غراميسيدين القائم على الفحص الإسفار ؛ لتحديد الجزيئات الصغيرة المحتملة لتعديل خصائص طبقة ثنائية الدهن

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات التي تسببها الأدوية في خصائص الطبقة المزدوجة كما تستشعرها البروتينات الممتدة عبر الطبقة المزدوجة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير حويصلات أحادية الطبقة كبيرة الحجم ومحملة بـ Fluor. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تطعيم الحويصلات بـ gramin.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إضافة مُخمد خارجي وقياس معدل إخماد الفلوروفور الداخلي. رابعاً، تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحديد كمية التغير في إخماد الفلوروفور لكل نشاط غراميسين عن طريق تطبيق دالة أسية ممددة على المخطط الزمني للفلورة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج لتقييم ما إذا كانت الببتيدات الأمفيفيلية قادرة على تغيير خصائص الطبقة الثنائية الدهنية.

مرحباً، أنا أولا أندرسون. مرحباً، أنا هيلسون. مرحباً، أنا ريتشي كابو.

أنا ليا سانفورد من مختبر الدكتور أولاف أندرسون في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في كلية وايل كورنيل الطبية. سنعرض لكم اليوم إجراءً لقياس التغيرات في خصائص الطبقة اللبيدية المزدوجة. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تأثيرات العقاقير والجزيئات الصغيرة على خصائص الطبقة اللبيدية المزدوجة.

لنبدأ الآن؛ في اليوم الأول من هذا الإجراء، أخرج الدهون من المجمد واتركها لتتوازن مع درجة حرارة الغرفة. وبمجرد وصولها إلى حالة التوازن، أضف 0.6 milliliters من محلول الدهون والكلوروفورم بتركيز 25 milligrams per milliliter إلى دورق مستدير القاع سعة 25 milliliter. بعد ذلك، جفف المحلول تحت غاز النيتروجين مع تدوير الدورق باستمرار حتى يتبخر كل الكلوروفورم.

وتغطي طبقة بيضاء رقيقة من الدهون النصف السفلي من القارورة بالكامل، جفف الدهون أكثر في مجفف تحت تفريغ هوائي طوال الليل. حضّر محلولاً يحتوي على 100 millimolar من نترات الصوديوم، و25 millimolar من ANTS، و10 millimolar من HEPs بدرجة pH Seven. عند ضبط درجة pH لهذا المحلول، تجنب استخدام أي محاليل تحتوي على الكلوريد.

بما أن المطفئ thallium يشكل معقداً غير قابل للذوبان مع الكلوريد في اليوم الثاني، قم بإعادة ترطيب الدهون باستخدام 1.67 مل من محلول الإلكتروليت هذا للحصول على معلق دهني بتركيز 10 millimolar. وبمجرد الوصول إلى التركيز الصحيح، قم بالتغطية باستخدام para film وقم بخلط المعلق بجهاز vortex جيداً، ثم احمِ العينة من الضوء باستخدام ورق القصدير واتركها لتتقادم في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

في اليوم الثالث، قم بإجراء سونكة (sonication) للمزيج لمدة دقيقة واحدة باستخدام جهاز سونكة منخفض الطاقة. بعد ذلك، قم بإجراء دورات تجميد وإذابة للعينة بوضعها على الثلج الجاف لمدة خمس دقائق، تليها خمس دقائق في ماء دافئ، مع تكرار دورة التجميد والإذابة من أربع إلى خمس مرات. ثم قم ببثق معلق الدهون باستخدام جهاز Avanti mini extruder.

قم بتجهيز الباسق الصغير (mini extruder) باستخدام مرشح بولي كربونات بمسامية 0.1 ميكرون ودعامات للمرشح، ثم قم ببثق المعلق ذهاباً وإياباً 21 مرة حتى ينتهي الأمر بمعلق شبه شفاف في المحقنة المقابلة، مما ينتج عنه معلق من الحويصلات أحادية الطبقة الكبيرة (LUV). تخلص من المواد غير المرتبطة (external A NTS) عن طريق تمرير المعلق المبثوق عبر عمود فصل PD 10 تم موازنته مسبقاً بمحلول صوديوم منظم. أضف 1.5 مل من معلق LUV بالإضافة إلى 1 مل من محلول الصوديوم المنظم إلى العمود.

