Name: الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: اكتشف طريقة إعطاء مبيدات الآفات عبر التجريع الفموي لدراسة تراكم ألفا-سينوكليين في الجهاز العصبي المعوي لدى الفئران. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم آليات مرض باركنسون.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

دعمت باري بيدرو دي لا مازا المؤسسة هذا العمل.

1) الإدارة من داخل المعدة روتنون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الحجم الكلي للروتينون / مركبة الحل المطلوب. في هذه الحالة 0.01 مل جرام من وزن الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهمة حقنة 1 مل مع حجم المحسوبة سابقا من حل روتينون (0.625 ملغ / مل روتينون ، كربوكسي ميثيل سلولوز 4 ٪ و 1.25 ٪ كلوروفورم) أو حل السيارة (كربوكسي ميثيل سلولوز 4 ٪ و 1.25 ٪ كلوروفورم). في هذه الحالة كان مطابقا لجرعة روتينون 5 ملغم / كغم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الماوس ، وعقد ذيل الفأر مع يد واحدة ، وتمتد على جلد الرقبة بسحبه مع أصابع الأولين من جهة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ثابتة الرأس بين أصابع اثنين العجاف ضد كف اليد وتحويلها رأسا على عقب. الإصلاح الذيل باستخدام الأصابع الرابع والخامس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الرأس نحو الظهر ، اضغط على الحنك لفتح فم الفأر. أعرض بلطف بالتزقيم في الفم. من المهم استخدام إبرة بالتزقيم وليس إبرة العادية. ببطء ، نقل بالتزقيم في اتجاه المعدة بعيدا بما فيه الكفاية. هذا سوف تجنب الحصول على المواد في الرئتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة حل روتينون أو مركبة بالضغط بلطف صمة. عند الانتهاء ، استخراج ببطء تسمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ظهر الحيوان في قفص آخر حتى تتم جميع الحيوانات من القفص. </li></ol> إجراءات Immunostaining 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج ، وتخدير الفئران باستخدام Ketamin 100 ملغم / كغم اوند Xylazin IP 10 ملغم / كغم وperfused intracardially لامتصاص العرق مع 4 ٪ في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم استخراج الشجاعة من قبل التشريح ، ووضعها في السكروز 15 ٪ بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يتم نقل الأنسجة لالسكروز 30 ٪ وحضنت مرة أخرى بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم وضع النسيج في تك النسيج وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ناظم البرد ، يتم نقل 20 ميكرون الأمعاء المقاطع العرضية على الشرائح Superfrost. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحجب وimmunostaining الإجراءات باستخدام أضداد βIII - تويولين ومعاداة synuclein ألفا ، ثم يتم تنفيذها كما هو موضح سابقا 9. </li></ol> 3) تحليل صورة الفا synuclein إدراج فمن المستحسن أن يجهل شخص خارجي المنشأ الصور 'ينفذ التحليل. لذا ، ينبغي تدوين البيانات. أجري تحليل الصور باستخدام برنامج فيجي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف صورة مبائر. ثم ، وتقسيم القنوات بحيث يكون من الممكن العمل على كل قناة بشكل مستقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق هذه القنوات التي لن يكون استخدام وحدد تحليل&gt; ضبط مقياس وتعيين حجم بكسل إلى 1. تعيين المسافة المعروفة إلى 0.13 (وهذا يتوقف على الهدف والقرار المستخدمة) وانقر على الصعيد العالمي. سيتم الآن حجم الصورة ستكون معروضة في ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد قناة ألفا synuclein وحدد العقدة ، تأكد من أن اختيار يرفق العقدة في جميع الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط&gt; صورة مكررة لتكرار الصورة. مع العقدة المحددة ، ولن يكون صورة مكررة من حجم العقدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصحافة تحرير&gt; خارج صافية. سيكون جزء من الصورة خارج المنطقة المحددة تصبح سوداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الصورة مرة أخرى لتحديد الخطوات في وقت لاحق مدى الإجراء ذهب. لا ينبغي أن الصور التي تحتوي على إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء الخلفية لاستخدامها في تحليل الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر صورة&gt; عتبة&gt; ضبط ثم حدد MaxEntropy. ثم تنتقل عبر الشرائح في صورة اقتصاص ونسخة أصلية واحدة لضمان أن الإجراءات سارت على ما يرام. عتبة التدهور الحتمي تحديد مستوى كثافة إشارة على أساس الصورة والرسم البياني فقط تلك بكسل مع سيتم عرض كثافات أعلى من هذه العتبة في أكثر من صورة سوداء بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عملية ، ثم انقر على السلس. هذه الخطوة تحول الحواف pixeled الصور في حواف ناعمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عملية ، ثم انقر على الثنائي ، وجعل اختيار الثنائي. سيتم عرض صورته كرجل أسود على صورة بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة مكررة لتنفيذ الخطوة التالية على الصورة تتكرر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على تحليل&gt; تحليل الجزيئات. ثم حدد عرض : الخطوط العريضة وانقر على تلخيص. يجب أن يكون بقية الأوراق في إعدادات الافتراضية. تسلم هذه الوظيفة العدد الإجمالي للبكسل مع إشارة وتلك التي يتم تجميعها معا. وذكرت والسطحية مجموعه بكسل مع الإشارة بالإضافة إلى عدد من مجموعات من بكسل وحجم متوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن وحدد أكبر شريحة أن يضبط بشكل جيد. وسيتم وضع علامة على شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسخ جدول البيانات مع سطح ألفا synuclein إجمالي عدد الادراج وحجم الجسيمات يعني. لصق البيانات في جداول اكسل أو المشروح في أماكن أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى فيجي والعثور على شريحة المحددة سابقا في قناة β - تويولين ، وتحديده. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد منطقة العقدة وانقر على تحليل ثم حدد التدبير. وسوف يظهر جدول آخر يبينمجموع سطح العقدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البيانات من الجدول إلى ورقة التفوق بالقرب من قياس ألفا synuclein أو نسخ عليه في أماكن أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إكسل ، تقسيم معلمات مختلفة تم الحصول عليها في قياس ألفا synuclein من عقدة للحصول على سطح إجمالي عدد السطحية وإدراج ألفا synuclein تطبيع حسب حجم العقدة. </li></ol> نتائج الممثل 4) عندما يتم تنفيذ بروتوكول إدارة بالتزقيم صحيح مضايقات للحيوان ضئيلة. العلاج باستخدام هذا التركيز من روتينون تمكن من التأثير المحلي روتينون على ENS دون مستويات روتينون في الدم وتثبيط أي مجمع العضلات أو الدماغ الميتوكوندريا أنا حتى بعد 1.5 شهر من العلاج (انظر الشكل 1) إذا أجري تحليل الصور بشكل صحيح وينبغي إجراء تحليل دقيق للنمط ألفا synuclein يكون ممكنا. انه يعطي بيانات موثوقة عن المبلغ الإجمالي للsynuclein ألفا (سطح الإجمالي) ، ألفا synuclein نمط في الخلية (عدد الادراج) وجود شوائب synuclein ألفا (حجم مضمن) (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. علاج الخلل في المحرك روتينون الفئران دون الكشف عن روتينون في الدم أو الجهاز العصبي المركزي. قياسي ، (50 نانوغرام / مل) وchromatogram من عينات دماغ الفئران ملغم / كغم من 20 ، 10 و 5 المعالجة. B و C ، وتحديد مستويات روتينون في الدم (B) والجهاز العصبي المركزي (C). باء ، ومستويات الدم 1 و 2 و 3 ساعات بعد تلقي العلاج. وقسمت الفئران إلى ثلاث مجموعات (ن = 3) وتعامل مع 2.5 و 10 و 5 و 20 ملغم / كغم روتينون (ن = 3) ، تم استخراج 300 ميكرولتر من الدم 1 و 2 و 3 ساعات بعد تناوله روتينون والمجمعة معا من أجل HPLC تحليل جيم ، عولجت فئران لمدة أسبوع مرة واحدة في اليوم مع 5 (ن = 3) ، 10 (ن = 3) و 20 (ن = 1) ملغم / كغم انتزعت روتينون والمخ والدماغ 1 و 2 بعد ساعات مشاركة الإدارة والتطوير التي أعدت لهبلك. التحليل ، وأنا مجمع الميتوكوندريا النشاط في الدماغ والعضلات عينات من الفئران التي عولجت 1.5 شهر. <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. روتينون تدار محليا يدفع ألفا synuclein الفسفرة ، وتراكم والتجميع مع دباق في العقد ENS (الحانات نطاق 20 ميكرون). A ، B ، C ، ومكافحة βIII - تويولين ألفا synuclein وتلوين دابي في العفج (B) والدقاق ( A ، C) المقاطع. السهم في باء ، 1.5 شهر يسببها العلاج منها زيادة ألفا synuclein نمط نقطي داخل الجهاز العصبي المعوي العقد بالمقارنة مع الضوابط 3 أشهر (A). السهم في C ، و 3 أشهر من تشكيل يسببها العلاج مشتملات أكبر ألفا synuclein (س&gt; 6 ميكرون). D ، تلوين المناعي استخدام الألغام المضادة للsynuclein ألفا ، S ثيوفلافين ودابي. السهم في التطوير ، فقط لمدة 3 أشهر وأظهرت الفئران التي عولجت هذه التراكمات تجميع أكبر ألفا synuclein. E ، E '، E'' التحليل الكمي صورة الخطوات. E ، immunostained مثال الصورة المستخدمة في القياس الكمي مبديا العقدة ENS ضد synuclein ألفا تظهر مشتملات مختلفة. E '، مثال على صورة تم الحصول عليها بعد بروتوكول تحليل الصور. E'' ، التداخل بين بعض الادراج الأصلي (الأخضر) ، والحصول على تمثيل بعد تنفيذ البروتوكول (الخطوط الصفراء). FG ، القياس الكمي لهذه التجربة هو مبين في وقدم ميلان باستخدام التجزئة التلقائية وطرق thresholding الكون مقرا لها. واحد النجمة ، P &lt;0.05 ، ومضاعفة النجمة ، P &lt;0.01. F ، كل عمود يمثل مجموع ألفا synuclein سطح / سطح العقدة. G ، كل عمود يمثل مجموع عدد ألفا synuclein مشتملات / سطح العقدة. كل الرسوم البيانية تظهر يعني ± SEM

