التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

الهدف العام من التجربة التالية هو قذف محتويات خلية حية واحدة وتأيين الجزيئات الحيوية المنطلقة لتحليلها بواسطة مطياف الكتلة تحت الضغط الجوي. ويتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار خلية واحدة من خلال مجهر بعيد المدى واستئصال الخلية المختارة بنبضة ليزر ذات طول موجي 2.94 micrometer يتم توصيلها عبر ليف بصري مدبب. وسيؤدي استئصال خلية واحدة إلى تكوين سحابة مجهرية من الجسيمات المتعادلة لتأيين سحابة الاستئصال.

يتم اعتراضها بواسطة رذاذ كهربائي. تندمج قطرات الشحنة الناتجة عن الرذاذ مع الجسيمات الموجودة في سحابة الاستئصال المنبعثة من الخلية. وتكون القطرات الناتجة محملة بالجزيئات من الخلية وتنتج الأيونات ذات الصلة.

تم الحصول على نتائج تُظهر طيف كتلة من خلية واحدة. يحتوي الطيف على العديد من القمم المتعلقة بالنواتج الأيضية والدهون في الخلية. مرحباً، أنا د. بن دريستر من مختبر فيريس في قسم الكيمياء بجامعة جورج واشنطن.

سنعرض لكم اليوم إجراء التحليل المباشر للخلايا الحية المفردة باستخدام مطيافية الكتلة عند الضغط الجوي. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة المستقلبات والليبيدات من خلايا نباتية وحيوانية مفردة. لذا، فلنبدأ.

يتم إنتاج الاستئصال بالليزر للتأين بالرش الإلكتروني ومطيافية الكتلة، أو ما يعرف بـ lazy MS، بواسطة نبضة ليزر مدتها 5 nanosecond عند طول موجي قدره 2.94 micrometer. وقد استُخدم في هذه الدراسة مذبذب بارامتري بصري قابل للضبط يتم تحفيزه بواسطة ليزر neodymium YAG لعملية الاستئصال.

لبدء العملية، قم بتثبيت الطرف المحفور من الليف الضوئي على ميكرومناور (micromanipulator) وقربه من سطح الخلية. ولضمان ترسيب الطاقة بكفاءة، أمسك الطرف غير المحفور من الليف الضوئي باستخدام حامل ألياف مكشوفة للمحاذاة الضوئية. يتم تركيب حامل الألياف على مترجم إزاحة خماسي المحاور.

قم بتوجيه طاقة الليزر إلى الليف الضوئي عن طريق تركيز الحزمة باستخدام عدسة محدبة مستوية من فلوريد الكالسيوم أو عدسة من سيلينيد الزنك المطلية بطبقة مضادة للانعكاس على الطرف غير المحفور لليف؛ استخدم مرايا ذهبية محمية لتوجيه حزمة ليزر الأشعة تحت الحمراء المتوسطة نحو عدسة التركيز. وللحفاظ على المسافة بين طرف الليف المدبب وسطح الخلية، استخدم مجهراً فيديو بعيد المدى مُثبتاً بزاوية تتراوح بين 15 إلى 30 درجة مقاسة من السطح. يتكون هذا النظام أيضاً من عدسة شيئية مصححة ببعد بؤري لانهائي بقوة تكبير خمس مرات، ومزودة بكاميرا CCD للمراقبة والتقاط الصور.

يتم تركيب مجهر فيديو ثانٍ بزاوية قائمة بالنسبة لسطح العينة لتصوير الخلايا من الأعلى واختيارها للتحليل. يوفر هذا النظام تغذية بصرية مرتدة لمحاذاة طرف الليف فوق الخلية المختارة من أجل الاستئصال والتحليل. ويتكون النظام من وحدة بصرية للتكبير الدقيق بمقدار سبع مرات، مع عدسة شيئية ذات مسافة عمل طويلة ومصححة للانكسار اللانهائي بمقدار 10 مرات، وكاميرا CCD.

تم بناء نظام الرش الإلكتروني باستخدام وصلة معدنية مع تركيبات من مطاط البيرفلور إيلاستومر الموصل، وأنابيب، وكم وسدادة إبرة، بالإضافة إلى أنابيب السيليكا FU. الباعث الموصى به مصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ وله طرف مستدق بقطر 50 micrometer، قم بتحضير محلول ميثانول بنسبة 50% مع 0.1% حمض الخليك للرش الإلكتروني. يتم ضخ المحلول بمعدل 200 إلى 300 nanoliters في الدقيقة بواسطة مضخة حقنة.

