غراميسيدين القائم على الفحص الإسفار ؛ لتحديد الجزيئات الصغيرة المحتملة لتعديل خصائص طبقة ثنائية الدهن

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التغيرات التي يسببها الدواء في خصائص الطبقة الثنائية كما هو مستشعر من خلال البروتينات ثنائية الطبقة. يتم تحقيق ذلك عن طريق صنع الألواح الكبيرة أحادية الجانب المحملة بالفلور أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي مخدر الحويصلات بالجرامين.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي إضافة مروي خارجي وقياس معدل تبريد الفلورو الداخلي. أربعة. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في تحديد التغيير في تبريد الفلور لكل نشاط جرام عن طريق تركيب وظيفة أسية ممتدة في المسار الزمني الفلوري. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج لتقييم ما إذا كانت ملفات amfi يمكن أن تغير خصائص طبقة ثنائية الدهون.

مرحبا ، أنا علا أندرسون. مرحبا ، أنا هيلسون. مرحبا ، أنا ريتشي كابو.

وأنا ليا سانفورد من مختبر الدكتور أولاف أندرسون في قسم علم وظائف الأعضاء والفيزياء الحيوية في كلية طب وايل كورنيل. سنعرض لك اليوم إجراء لقياس التغيرات في خصائص الطبقة الحيوية للدهون. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة آثار الأدوية والجزيئات الصغيرة على خصائص القصيرة الدهنية.

لذلك دعونا نبدأ في اليوم الأول من هذا الإجراء ، قم بإزالة الدهون من الفريزر واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة. بمجرد التوازن ، أضف 0.6 مل من 25 ملليغرام لكل مليلتر ، ومحلول دهني وكلوروفورم إلى قارورة سفلية مستديرة سعة 25 ملليلترا. ثم جفف المحلول تحت غاز النيتروجين مع تدوير القارورة باستمرار حتى يتبخر الكلوروفورم بالكامل.

وطبقة بيضاء رقيقة من الدهون تغطي النصف السفلي بالكامل من القارورة ، وتجفف الدهون بشكل أكبر في حالة جفاف تحت الفراغ طوال الليل. تحضير محلول من 100 مللي مولار نترات الصوديوم 25 ملليمولار و A NTS و 10 ملليمولار HEPs من الأس الهيدروجيني سبعة. عند ضبط الرقم الهيدروجيني لهذا المحلول ، تجنب أي محاليل تحتوي على كلوريد.

نظرا لأن الثاليوم كوينشر يشكل مركبا غير قابل للذوبان مع الكلوريد في اليوم الثاني ، أعد ترطيب الدهون في 1.67. ملليلتر واحد من محلول الإلكتروليت هذا للحصول على معلق دهني 10 ملليمول. بمجرد الوصول إلى التركيز الصحيح ، قم بتغطيته بغشاء بارا ودوامة التعليق لحماية العينة تماما من الضوء بورق الألمنيوم واتركها تتقدم في العمر في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

في اليوم الثالث ، صوتنة الخليط لمدة دقيقة واحدة في صوتنة منخفضة الطاقة. ثم قم بتجميد العينة بإذابة الثلج لمدة خمس دقائق على الثلج الجاف ، متبوعة بخمس دقائق في الماء الدافئ ، كرر دورة ذوبان الجليد بالتجميد أربع إلى خمس مرات. قم بثق معلق الدهون باستخدام آلة بثق أفانتي ميني.

قم بإعداد الطارد الصغير بفلتر بولي كربونات 0.1 ميكرون ويدعم المرشح بثق التعليق ذهابا وإيابا 21 مرة بحيث ينتهي التعليق شبه الشفاف في المحقنة المعاكسة ، مما ينتج عنه حويصلة كبيرة أو تعليق LUV. قم بإزالة A NTS الخارجي عن طريق تشغيل التعليق المبثوق فوق عمود PD 10 duling الذي تم موازنته مع مخزن الصوديوم. أضف 1.5 مل من معلق LUV بالإضافة إلى مليلتر واحد من محلول الصوديوم إلى العمود.

بعد دمج المحلول بالكامل في العمود ، قم بمسح الجسيمات الشحمية بثلاثة ملليلتر من محلول الصوديوم واجمع الشطف. يجب أن يحتوي محلول مخزون LUV المملوء ب NTS الناتج على حوالي أربعة إلى خمسة مللي مولر دهني ويبدو شفافا. أبيض حليبي.

احم المحلول من الضوء بورق الألمنيوم وخزنه في درجة حرارة 13 درجة مئوية قبل 24 ساعة من الاستخدام الدوامة تماما. حل مخزون LUV المملوء A NTS. نظرا لأن UUVs لها كثافة أكبر من جرام واحد لكل مليلتر و / أو رواسب.

ثم قم بتخفيف محلول مخزون LUV المملوء ب A NTS. واحد إلى 20 مع عازلة الصوديوم يحتضن ثلاثة أرباع الجسيمات الشحمية مع 260 نانوغرام أبيدين في DMSO. أضف نفس حجم DMSO بدون غرامين إلى الربع المتبقي.

للحفاظ على تركيز المذيب ثابتا في جميع العينات ، اسمح للجرامين بالتوازن بين الحويصلات الدهنية الداخلية والخارجية أحادية الطبقات لمدة 24 ساعة عند 13 درجة مئوية. هنا ، يتم استخدام مقياس طيف التدفق المتوقفة للفيزياء الضوئية SX 20 مع التحكم في درجة الحرارة لقياس معدل التبريد الفلوري. للبدء ، قم بتشغيل الأدوات قبل ساعة من الموعد المحدد للسماح بتسخين الأداة.