<ol><li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li>
<li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li>
<li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+lesions+in+dorsal+horn+layer+I%2C+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li>
<li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+development+of+Parkinson%27s+disease-related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li>
<li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+Parkinson%27s+disease+with+exposure+to+pesticides%2C+farming%2C+well+water%2C+and+rural+living%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li>
<li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li>
<li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li>
<li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Parkinson%27s+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li>
<li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li>
<li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li>
<li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate%2C+a+chemical+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li>
</ol>

فرانسيسكو عموم Montojo لديه طلب البراءة في انتظار لهذا النموذج الحيواني (رقم الطلب معاهدة التعاون بشأن البراءات / EP 2009/005688).

وقد تم داخل المعدة الادارة تؤديها سابقا 12. ومع ذلك ، وفقا لمخطوطة Inden ، وكانت تدار روتينون المذابة في 0.5 ٪ كربوكسي ميثيل سلولوز ملح الصوديوم (نظم إدارة المحتوى) وحدها. روتينون هو مادة عالية liphophylic. لذا ، لا يمكن أن يتم حله في روتينون نظم إدارة المحتوى وحدها 0.5 ٪ ، وسوف يعجل إذا فعلت ذلك. استخدام الكلوروفورم يخلق تعليق روتينون موزعة بالتساوي تجنب الأمطار. وعلاوة على ذلك ، ويرجع ذلك إلى ارتفاع تركيزات المبيدات في نظم إدارة المحتوى ، كما هو الحجم النهائي للحل تدي...

