Name: Electroeluting شظايا الحمض النووي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: تعلم تقنية الكهربائي لاستخلاص شظايا الحمض النووي بكفاءة تصل إلى 80٪. تُستخدم هذه الطريقة في علم الأحياء الجزيئي والتقنية الحيوية لتحقيق استرداد عالي النقاء بتكلفة منخفضة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل الدكتور برموديز CONACYT (المنحة # 82622) ، ونشكر غابرييلا جوتيريز ، سوسا ، Eliuth رييس - مارتينيز ورودريغيز زيمينا توريس لتسجيل الفيديو الإجراء electroleution.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل اختيار شظايا من الحمض النووي التي تهم يمكن تنقيته ، ينبغي حل هذه agarose في المواد الهلامية أو هلام ملون الأكريلاميد مع بروميد إيثيديوم بواسطة الكهربائي باستخدام العازلة 0.5X TBE (تريس بورات ، EDTA) عند 120 فولت لمدة 1 ساعة. وقد استخدم لهذا ، ~ 700 نانوغرام من البلازميد pProEx GdMre11S - (6000 - BP) هضمها من قبل مع وNdeI HindIII على الافراج عن 900 قطعة من الغليان (560 نانوغرام من البلازميد و 84 نانوغرام في جزء منه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينبغي أن تملأ خزان electroeluter (الشكل 1) مع 0.5X TBE موزعة بالتساوي في كل جانب من الهضبة منتصف رعاية لا صرفها على هضبة متوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قطع الشريط المحدد (أو نطاقات) للخروج من هلام ، وتوضع في حجرة العينة أقرب وقت ممكن إلى القناة الخامسة (شريحة واحدة لكل بئر). وينبغي أن يضاف إلى المخزن تشغيل كل غرفة ، ما يكفي لتغطية شريحة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم مسح كل قناة V استخدامها مع ماصة باستور للقضاء على أي فقاعة الهواء المحبوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تضاف برفق 100 من المجاهدين 10 M خلات NH 4 (لتسهيل التصور يتم إضافة كمية صغيرة من اللون الأزرق bromophenol ، وهو ما يكفي فقط لأنه لون) داخل القناة الخامس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب إغلاق الغطاء برفق لمنع أي إعادة تعليق من الملح وسادة عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبدأت في Electroelution 100 فولت لمدة 25 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال electrolution ، تتم إزالة 400 من المجاهدين V - القناة ، ووضعها في أنبوب microfuge أن تكون عجلت مع 2 مجلدات من الايثانول الباردة والجليكوجين (مستحسن لتحسين استرداد DNA) في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة ، ويغسل إزالة طاف مع الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الجافة وتحديد الحمض النووي في 260 نانومتر OD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكان الانتعاش الحصول على 75 ٪ (63 نانوغرام تعافى عندما وضعت 84 نانوغرام في قناة V -). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2136/2136fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. Electroeluter الرسم التخطيطي. واشارت الى أنود الكاثود على كل جانب من الحمض النووي ، خزان الواردة في جل شرائح (كما هو موضح مربع أسود) سوف تهاجر نحو الكاثود بسبب شحنتها السالبة. ثم سيتم المحاصرين في وسادة الملح (ممثلة مثلث مقلوب سوداء) الموجود في V - القناة.

<ol><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ومدة تشغيل تعتمد بشكل كبير على حجم الشظايا ، شظايا عادة لمدة تصل إلى 20 كيلو بايت 50 دقيقة إلى 1 ساعة ويكفي ، في حين أن أجزاء صغيرة مطلوب ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمتابعة كل 10 دقائق لمنع شظية من خلال الذهاب الى وسادة الملح وبالتالي الى الغرفة العازلة مصعدي انخفاض الانتعاش. فمن المهم للتأكد من أنه عند تعيين إمدادات الطاقة الخاص في 100 فولت ، وهناك ما لا يقل عن mAmp الحالية من 10. يمكن رصد الفرقة الحمض النووي باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية من ناحية وكشف هذا عندما يتخلى عن شريحة هلام. يمكن أيضا أن تكون وسادة الملح مع 3 خلات نا م. هذا الإجراء يسمح radiolabeled تنقية شظايا الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من أحجام مختلفة مع انتعاش جيدة (~ 80 ٪) ، هضمها بواسطة إنزيمات التقييد ، التي تتم معالجتها بواسطة الانزيمات تعديل ، إلخ.