يجب أن يكون الشق مع مقرري الإثارة عبارة عن خط مائش واحد ويجب استخدام مرشح تمرير عالي 4 55 نانومتر لتسجيل البث باستخدام برنامج pro data SX. قم بإعداد شروط التسجيل أولا ، واضبط الأطوال الموجية للإثارة أحادية اللون على 3 52 نانومتر. استخدم إعداد تثبيت الضغط.

اضبط الوقت على ثانية واحدة وأشر إلى 5,000. اضبط عدد التكرارات إلى تسعة لعمليات تشغيل المخزن المؤقت وإلى 13 لعمليات تشغيل التبريد. راقب درجة الحرارة في ملف تعريف محرك الأقراص للتحقق من برنامج Essex.

يجب ضبط حجم محرك الأقراص على 120 ميكرولتر ، والذي يمزج 60 ميكرولترا من كل حقنة. هذا يعطي وقتا ميتة يبلغ حوالي 1.2 مللي ثانية. اضبط الجهد العالي أو الكسب على كاشف التألق إلى حوالي 420 فولت.

الهدف هو الحصول على قراءة مضان تبلغ حوالي ثمانية موازنة الطائرات بدون UUV المحملة مسبقا ب NTS لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام. بمجرد توازن دوامة العينة ، ثم قم بتحميلها في المحقنة اليسرى. في حمولة المحقنة الصحيحة ، إما عازلة الصوديوم أو الثاليوم. مروي.

قم بإزالة أي فقاعات هواء عن طريق دفع المحاقن ذهابا وإيابا. يجب تحميل كلا المحاقن بالتساوي. قبل إغلاق الصمامات للعينة الأولى ، سجل التألق باستخدام عازلة الصوديوم.

كرر أربع مرات واضبط الكسب حسب الضرورة. ثم كرر خمس مرات إضافية للعينات المتبقية. سجل تسعة تكرارات باستخدام المخزن المؤقت للصوديوم.

استبدل المخزن المؤقت للصوديوم بمروي الثاليوم وسجل 13 تكرارا. اشطفها بالماء واستمر في عناصر التحكم التالية في العينة. قم بتضمين عينات بدون جرامين ومذيب ، بدون جرامين والحد الأقصى لتركيز المركب.

ومع وجود كل من الجرامين والمذيب بعد مقايسة التألق ، اقرأ البيانات في برنامج MATLAB للتحليل. لكل عينة تقرأ في جميع تكرارات المخزن المؤقت والتبريد ، ستتلوث التكرارات الأربعة الأولى بما كان موجودا سابقا في الأنبوب. في هذه الحالة ، تأتي الإشارة من عينة عازلة الصوديوم التي تختلط بالماء من الغسيل السابق.

التكرارات من خمسة إلى تسعة إشارة من العينة وحدها. لذلك ، نستبعد دائما التكرارات الأربعة الأولى في كل حالة. لتجنب أي قطع أثرية للخلط ، انتقل يدويا إلى الآثار وقم بإزالة أي تكرارات سيئة ، مثل الأثر الأحمر الذي يحتوي على مسامير أو انحرافات بسبب خلط القطع الأثرية و / أو الفقاعات.

ثم قم بتطبيع تكرارات التبريد إلى متوسط قيمة البداية لتكرارات المخزن المؤقت لكل عينة لكل حالة تجريبية ، واجمع متوسطات جميع العينات في رسم بياني واحد لعينات التصور بدون جرامين يجب أن تكون جميعها متشابهة ولا تظهر تقريبا أي تبريد مضان هناك انخفاض بطيء في إشارة الفلورسنت بسبب بطء أيون الثاليوم في الحويصلات للعينات التي تحتوي على جرام سيدين. إذا تم تغيير المسار الزمني للفلورسنت بشكل واضح بواسطة المركب ، فإن المركب يغير خصائص الطبقة الدهنية الثنائية عند التركيز الذي تم اختباره بعد ذلك يتناسب مع الأس الممتد لأول اثنين إلى 100 مللي ثانية من منحنيات التبريد الفلورية الطبيعية.

للفرد يكرر ويحسب المعدل في مللي ثانية. ثم احسب المتوسطات والانحرافات المعيارية لعينة معينة من الفرد يكرر تأثير الكابسيسين المشار إليه هنا كما لوحظ الغطاء على المسار الزمني لتبريد الفلورسنت في غياب أو وجود الجرامين المشار إليه باسم ga، تظهر إشارة الفلورسنت الطبيعية على مدار ثانية واحدة هنا. تمثل النقاط الرمادية نتائج جميع التكرارات بينما تمثل الخطوط الحمراء هي المتوسطات.

يتم عرض أول 100 مللي ثانية من إشارة الفلورسنت الطبيعية. النقاط الرمادية هي نتائج تكرار واحد لكل حالة. تمتد الخطوط الحمراء بشكل أسي يناسب تلك التكرارات.

يشير الخط الأزرق الخانق إلى علامة الملي ثانية. الوقت الذي يتم فيه تحديد معدل التبريد. يتم تحديد التغيير النسبي في معدل التبريد عن طريق تطبيع البيانات إلى عينة التحكم باستخدام gramin وبدون معدل.

عندما يمتص الكابسيسين الطبقة الدهنية الثنائية ، فإنه يغير خصائص الطبقة الثنائية. سينعكس التغيير نحو الطبقة الثنائية الأكثر نعومة على أنه تحول في جانب الجرام في توازن ثنائي أحادي لصالح ثنائي الموصل. لقد عرضنا لك للتو إجراء لقياس التأثيرات المزعجة للطبقة الثنائية لجزيء صغير.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام عناصر التحكم المناسبة لكل تجربة باستخدام نفس الدفعة من الحويصلات. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.