<table><tbody><tr><td>روتينون (Rotenone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>ألمانيا</td></tr><tr><td>كلوروفورم</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>ألمانيا</td></tr><tr><td>كربوكسي ميثيل سلولوز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td>ألمانيا</td></tr><tr><td>أنبوب تغذية قسري 1,2 مم × 60 مم</td><td>Unimed</td><td></td><td>سويسرا</td></tr><tr><td>LSM 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://pacific.mpi-cbg.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

في مرضى باركنسون (PD) المرض ، وعلم الأمراض المرتبطة يتبع نمطا مميزة تشمل في جملة أمور على الجهاز العصبي المعوي (ENS) 1،2 ، والبصلة الشمية (OB) ، النواة الحركية الظهرية من 3 (DMV) المبهم ، والمتوسطي 4 نواة الحبل الشوكي ، والمادة السوداء ، وتوفير الأساس لانطلاق neuropathological من المرض 4،5. وENS وOB هم الأكثر تعرضا للهياكل العصبي ومنها أول من يتأثر. ومن المثير للاهتمام ، وقد ارتبط التعرض للمبيدات لPD 6-8. هنا نعرض بالتفصيل طريقتين المستخدمة في دراستنا السابقة 9. من أجل تحليل آثار روتينون تعمل محليا على ENS ، ونحن يديرها روتينون باستخدام أنبوب تغذية لمدة عام واحد الفئران C57/BL6 القديمة. روتينون هو المبيدات المستخدمة على نطاق واسع أن يكبح بقوة مجمع الميتوكوندريا أنا 10. فمن lipophylic للغاية ، واستوعبت ضعيفا في الجهاز الهضمي 11. وأظهرت نتائجنا ان الادارة من 5 ملغم / كغم من روتينون لم تمنع مجمع الميتوكوندريا أنا النشاط في العضلات أو الدماغ. وهكذا ، مما يشير إلى أن استخدام أسلوب الإدارة لدينا روتينون لم يعبر النظام كبدي بوابي وكان يتصرف فقط على ENS. هنا نعرض طريقة لإدارة مبيدات الآفات باستخدام بالتزقيم وبروتوكول تحليل الصور المستخدمة لتحليل آثار المبيدات في تراكم synuclein ألفا في ENS. الجزء الأول يوضح طريقة تسمح إدارة المبيدات داخل المعدة (روتينون) في تركيز دقيق المطلوب. الأسلوب الثاني يظهر تحليل الصور شبه التلقائي لتحليل بروتوكول ألفا synuclein تراكم في ENS باستخدام برمجيات تحليل الصور.

وقد ارتبط مرض باركنسون إلى التعرض للمبيدات الحشرية. هنا نعرض طريقة لتقديم المبيدات الحشرية باستخدام أنبوب إلى المعدة في التركيز المطلوب وطريقة لتحليل أثرها في تراكم synuclein ألفا في الجهاز العصبي المعوي.

تتبع الباثولوجيا المرتبطة بمرض باركنسون (PD) لدى المرضى نمطاً مميزاً يشمل، من بين أمور أخرى، الجهاز العصبي المعوي (ENS) 1,2، ...