بعد دمج المحلول بالكامل في العمود، قم بشطف الليبوزومات باستخدام ثلاثة ملليلتر من منظم الصوديوم واجمع السائل الشطفي. يجب أن يحتوي محلول مخزون LUV المعبأ بـ A NTS الناتج على حوالي أربعة إلى خمسة ميلي مولار من الدهون، ويجب أن يظهر شفافاً أبيض حليبياً.

قم بحماية المحلول من الضوء باستخدام رقائق القصدير واحفظه عند درجة حرارة 13 degrees celsius، وقبل الاستخدام بـ 24 hours، قم بخلطه جيداً باستخدام جهاز vortex. المحلول المخزون من LUV المملوء بـ A NTS. حيث أن UUVs تمتلك كثافة أكبر من 1 g/mL وقد تترسب.

بعد ذلك، يتم تخفيف المحلول المخزون من LUV المملوء بـ A NTS بنسبة 1 إلى 20 باستخدام منظم الصوديوم، ثم تُحضن ثلاثة أرباع الليبوزومات مع 260 nanogram من abidin في DMSO. ويُضاف نفس الحجم من DMSO بدون gramin إلى الربع المتبقي.

للحفاظ على تركيز المذيب ثابتاً في جميع العينات، اترك الجرامين (gramin) ليتوازن بين الطبقتين الأحاديتين الداخلية والخارجية للحويصلات الدهنية لمدة 24 ساعة عند 13 degrees Celsius. هنا، يُستخدم مقياس الطيف الفلوري بتدفق متوقف من طراز applied photophysics SX point 20 مع خاصية التحكم في درجة الحرارة لقياس معدل خمود الفلورة. للبدء، قم بتشغيل الأجهزة قبل ساعة من الموعد المحدد للسماح بتسخين الجهاز.

يجب ضبط الشق مع المراسلات للإثارة على 1/1، واستخدام مرشح تمرير عالٍ 455 نانومتر لتسجيل الانبعاث باستخدام برنامج pro data SX. قم بضبط ظروف التسجيل أولاً، ثم اضبط أطوال موجات إثارة الموحد اللون على 352 نانومتر. استخدم إعداد تثبيت الضغط.

اضبط الوقت على ثانية واحدة والنقاط على 5,000. عدل عدد التكرارات إلى تسعة لعمليات تشغيل المحلول المنظم وإلى 13 لعمليات تشغيل المطفئ. راقب درجة الحرارة في ملف تعريف فحص المحرك الخاص ببرنامج Essex.

يجب ضبط حجم الدفع على 120 µL، مما يمزج 60 µL من كل حقنة. يؤدي ذلك إلى زمن ميت يبلغ 1.2 ms تقريباً. اضبط الجهد العالي أو الكسب في كاشف الفلورسنت على حوالي 420 V.

الهدف هو الحصول على قراءة فلورية تبلغ حوالي ثمانية؛ يتم موازنة UUVs المحملة بـ A NTS والمحضرة مسبقاً لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام. وبمجرد تحقيق التوازن، يتم رج العينة باستخدام جهاز vortex، ثم تحميلها في المحقنة اليسرى. وفي المحقنة اليمنى، يتم تحميل إما منظم الصوديوم أو Thallium Quencher.

قم بإزالة أي فقاعات هوائية عن طريق دفع المحاقن ذهاباً وإياباً. يجب تعبئة كلتا المحقنتين بالتساوي. قبل إغلاق الصمامات للعينة الأولى، قم بتسجيل الفلورة باستخدام منظم الصوديوم.

كرر العملية أربع مرات واضبط الكسب حسب الضرورة. ثم كررها خمس مرات إضافية للعينات المتبقية. سجل تسعة تكرارات باستخدام منظم الصوديوم.

