وحيد الخلية في الأجنة ترنسفكأيشن الفرخ

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن خلايا مفردة من الجسيدات الأنيقة أو الأنابيب العصبية ببلازميد يشفر بروتين الفلورسنت الأخضر. يتم تحقيق ذلك عن طريق سحب ماصات الحقن الدقيق أولا بقطر فتح طرف مناسب. الخطوة الثانية من الإجراء هي تحضير مخزون البلازميد للحقن.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي تحضير الأجنة للحقن. الخطوة الرابعة من الإجراء هي تحميل الماصات الدقيقة بالحمض النووي البلازميدي. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي حقن الأنسجة المرغوبة.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح نطاق المشتقات في عدد الخلايا التي تنتجها أسلاف مفردة في المجالات الفرعية المختارة للأنبوب العصبي والأنبوب العصبي من خلال الفحص المجهري المناعي. مرحبا ، أنا رائيل من مختبر البروفيسور هايم في قسم علم الأعصاب الطبي في الجامعة العبرية في القدس. سنعرض لك اليوم إجراء لحقن الخلايا المفردة من جسيدات الدجاج والأنابيب العصبية.

نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة فصل الخطوط لخلايا العث والأنبوب العصبي. لذلك دعونا نبدأ: لتوليد خلايا مفردة منقولة في أجنة الكتاكيت ، ابدأ بسحب الماصات الدقيقة. نقوم بسحب الماصات الخاصة بنا على مجتذب ماصة Naga PP 83 القياسي مع إعداد حرارة يبلغ 13.5.

يجب معايرة الإعداد الدقيق لتحقيق قطر طرف الماصة يتراوح بين ثمانية و10 ميكرون. نستخدم خيوطا تحتوي على أنابيب زجاجية من سيليكات بوريس بقطر خارجي يبلغ ملليمترا واحدا وقطرها الداخلي من 0.75 إلى 0.78 ملم. يمكنك أيضا استخدام الماصات الصغيرة المتوفرة تجاريا، والتي تفتقر إلى خيوط قطرها الخارجي ملليمتر واحد وقطرها الداخلي 0.75 ملليمتر.

يتم تخزين الماصات المحضرة في طبق بلاستيكي مع حماية الأطراف من ملامسة حافة الطبق. لإعداد الحمض النووي للحقن المجهري ، يتم تحويل البلازميد ذي الأهمية إلى DH خمسة ألفا ه قولونية. باستخدام الإجراءات القياسية في اليوم التالي ، يتم تنقية البلازميد باستخدام مجموعة أدوات إعداد Maxi للحقن غير النسيلي ، ونستخدم تركيز الحمض النووي البالغ ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر.

بالنسبة للتجارب التي تكون فيها المستنسخة الفردية مطلوبة ، سيكون تركيز البلازميد أقل بكثير وسيحتاج إلى تعديل. بالنسبة ل P-C-A-G-G-F-P-A تركيز 0.05 إلى 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر يعمل بشكل جيد. بمجرد تحديد التركيز الأمثل ، نوصي بتخفيف مخزون البلازميد المنقى بالكامل بدلا من المستحضرات الفردية إلى تركيز محدد مسبقا.

قد يقدم هذا الأخير بعض التباين في معدلات النجاح ، ربما بسبب الاختلافات في النقاء والمعلمات الأخرى ، مثل نسبة البلازميد الفائق لتحضير البيض للحقن الدقيق بيض الدجاج الذي تم تحضنه أثناء الاستلقاء على محاوره الطويلة حتى يتم مسح مرحلة النمو المرغوبة بنسبة 70٪ من الإيثانول والسماح لها بالجفاف. بعد ذلك ، اخترق الطرف المدبب للبيضة بمقص جراحي. باستخدام حقنة 10 مليلتر وإبرة قياس 19 ، اسحب ملليلترين من الألبومين من البيضة ، وأغلق الثقوب بالبارافين الساخن قبل الحقن.

استخدم مقصا جراحيا لفتح نافذة في الجزء العلوي من قشر البيض لمنع الحطام من دخول الحفرة. ضع قطعة من الشريط اللاصق فوق النافذة واقطع ثقبا من خلالها. للمساعدة في تصور الجنين ، استخدم الشعيرات الدموية المسحوبة بالنار مثبتة على شفاط لحقن حبر غير سام مثل البجع 17 تحت الجلد المتفجر.

بعد ذلك ، قم بالوصول إلى الجنين عن طريق قطع وتحويل الأغشية الحيوية و / أو السلوية باستخدام دبابيس حشرات 0.14 ملم مثبتة على حامل إبرة لتحميل الحمض النووي في الماصة المسحوبة Eloqua وإضافة كمية صغيرة من المسحوق الأخضر السريع باستخدام الشعيرات الدموية. ارسم كمية قليلة من الشعيرات الدموية المثبتة على البلازميد بقطر كاف على الشفاطة. ثم أدخلها في نهاية الماصة المقابلة للطرف الحاد وقم بتحميل الحمض النووي بالقرب من الطرف الحاد قدر الإمكان.