تنتج أعراض مرض باركنسون، بما في ذلك خلل الوظائف الحركية والنطق، عن انخفاض نشاط الخلايا المفرزة للدوبامين في الدماغ. ويُعد الجهاز العصبي المعوي والبصلة الشمية من أكثر البنى العصبية عرضة للتأثر، وأولها تأثراً. وقد تم ربط مرض باركنسون بالتعرض للمبيدات الحشرية.من أجل تحليل تأثيرات المبيدات الحشرية على الجهاز العصبي المعوي، يتم إعطاء مبيد الروون للفئران عن طريق التغذية القسرية الفموية. ثم يتم إجراء تروية قلبية للفئران باستخدام بارافورمالدهيد بتركيز 4% للدماغ والجهاز العصبي المعوي. بعد ذلك، يتم استخلاص الأنسجة وتحضيرها وإجراء صبغ مناعي لها للكشف عن البروتينات المرتبطة بمرض باركنسون.تظهر صور بيتا ثلاثة توبولين وألفا سينوكلين التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر البؤري تراكم ألفا سينوكلين داخل عصبونات الجهاز العصبي المعوي في الحيوانات المعرضة للمبيدات الحشرية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الإعطاء الجهازي لـ rotenone، في أنها تضمن حصر تأثير rotenone في الجهاز العصبي المعوي. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول مرض باركنسون، مثل مسببات المرض والآليات الكامنة وراء تطوره.تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج وتشخيص مرض باركنسون لأنها ستسمح بتطوير أهداف علاجية وطرق تشخيصية جديدة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة في الفيزيولوجيا المرضية لمرض باركنسون، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل دراسة تأثير السموم البيئية الأخرى على الجهاز العصبي المعوي والسمبثاوي والباراسمبثاوي، بالإضافة إلى جدار الأمعاء. وبشكل عام، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطرق صعوبة لأن إتقان عملية التغذية القسرية (gavage) يستغرق بعض الوقت.خطرت لي فكرة هذه الطرق لأول مرة عندما قرأت عن الارتباط بين المبيدات الحشرية ومرض باركنسون. كما كان من المفيد حضور مؤتمر CORAs رفيع المستوى في المؤتمر العالمي لمرض باركنسون في برلين عام 2005. ومن الضروري تقديم عرض توضيحي هادئ لهذه الطريقة.تعتبر طريقة إعطاء ol عن طريق التغذية القسرية صعبة نظراً لأن الفئران تمتلك تشريحاً مختلفاً عن البشر، ومن ناحية أخرى، تم إجراء تحليل الصور بخطوات مخصصة لهذه الصور. ابدأ البروتوكول بوزن الحيوان، ثم احسب الحجم المناسب من rotenone.يلزم 0.01 milliliters لكل جرام من وزن الحيوان، وهو ما يعادل جرعة 5 milligram لكل kilogram من الـ roone. املأ حقنة سعة 1 milliliter بمحلول roone، ثم املأ حقنة ثانية بمحلول الناقل. أمسك الفأر مع تثبيت ذيله بإحدى اليدين.قم بشد جلد الرقبة عن طريق سحبه باستخدام الإصبعين الأولين من اليد الأخرى. وبمجرد تثبيت الرأس بين الإصبعين، أسنده إلى راحة اليد وأدره رأساً على عقب. ثم قم بتثبيت الذيل.باستخدام الإصبعين الرابع والخامس، ومع إبقاء الرأس مائلاً إلى الخلف، اضغط على الحنك لفتح فم الفأر. أدخل أنبوب التغذية القسري (gavage) برفق في الفم. حرك الأنبوب ببطء في اتجاه المعدة حتى يتم إدخاله بكامل طوله.لتجنب وصول المادة إلى الرئتين، قم بإعطاء محلول الروون أو المادة الناقلة عن طريق الضغط برفق على السدادة. عند الانتهاء، اسحب أنبوب التغذية القسري ببطء، وأعد الحيوان إلى قفص آخر حتى يتم الانتهاء من جميع الحيوانات في القفص الواحد. بعد العلاج، تخضع الفئران لعملية تروية قلبية باستخدام 4%paraform aldehyde.