<table><tbody><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>نيتروجين هيدروجين (NH)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; أسيتات</td><td>JT Baker</td><td>0596</td><td></td></tr><tr><td>أجاروز</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>المقياس الحيوي الضوئي</td><td>Eppendorf</td><td>6131 000 020</td><td></td></tr><tr><td>كهربائي&amp;#8211;لوتر</td><td>الفترة بين النبضات</td><td>UEA CAT 46000</td><td></td></tr></tbody></table>

electroeluting شظايا الحمض النووي

Electroeluting DNA Fragments

وتستخدم شظايا من الحمض النووي لأغراض مختلفة المنقى في البيولوجيا الجزيئية ، ويمكن أن يكونوا مستعدين من خلال إجراءات عدة. معظمها تتطلب الكهربائي السابقة للشظايا من الحمض النووي من أجل فصل عصابة من الفائدة. ثم ، يتم رفعه من هذه الفرقة من agarose هلام أو الأكريلاميد وتنقيتها باستخدام إما : ملزمة وشطف الزجاج أو من جزيئات السيليكا ، والأغشية ثنائي إيثيل أمينو إيثيل السليلوز ، &quot;سحق ونقع الأسلوب&quot; ، electroelution أو في كثير من الأحيان مكلفة تنقية مجموعات تجارية. وبالتالي ، فإن اختيار الأسلوب يعتمد في الغالب على ما يتوفر في المختبر. الإجراء electroelution يسمح احد لتنقية الحمض النووي نظيفة جدا لاستخدامها في عدد كبير من التطبيقات (التسلسل ، radiolabeling ، وتقييد الأنزيمية ، وتعديل الأنزيمية ، الخ الاستنساخ). يتكون هذا الإجراء في وضع الحمض النووي الفرقة التي تحتوي على مادة الأكريلاميد agarose أو شرائح داخل الآبار عينة من electroeluter ، ثم تطبيق الحالية سيجعل جزء الحمض النووي لمغادرة agarose وبالتالي يكون محاصرا في وسادة الملح التي سيتم استردادها في وقت لاحق عن طريق الترسيب الايثانول.

هذا الإجراء يسمح للتنقية مع شظايا الحمض النووي عالية الغلة.

Electroeluting شظايا الحمض النووي

تُستخدم قطع الحمض النووي (DNA) المنقاة لأغراض مختلفة في البيولوجيا الجزيئية، ويمكن تحضيرها عبر عدة إجراءات. تتطلب معظم هذه الإجراءات...