بعد ذلك، قم بتوصيل الماصة بحاقن ضغط الهواء اليدوي المثبت على مناور صغير. استخدم الحد الأدنى من الضغط إذا لزم الأمر للسماح لمحلول البلازميد بالوصول إلى طرف الماصة. قم بمعالجة الماصة في الوسط السائل للبويضة أثناء الضغط على بعض ضغط الهواء لمنع انسداد طرف الماصة.

بمجرد ثقب مجال الأنسجة ذي الصلة ، غالبا ما يكون التغيير في الضغط كافيا لتحرير البلازميد باللون الأخضر السريع المرئي. إذا لم يحدث هذا ، فقم بالضغط قليلا على المحقنة حتى يتم إخراج الخليط الأخضر السريع من البلازميد. كرر هذا الإجراء على طول محور الجنين بعد الحقن يمكن إضافة PBS.

أخيرا ، أغلق النافذة بشريط لاصق وأعد البيض إلى الحاضنة. تجنب التهوية وقم بتضمين حاويات صغيرة من الماء في الحاضنة للمساعدة في الحفاظ على الرطوبة وزيادة الغلة. إذا كان الموقع المستهدف للحقن سطحيا بما يكفي ليكون واضحا بسهولة ، كما هو الحال داخل الأنبوب العصبي الجسيد الظهري أو الأديم الظاهر ، فيمكن للمرء قياس معدل نجاح التجربة عن طريق إجراء ملاحظة كاملة باستخدام مجهر الفلورسنت.

هذه الخطوة مفيدة بشكل خاص لتقييم ما إذا كان قد تم تصنيف عدد كبير جدا من الخلايا أو عدد قليل جدا منها. إذا كنت ترغب في مزيد من الحضانة ، أضف المضادات الحيوية التي تحتوي على محلول PBS إلى البيضة بعد المشاهدة واستبدل شريط السقف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء تقييم معدل نجاح الحقن عن طريق التقسيم المتسلسل للأجنة وإجراء الكيمياء المناعية.

بعد أربع ساعات أو أكثر ، يتم إصلاح أجنة ما بعد الحقن ومعالجتها لتقسيم البارافين. ثم يتم الانتهاء من الأقسام المثبتة على الزجاج وقد يكون من المرغوب فيه استخدام البقع المناعية لطرق تضخيم التصور المراسل مثل البيوتين الستربتافيدين. أخيرا ، يتم فحص الأقسام التسلسلية للكشف عن الخلايا المسماة في الأجزاء المحقونة.

إذا تم الحصول على خلايا متعددة بدلا من خلايا مفردة في التجارب الأولية ، فيجب تخفيف مخزون البلازميد في العملية المتكررة حتى يتم تحقيق نتائج كافية. نقوم عادة بإجراء حقنة واحدة من P-C-A-G-G-F-P لكل سوس مع استهداف ستة إلى 12 جزءا لكل جنين. في ظل هذا الإعداد ، يمكن اكتشاف إشارة واضحة عن طريق مراقبة التركيب بالكامل ، بعد ثماني ساعات من الحقن في جزء واحد على الأقل في جنين واحد من أصل 10.

في هذا المثال ، تم حقن سوس so ببلازميد ترميز GFP ، وبعد خمس ساعات لوحظت خلية فلورية واحدة في عرض حامل كامل للجنين الموضح هنا. عند ملاحظتها بعد 24 ساعة من الحقن في العث المركزي ، لوحظ استنساخ الخلايا الفلورية في جنين كامل بعد يومين من الحقن النسيلي. يكشف تقسيم هذا الجزء عن وجود ذرية نسيلة في كل من الأدمة والعضلات ، مما يدل على أن الأسلاف المفردة تولد كلا المشتقات.

أما بالنسبة للجسيدات ، فيمكن أيضا تخويق الأسلاف الظهارية العصبية المفردة في الأنبوب العصبي الظهري كما هو موضح في هذا القسم المستعرض ، الذي تم تصويره بعد خمس ساعات من الحقن هنا. كشف تحليل المقطع التسلسلي أن الشفافية النسيلة قد تم تحقيقها عندما كان معدل النجاح حوالي 10٪ وهذا يعني أنه من أجل تحقيق الاستنساخ ، فإن التقنية بحكم تعريفها غير فعالة للغاية. من ناحية أخرى ، في ظل هذه الظروف ، تم العثور على أكثر من 93٪ من أحداث الوسم الإيجابية لتكون استنساخية.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية حقن خلايا مفردة من أجنة الدجاج عند القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر تخفيف كمية كبيرة من بلازميد المخزون إلى تركيز مثالي لعدوى الخلية المفردة ، ثم استخدامها خلال تجاربك. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.