في محلول PBS، يتم استخراج الأمعاء عن طريق التشريح ثم توضع في محلول sucrose بتركيز 15% طوال الليل. وفي اليوم التالي، تُنقل الأنسجة إلى محلول sucrose بتركيز 30% وتُحضن مرة أخرى طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، توضع الأنسجة في مجمد بدرجة حرارة -80 °C وتُخزن حتى وقت الاستخدام، ثم تُقطع عينات من الأمعاء بسمك 20 micron باستخدام جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat).تُنقل المقاطع العرضية إلى شرائح روت، ثم تُجرى إجراءات الحجب والصبغ المناعي. بعد ذلك، يتم استخدام أجسام مضادة لـ beta three tubulin و Antifa synuclein. ويُوصى بأن يقوم شخص خارجي بإجراء تحليل أعمى للبيانات.لبدء التحليل، افتح برنامج Fiji. افتح ملف الصورة المجهرية بؤرية المسافة (confocal). بعد ذلك، قم بفصل القنوات حتى يكون من الممكن العمل على كل قناة بشكل مستقل.أغلق القنوات التي لن يتم استخدامها، ثم اختر analyze، وset، وscale، واضبط حجم البكسل (pixel size) على واحد. اضبط المسافة المعروفة (known distance) على 0.13 وانقر على global. سيظهر حجم الصورة الآن بالميكرونات.حدد قناة alpha synuclein ثم اختر العقدة العصبية، مع التأكد من أن التحديد يشمل العقدة العصبية في جميع المقاطع. قم بتكرار الصورة مع تحديد العقدة العصبية فقط، حيث سيتم تكرار صورة بحجم العقدة العصبية.اضغط على تحرير المسح (edit clear)، وسيصبح جزء الصورة الواقع خارج المنطقة المحددة باللون الأسود. كرر عملية مضاعفة الصورة مرة أخرى لتقييم مدى نجاح الإجراء. لا ينبغي استخدام الصور التي تعاني من انخفاض نسبة الإشارة إلى ضجيج الخلفية في تحليل الصور.اختر "image adjust threshold"، ثم اختر "max entropy". بعد ذلك، تصفح المقاطع في الصورة المقصوصة والصورة الأصلية للتأكد من إتمام الإجراء بشكل صحيح.تحدد عتبة الاستجابة (tropic threshold) مستوى إشارة الكثافة بناءً على المدرج التكراري للصورة، حيث سيتم عرض البكسلات التي تزيد كثافتها عن هذه العتبة فقط في عملية اختيار صورة بيضاء فوق خلفية سوداء. بعد ذلك، انقر على "تنعيم" (smooth). تعمل هذه الخطوة على تحويل الحواف المكسرة للبكسلات في الصور إلى حواف ناعمة في عملية الاختيار.بعد ذلك، انقر على binary واختر Make binary. ستظهر الصورة كصورة سوداء على خلفية بيضاء؛ ولإجراء الخطوة التالية على صورة مكررة، انقر على analyze، ثم analyze particles. بعد ذلك، حدد show outlines وانقر على summarize.يجب ترك بقية الإعدادات على وضعها الافتراضي. تتعرف هذه الوظيفة على العدد الإجمالي للبكسلات التي تحتوي على إشارة وتلك التي تم تجميعها معاً لتمثيل المساحة الكلية للبكسلات ذات الإشارة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم تقرير عن عدد مجموعات البكسلات ومتوسط الحجم.قارن واختر الشريحة ذات المساحة الإجمالية الأكبر التي تظهر ضبطاً جيداً، حيث سيتم تحديد هذه الشريحة. انسخ جدول البيانات الذي يحتوي على إجمالي سطح alpha synuclein وعدد الاشتمالات ومتوسط حجم الجسيمات.قم بلصق البيانات في جدول بيانات Excel أو تدوينها في مكان آخر. عُد إلى برنامج Fiji. حدد الشريحة التي تم اختيارها مسبقاً في قناة beta tubulin وقم بتحديدها.حدد منطقة العقدة العصبية ثم انقر على "analyze". بعد ذلك، اختر "measure". سيظهر جدول آخر يوضح المساحة الكلية للعقدة العصبية.استخرج البيانات من الجدول إلى جدول بيانات Excel بالقرب من قياس alpha synuclein أو انسخها إلى مكان آخر باستخدام Excel. قم بقسمة المعاملات المختلفة التي تم الحصول عليها في قياس alpha synuclein على مساحة العقدة العصبية للحصول على إجمالي مساحة alpha-synuclein وعدد الاشتمالات المعياري وفقاً لحجم العقدة العصبية، وذلك من أجل تحليل تأثيرات rotenone التي تعمل محلياً على الجهاز العصبي المعوي؛ حيث تم إعطاء 5 mg/kg من مبيد rotenone عن طريق التغذية القسرية الفموية لفئران C57BL/6 بعمر سنة واحدة. يظهر المخطط الكروماتوغرافي المعروض هنا وجود قمة rotenone بعد ساعة واحدة من الإعطاء، ومجموعة من الفئران الضابطة التي عولجت بـ 20 mg/kg من rotenone و5 mg/kg من rotenone.