مرحباً. سنوضح لكم اليوم كيفية إجراء عملية الاستخلاص الكهربائي (electrolution) بهدف تنقية قطع DNA، مثل نواتج الهضم الإنزيمي وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ويمكن أن يكون الاستخلاص الكهربائي أحد الطرق المفضلة لأغراض أخرى مثل الاستنساخ والتسلسل الجيني. وبناءً على الشحنة الكهربائية السالبة لـ DNA، يتم وضع حاجز خلوي مرتفع ضمن المجال الكهربائي، مما يؤدي إلى ترسيب القطع ومنع هجرتها بشكل أكبر.تتيح هذه الطريقة تنقية مجموعة واسعة من أحجام قطع DNA من مصادر مختلفة بكفاءة عالية نسبياً تصل إلى 80%. وتمثل تكلفتها المنخفضة ميزة أخرى لعملية الاستخلاص الكهربائي (electro elution) عند مقارنتها بطرق التنقية الأخرى مثل الأعمدة ومجموعات الراتنج (resin kits)، وغيرها. يتم أولاً فحص عينة DNA عن طريق الفصل الكهربائي للهلام (agarose gel electrophoresis) المصبوغ بـ ethidium bromide من أجل رؤية وتحديد القطعة المراد تنقيتها، ومن ثم يجب المضي قدماً في عملية الفصل الكهربائي.عندما تكون القطع مفصولة جيداً، يمكن تحديد القطع ذات الحجم الأصغر بدقة. وبعد عملية الترحيل الكهربائي، يتم استئصال القطعة المطلوبة بدقة من الهلام باستخدام شفرة حلاقة جديدة، مع الحرص على قطع شريحة الهلام بحيث تكون أقرب ما يمكن من الحزمة المستهدفة.يجب تنفيذ هذا الإجراء مع توفير الحماية المناسبة من الأشعة فوق البنفسجية وارتداء القفازات. بعد ملء جهاز الـ electro luter بمحلول الاستخلاص (burning buffer) المناسب مع الحرص على غمره لسطح الهضبة الوسطى، توضع شريحة الهلام داخل إحدى العجلات بحيث تكون أقرب ما يمكن من القناة V. يجب ألا تتواجد أي فقاعات داخل القناة vch.يمكن تجنب ذلك عن طريق غسل القناة بالمحلول المنظم لإزالة أي هواء محتبس. بعد ذلك، تُضاف 100 µL من حاجز الملح العالي بعناية إلى القناة V من الموقع القريب من البئر. يتم إغلاق الغرفة وتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة لبدء عملية الاستخلاص الكهربائي بجهد يتراوح من 100 إلى 120 فولت.سيعتمد الفاصل الزمني على حجم القطعة؛ فبالنسبة للقطع الكبيرة التي تصل إلى 20 kbs، قد تكون فترة من 50 دقيقة إلى ساعة واحدة كافية، أما القطع الصغيرة فيجب مراقبتها كل 10 دقائق باستخدام الأشعة فوق البنفسجية UV لتجنب المزيد من الاستخلاص عبر المحلول الملحي وصولاً إلى سلسلة منظم التوازن النهائية. في هذه الحالة، قمنا بهضم 560 nanograms من البلازميد باستخدام إنزيمات ND one و entry لتحرير قطعة بحجم 900 base per، وهو ما يعادل 84 nanograms من العينة.وبناءً على ذلك، بعد وضع شريحة الهلام داخل البئر، تبدأ عملية الاستخلاص الكهربائي (electro elution) لمدة 25 دقيقة عند 100 فولت. وبمجرد اكتمال الاستخلاص الكهربائي واحتجاز قطع DNA في الوسادة السفلية داخل القناة V، يتم استعادة 400 µL من المحلول من القناة، من الجانب القاصي للمستقبل، ووضعها في أنبوب دقيق سعة 1.5 µL باستخدام طرف دقيق متصل بماصة دقيقة (micropipette)، ثم يتم البدء في الترسيب بالكحول عن طريق إضافة حجمين من الإيثانول المطلق البارد والمزج بواسطة جهاز الرج (vortex). بالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة 2 إلى 3 µL من الغليكوجين لتحسين حصيلة استعادة DNA؛ تُحفظ الأنابيب عند -20 °C لمدة ساعة واحدة أو بدلاً من ذلك تخزن عند درجة الحرارة هذه طوال الليل، ثم يتم إجراء الطرد المركزي عند 4 °C بأقصى سرعة لمدة 25 دقيقة.اغسل هذه الرواسب من خلال إضافة 1 مل من الإيثانول البارد بتركيز 70%. قم بالطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C بالسرعة القصوى لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، ثم تخلص من السائل الطافي واتركه ليجف في درجة حرارة الغرفة مع وضع الأنابيب في وضع مقلوب، ثم أعد تعليق الرواسب في 10 إلى 15 µL من الماء الخالي من النوكلياز، وتابع لتحديد تركيز العينة. في هذه الحالة، تمت إعادة تعليق العينة المنقاة في 10 µL من الماء وتقدير كميتها باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند طول موجي 260 نانومتر، مما أظهر تركيزاً قدره 6.3 ng/µL، وهو ما يمثل كفاءة بنسبة 75%. قد تعتقد أن استثمار 10 دقائق فقط من وقتك الثمين في استخدام طقم جاهز سيكون خياراً أفضل.ومع ذلك، وبالرغم من الوقت المستغرق في هذه العملية، ستتمكن من التحكم في العديد من المتغيرات التي ستسمح لك بتنقية نطاق أوسع من العينات ذات الأحجام والمصادر المختلفة بطبيعتها. وكما رأيت في هذه الحالة، لوحظت كفاءة بنسبة 75%، وهي نتيجة تعادل أو تفوق معظم أطقم تنقية DNA. نشكركم على انضمامكم إلينا اليوم.نأمل أن تكونوا قد وجدتم هذا البروتوكول مفيداً في مشاريعكم البحثية.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

"E - DNA" وأجهزة الاستشعار ، reagentless ، وقد تم تكييف أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية التي تحقق أداء جيدا حتى عندما تحدى مباشرة في الدم والمصفوفات المعقدة الأخرى ، إلى الكشف عن مجموعة واسعة من الحمض النووي والبروتين وanalytes جزيء صغير. هنا نقدم إجراء العامة للتصنيع واستخدام أجهزة الاستشعار من هذا القبيل.

تصنيع أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية الدنا للكشف Reagentless من الأحماض النووية والبروتينات والجزيئات الصغيرة

يوصف بروتوكول الأساسية للانفصال شظايا من الحمض النووي باستخدام الجل الاغاروز الكهربائي.

