة أخرى باتباع هذه الإجراءات. يمكن إجراء طرق أخرى مثل HPLC والبقع المناعية وتحليل الصور. سيمكن ذلك من تحليل المناطق الأخرى ، أو تأثيرات المادة ، أو حتى وجود المادة في الدم بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء الأعصاب للتحقيق في آثار السموم العصبية البيئية على الجهاز العصبي المعوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على تطبيق المقياس بشكل صحيح وتحليل الصور التي تأتي من الكيمياء المناعية. لا تنس أن العمل مع الفاسد يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

لذلك ، نوصي باستخدام القفازات والأقنعة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. ال.