تم تحديد مستويات الروتينون في مستخلصات الدم والدماغ وجذع الدماغ باستخدام تقنية HPLC كما هو موضح هنا. إن إعطاء خمسة مليجرامات لكل كيلوجرام من الروتينون عن طريق التغذية القسرية الفموية لا يؤدي إلى مستويات قابلة للقياس في الدم بعد ساعة أو ساعتين أو ثلاث ساعات من العلاج، وفقاً لما تم تحديده بواسطة HPLC. يوضح هذا الرسم البياني مستويات الروتينون في الدماغ وجذع الدماغ للفئران المعالجة.بعد ساعة واحدة من إعطاء 10 مليغرام/كجم أو أقل من الروتينون، لا تظهر أي مستويات للروتينون في عينات الدماغ أو جذع الدماغ. وبعد ساعة واحدة من الإعطاء، تم تقييم نشاط المعقد الميتوكوندري الأول في عينات العضلات والدماغ للفئران المعالجة لمدة 1.5 شهر. لا يوجد فرق معنوي بين المجموعات، مما يشير إلى عدم وجود تثبيط للمعقد الميتوكوندري الأول، وهو ما يؤكد عدم وجود روتينون في هذه المناطق.يتيح تحليل بروتين ألفا-سينوكلين (alpha synuclein)، وهو المكون الأساسي لأجسام ليوي في مرض باركنسون، عقب إعطاء مادة rone، تحديد الكمية الإجمالية لبروتين ألفا-سينوكلين على السطح بشكل موثوق، والتحقق من وجود شوائب ألفا-سينوكلين، ونمط توزيع ألفا-سينوكلين داخل الخلية. يوضح هذا الشكل صبغ anti beta three tubulin، وألفا-سينوكلين، وDAPI في مقاطع من الاثني عشر واللفائفي كما هو موضح هنا. أدى العلاج بمادة roach known لمدة 1.5 شهر إلى زيادة نمط ألفا-سينوكلين النقطي داخل عقد الجهاز العصبي المعوي، مقارنة بمجموعات الضبط لمدة ثلاثة أشهر.يمكن ملاحظة هذا النمط في كل من اللفائفي والاثني عشر. بعد ثلاثة أشهر من العلاج، يمكن رؤية تكوين شوائب ألفا-سينوكلين أكبر؛ حيث يُظهر الصبغ المناعي الفلوري باستخدام مضادات ألفا-سينوكلين، وtheof، والفلارين، وDPI تجمع تراكمات ألفا-سينوكلين أكبر فقط عند مرور ثلاثة أشهر. تم تحليل هذه التجربة باستخدام طرق التجزئة التلقائية وعتبة التجزئة القائمة على الإنتروبيا.في الرسم البياني الموجود على اليسار، يمثل كل عمود إجمالي سطح alpha synuclein بالنسبة لسطح العقدة العصبية. وفي الرسم البياني الموجود على اليمين، يمثل كل عمود العدد الإجمالي لشوائب alpha synuclein لكل سطح عقدة عصبية تم أخذه. وتشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن الإعطاء الموضعي لـ rotenone يحفز فسفرة alpha synuclein وتراكمه وتجمعه مع حدوث الدباق في عقد الجهاز العصبي المعوي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في دقيقة واحدة لكل حيوان إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إدخال أنبوب التغذية القسري برفق، وفي حال وجود أي عوائق، يفضل إخراجه ثم إعادة إدخاله باتباع هذه الخطوات. كما يمكن إجراء طرق أخرى مثل HPLC، والصبغ المناعي، وتحليل الصور؛ حيث سيسمح ذلك بتحليل مناطق أخرى، أو دراسة تأثيرات المادة، أو حتى الكشف عن وجود المادة في الدم بعد تطورها.مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء الأعصاب لدراسة آثار السموم العصبية البيئية على الجهاز العصبي المعوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على تطبيق المقياس بشكل صحيح وتحليل الصور الناتجة عن الكيمياء النسيجية المناعية. لا تنسَ أن العمل مع المواد المتعفنة قد يكون خطيراً للغاية.لذلك، نوصي باستخدام القفازات والأقنعة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