استبدل منظم الصوديوم بمخمد الثاليوم وسجل 13 تكراراً. اشطف بالماء وتابع مع ضوابط العينة التالية. قم بتضمين عينات بدون gramin ومع المذيب، وعينات بدون gramin مع أقصى تركيز للمركب.

وبعد إجراء مقايسة الفلورة لكل من الغرامين والمذيب، يتم إدخال البيانات في برنامج MATLAB لتحليلها. وبالنسبة لكل عينة يتم قراءتها من جميع مكررات المنظم والمخمد، ستكون المكررات الأربعة الأولى ملوثة بما كان موجوداً مسبقاً في الأنابيب. وفي هذه الحالة، تأتي الإشارة من اختلاط عينة منظم الصوديوم بالماء من عملية الغسيل السابقة.

تمثل التكرارات من الخامس إلى التاسع الإشارة الخاصة بالعينة وحدها. وبناءً على ذلك، نقوم دائمًا باستبعاد التكرارات الأربعة الأولى في كل حالة. ولتجنب أي شوائب ناتجة عن عملية الخلط، يتم فحص المسارات يدويًا وإزالة أي تكرارات غير صالحة، مثل المسار الأحمر الذي يحتوي على نبضات أو انحرافات ناتجة عن شوائب الخلط أو الفقاعات.

بعد ذلك، قم بتطبيع تكرارات الإخماد (quencher repeats) بالنسبة إلى متوسط القيمة الأولية لتكرارات المنظم (buffer repeats) لكل عينة في كل حالة تجريبية، ثم ادمج متوسطات جميع العينات في رسم بياني واحد؛ حيث يجب أن تكون عينات التصور التي لا تحتوي على gramine متشابهة جميعها وتظهر انعداماً شبه تام لإخماد الفلورية. ويحدث انخفاض بطيء في إشارة الفلورية نتيجة لدخول أيون thallium ببطء إلى الحويصلات في العينات التي تحتوي على gram sidin. وإذا تغير المسار الزمني للفلورية بشكل ملحوظ بفعل المركب، فإن ذلك يعني أن المركب يغير خصائص الطبقة اللبيدية المزدوجة عند التركيز الذي تم اختباره، ثم قم بمطابقة دالة أسية ممتدة (stretched exponential) لأول 2 إلى 100 مللي ثانية من منحنيات إخماد الفلورية المطبعة.

قم بإجراء التكرارات الفردية واحسب المعدل عند ملي ثانية اثنين. ثم احسب المتوسطات والانحرافات المعيارية لعينة معينة من التكرارات الفردية. لوحظ تأثير الكابسيسين، المشار إليه هنا بـ cap، على المسار الزمني لإخماد الفلورة في حالة غياب أو وجود الغرامين المشار إليه بـ ga، حيث تظهر إشارة الفلورة المعيارية هنا على مدى ثانية واحدة. تمثل النقاط الرمادية النتائج من جميع التكرارات بينما تمثل الخطوط الحمراء المتوسطات.

يظهر في الشكل أول 100 milliseconds من إشارة الفلورة المعيارية. تمثل النقاط الرمادية نتائج تكرار واحد لكل حالة. أما الخطوط الحمراء فهي تمثل منحنيات الملاءمة الأسية الممددة (stretched exponential fits) لتلك التكرارات.

يشير الخط الأزرق المتقطع إلى علامة المليثانيتين. وهو الوقت الذي يتم عنده تحديد معدل التخامد. يتم تحديد التغير النسبي في معدل التخامد عن طريق تطبيع البيانات بالنسبة لعينة الضبط التي تحتوي على gramin وبدون مادة معدلة.

عندما يمتص الكابسيسين في الطبقة الدهنية المزدوجة، فإنه يغير من خصائص هذه الطبقة. وسينعكس التغير نحو طبقة مزدوجة أكثر ليونة في شكل إزاحة في جانب الجرام في توازن المونومر والدايمر لصالح الدايمر الموصل. لقد عرضنا لكم للتو إجراءً لقياس تأثيرات الاضطراب التي تحدثها جزيئة صغيرة في الطبقة المزدوجة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام الضوابط المناسبة لكل تجربة باستخدام نفس دفعة الحويصلات. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.