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

وذكرت ونحن في الآونة الأخيرة نهجا جديدا لتوليد تحقيقات DNAzyme fluorogenic التي يمكن تطبيقها لاقامة بسيطة، "مزيج والقراءة" فلوري فحص للكشف عن البكتيريا. هذه التحقيقات DNA خاص تحفيز الانقسام من الحمض النووي الريبي الركيزة حامل اللون معدلة وخيالية في وجود مزيج النفط الخام خارج الخلية (CEM) التي تنتجها بكتيريا معينة، وترجمة وبالتالي اكتشاف بكتيريا في توليد إشارة مضان. في هذا التقرير سنقوم بشرح الإجراءات التجريبية الرئيسية التي يعمل تحقيقا DNAzyme محددة تدل على "تكتل القوى الديمقراطية، EC1" للكشف...

الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic

في هذا الفيديو ، نقوم بتحليل توزيع حجم الحمض النووي الخالي من الخلايا أو شظايا cfDNA باستخدام الرحلان الكهربائي الشعري الآلي. تساعد هذه التقنية في اكتساب نظرة ثاقبة حول ملف تعريف شظايا الحمض النووي التي تطلقها الخلايا السرطانية أثناء موت الخلايا المبرمج.

تحليل توزيع حجم الشظايا الآلي القائم على الرحلان الكهربائي الشعري ل cfDNA: طريقة قائمة على رقاقة الحمض النووي لدراسة توزيع حجم شظايا الحمض النووي المعزولة من السوائل الحيوية

يصف هذا الفيديو تقنية الرحلان الكهربائي الشعري الموائع الدقيقة لفصل أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل بناء على حجمها. تساعد هذه التقنية في تحجيم الأجزاء باستخدام الأصباغ الفلورية وعلامات الحجم الجزيئي القياسية.

الرحلان الكهربائي الشعري للموائع الدقيقة لتحجيم شظايا منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): تقنية فصل كهربائي قائمة على الرقائق الدقيقة لفصل شظايا الحمض النووي بناء على الحجم

نقدم بيوشيب القائم ميكروفلويديك الكهروكيميائية للكشف عن تهجين الحمض النووي. التالية ssDNA التحقيق functionalization، يتم دراسة خصوصية وحساسية، والحد من الكشف مع أهداف ssDNA تكميلية وغير تكميلية. وتوضح النتائج أن تأثير الأحداث تهجين الحمض النووي على النظام الكهروكيميائية، مع حد الكشف عن 3.8 نانومتر.

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

تسلسل ثنائي الكبريتيت المنخفض المعزز هو طريقة لإعداد مكتبات التسلسل لتحليل مثيلة الحمض النووي بناء على هضم إنزيم التقييد جنبا إلى جنب مع تحويل ثنائي كبريتيت السيتوزين. يتطلب هذا البروتوكول 50 نانوغرام من المواد الأولية وينتج بيانات دقة زوج أساسي في المناطق الجينومية الغنية ب GC.

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

التقليدية البلازما هلام (سغي) التجارب تتطلب جهاز معقد والاستهلاك الكيميائي عالية. يعرض هذا العمل بروتوكولا يصف طريقة منخفضة التكلفة لفصل شظايا الحمض النووي ضمن إطار زمني قصير.

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

ويرد وضع بروتوكول للتحديد في المختبر وتوصيف الابتامرات الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك الخاصة بالمجموعة. ويرد أيضا تطبيق ابتمر المحدد في أبتاسينسور الكهروكيميائية.

اختيار ابتمر الحمض النووي ملزم إستر حامض فثاليك وتوصيف وتطبيق أبتاسينسور الكهروكيميائية

نقدم هنا تقنية بسيطة لتقييم المقاومة البيئية لمضادات الميكروبات (AMR) من خلال تعزيز نسبة الحمض النووي خارج الخلية منخفض الوزن الجزيئي. يسمح العلاج المسبق ب 20٪ -30٪ PEG و 1.2 M NaCl باكتشاف كل من جينات AMR المنقولة جينيا وأفقيا. يفسح البروتوكول نفسه لعملية خالية من الأدوات مع تحسين إضافي.

الاستخلاص المعزز للحمض النووي منخفض الوزن الجزيئي من مياه الصرف الصحي لإجراء تقييم شامل لمقاومة مضادات الميكروبات 

تعلم تقنية الكهربائي لاستخلاص شظايا الحمض النووي بكفاءة تصل إلى 80٪. تُستخدم هذه الطريقة في علم الأحياء الجزيئي والتقنية الحيوية لتحقيق استرداد عالي النقاء بتكلفة منخفضة.

Electroeluting شظايا الحمض النووي

استكشف المزيد من الفيديوهات