باستخدام سرنجة سعة 500 µL، سيتم تطبيق جهد كهربائي عالٍ يتراوح بين 2,803,000 فولت على الوصلة المعدنية بواسطة وحدة تغذية طاقة منظمة. ولتوليد رذاذ كهربائي مستقر، تأكد من أن جميع التوصيلات الكهربائية آمنة ومحمية بغطاء التدريع ومؤرضة بشكل صحيح، حيث أن التلامس المباشر مع الجهد العالي المكشوف قد يؤدي إلى حدوث صدمة كهربائية. احصل على عينة الأنسجة الحية أو الخلايا من مصدر مناسب واحفظها وفقاً للتوصيات قبل البدء في التحليل.

تم شراء أبصال Allium cepa لهذا العرض التوضيحي من متجر محلي. لتحضير عينة أبصال Allium cepa، اقطع البصلة طولياً باستخدام مشرط جراحي، ثم خذ مقطعاً تبلغ مساحته حوالي سنتيمتر مربعين من قشرة بصلة. بعد ذلك، قم بتقشير طبقة أحادية سليمة من النسيج البشروي الداخلي. استخدم السطح الرطب للبشرة لتثبيت النسيج على شريحة مجهر زجاجية منظفة مسبقاً.

ثبّت الشريحة باستخدام حامل ألواح عام الأغراض، مثبت على منصة إزاحة ثلاثية المحاور لغرض تحديد الموضع. قم بالحصول على أطياف الكتلة فور تركيب العينة لمنع تحلل الخلايا. ابدأ بتشغيل الليزر، والرش الإلكتروني، ومطياف الكتلة.

قم بتحسين هندسة مصدر الأيونات الكسول عن طريق ضبط موضع بقعة الاستئصال وباعث الرش الكهربائي بالنسبة لكل منهما وبالنسبة لفتحة مطياف الكتلة. ولتحقيق أقصى كثافة أيونية، اختر الخلية المراد تحليلها باستخدام نظام التصور من المنظر العلوي. بعد الاختيار، حرك منصة العينة لجعل الخلية المختارة تقع مباشرة تحت الطرف المدبب لليف البصري.

باستخدام المجهر ذو الرؤية الجانبية، أعد ضبط المسافة بين الطرف وسطح الخلية لتكون 20 microns تقريبًا. وبمجرد الوصول إلى الموضع الصحيح، أطلق نبضات ليزر على الخلية المختارة عبر طرف الألياف المحفورة. يؤدي ذلك إلى ثقب جدار الخلية وقذف السيتوبلازم على شكل مواد جسيمية.

بعدما يتم التأين بواسطة الرذاذ الكهربائي، يجمع مطياف الكتلة الأيونات الناتجة ويتم تسجيل أطياف الكتلة. بعد الحصول على البيانات، ضع الليزر والرذاذ الكهربائي ومطياف الكتلة في وضع الاستعداد أو قم بإيقاف تشغيلها. احتفظ بعينة نسيج *Allium cepa* التي تم استئصالها لإجراء فحص اختياري بالمجهر الضوئي؛ حيث يؤدي الاستئصال الناجح لخلية واحدة إلى تمزق جدار الخلية والحصول على طيف كتلة كسول.

فيما يلي نتائج تحليل MS الكسول لخلية بشرية واحدة مضمنة من بصلة allium SEPA، تظهر صورة ممثلة بالمجهر الضوئي. بعد أخذ عينة من الخلية، يتم ثقب جدار الخلية ويكون مدى الثقب محدوداً بالحدود مع الخلايا المجاورة. تبدو الخلايا المجاورة سليمة.

يظهر هنا طيف كتلة ممثل تم إنتاجه من الخلية. يتم الكشف عن مجموعة متنوعة من الأيونات من كل خلية بصل، وبناءً على كتلها الدقيقة، وأنماط توزيع النظائر، وأطياف الكتلة الترادفية، يتم تعيين الأيونات بدقة إلى المستقلبات الداخلية. كانت الأيونات المكتشفة من خلية واحدة مماثلة لتلك التي لوحظت في تحليل النسيج نفسه بواسطة تحليل MS التقليدي لخلايا متعددة.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحليل الخلايا الحية المنفردة عن طريق مطيافية الكتلة عند الضغط الجوي. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر ارتداء نظارات واقية لتجنب التعرض العرضي لأشعة ليزر الأشعة تحت الحمراء من الفئة الرابعة. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.