oral-administration-rotenone-using-gavage-image-analysis-alpha

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يوضح هذا الفيديو حقن ألياف ألفا سينوكلين في الفأر للحث على التهاب الأعصاب. يتم حقن الألياف داخل الصفاق في فأر معدل وراثيا يعبر عن بروتينات ألفا سينوكلين الطافرة. عند الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي ، تدخل الألياف الخلايا العصبية وتحفز تراكم البروتينات الطافرة. تنتشر الركام إلى الخلايا العصبية المجاورة والخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية. يؤدي التعرف على المجاميع إلى تحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة للحث على التهاب الأعصاب ، مما يؤدي إلى إتلاف الخلايا العصبية.

تحريض الالتهاب العصبي في الفئران عن طريق حقن ألياف ألفا سينوكلين

يتم وصف ELISA يقدم نهجًا كميًا جديدًا. إنه يكشف بشكل خاص عن α-synuclein المرتبط بالمرض (αSD) في نموذج الفأر المعدّل وراثيًا (M83) من synucleinopathy باستخدام عدة أجسام مضادة إما لشكل αS المصلّب في Ser129 أو الجزء C- الطرفي من البروتين.

الكشف عن الأمراض المرتبطة α-synuclein التي كتبها المحسن ELISA في دماغ الفئران المعدلة وراثيا Overexpressing A53T الإنسان تحور α-synuclein

تصف هذه المخطوطة كيف يوفر توصيل الجينات المحلية بوساطة النواقل الفيروسية طريقة جذابة للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا في الجهاز العصبي المركزي.  يحدد البروتوكول جميع الخطوات الحاسمة لإجراء حقن ناقل فيروسي في المادة السوداء للفئران لتطوير نموذج حيواني قائم على النواقل الفيروسية لمرض باركنسون.

تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة

حقن الطرفية من الألياف، synuclein ألفا في الصفاق أو اللسان من تيراغرام (M83 +/-: GFAP -luc +/-) الفئران، التي تعبر عن الإنسان ألفا synuclein مع الطفرة A53T العائلية واليراع وسيفيراز، يمكن أن تحفز الأعصاب، بما في ذلك neuroinflammation في الجهاز العصبي المركزي الخاصة بهم.

التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف

هنا نقدم طريقة آلية لتحديد شبه كمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين في الجرذ substantia nigra pars compacta.

تحديد شبه كمي لكثافة الخلايا العصبية الدوبامين في Substantia Nigra من نماذج القوارض باستخدام تحليل الصورة الآلي

في هذه المقالة, نعرض كيفية استخدام نظام تسجيل النقاط السبع لقياس التغييرات التي تطرأ باستمرار على مورفولوجيا الخلايا العصبية الدوبامين في C. elegans. ويهدف هذا النظام لتحليلات المقايسات التنكس العصبي الدوبامين باستخدام النماذج الوراثية والكيميائية والعمرية من الاضطرابات العصبية.

تحديد مستويات الدوبامين الخلايا العصبية التغيير المورفولوجي وانحطاط في Caenorhabditis elegans

يحلل هذا العمل جرعة الناقل ووقت التعرض اللازم للحث على التهاب الأعصاب والتنكس العصبي والإعاقة الحركية في هذا النموذج قبل السريري لمرض باركنسون. يتم تسليم هذه النواقل التي تشفر α-سينوكلين البشري إلى المادة السوداء لتلخيص أمراض سينوكلين المرتبطة بمرض باركنسون.

تحليل نموذج فأر مرض باركنسون الناجم عن ناقلات الفيروسات المرتبطة بالأدينو التي تشفر α-سينوكلين البشري

يتم تقديم طريقة تروية مريحة تتغذى على الجاذبية للتحليل النسيجي للجهاز العصبي المركزي للفأر. يظهر الكشف عن الفلورسنت المناعي α-سينوكلين المفسفرة في نموذج فأر لمرض باركنسون. يصف هذا العمل أيضا بشكل شامل التروية عبر القلب ، والتشريح ، وتجميد / تضمين الأنسجة ، وخطوات التقسيم المجمدة.

طريقة تروية عبر القلب تتغذى على الجاذبية للتحليل النسيجي للجهاز العصبي المركزي للفأر

يصف البروتوكول الحالي طريقة للإعطاء داخل الأنف لمجاميع α-synuclein. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة حول انتشار α سينوكلين من الغشاء المخاطي الشمي إلى البصلة الشمية في مرض باركنسون.

تقنية الإعطاء داخل الأنف لمجاميع α-Synuclein

توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين في E14.5 في الفئران. علينا أن نبين أن هذا هو وسيلة قيمة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

اكتشف طريقة إعطاء مبيدات الآفات عبر التجريع الفموي لدراسة تراكم ألفا-سينوكليين في الجهاز العصبي المعوي لدى الفئران. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم آليات مرض باركنسون.

الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

استكشف المزيد من الفيديوهات