التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم وجود تفاعلات البروتين-بروتين على سطح الخلية. ويتحقق ذلك من خلال استنساخ مستقبلين مستهدفين، مع دمج كل منهما في النهاية مع أحد فلوروفرين (fluorophores) يتميزان بتداخل في أطياف الانبعاث والامتصاص كخطوة ثانية. يتم ترنسفكشن (transfect) الناقلين في وقت واحد في الخلايا البطانية للتعبير عن المستقبلات.

في هذه المرحلة، تساعد الفلوروفورات في تقييم المدى الإجمالي للتعبير بالإضافة إلى تموضع المستقبلات. بعد ذلك، يتم تحديد معاملات التصوير باستخدام عملية ترانسفكشن واحدة كعنصر تحكم على المجهر البؤري (confocal microscope). ويتم اختيار الخلايا التي خضعت للترانسفكشن بشكل فردي بناءً على مستوياتها النسبية من تعبير المستقبلات وتموضعها.

يتم بعد ذلك تصوير مناطق داخل هذه الخلايا لتقييم مدى نتائج FRET التي تم الحصول عليها. والتي تظهر تفاعلات Tie1 وTie2 على سطح الخلية البطانية بناءً على FRET والمجهر البؤري (confocal microscopy). مرحباً، أنا توم سيجر من مختبر الدكتور ويليام بارتون في قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فرجينيا كومونولث.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتقييم التفاعلات بين البروتينات في الخلايا البطانية باستخدام المجهر البؤري القائم على تقنية FRET. نستخدم هذه التقنية في مختبرنا لدراسة تفاعلات المستقبلات أثناء تكوين الأوعية الدموية. فلنبدأ.

لتصوير تفاعلات البروتين-بروتين باستخدام مقايسة التقارب المعتمدة على نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)، ابدأ باستنساخ المستقبلات المطلوبة في مواقع NHE one eco R one لناقل pcd, a 3.1 hydro أو neo الذي يحتوي على CFP أو YFP أحادي القسيمة. إن تحديد قيمة FRET أمر تجريبي ويعتمد بشكل حاسم على طول الرابط بين المنطقة العابرة للغشاء وبداية الفلوروفور. لذلك، يجب استكشاف عدة أطوال مختلفة من الرابط لكل زوج جديد من المستقبلات قيد البحث. قم بتحويل وتضخيم النواقل وفقاً للبروتوكول المرفق.

بعد ذلك، قم بتحضير DNA بدرجة نقاء صالحة للترانسفكشن، وقم بتحويل وتضخيم النواقل وفقاً للبروتوكول المرفق. ثم قم بتحضير DNA بدرجة نقاء صالحة للترانسفكشن وقم بتخفيفه إلى تركيز عمل يبلغ 1 µg/µL لتجهيز الخلايا للترانسفكشن تحت غطاء زراعة الأنسجة؛ قم بتوزيع خلايا EAHY 92 6 المنماة في وسط DMEM كامل في أطباق قطرها 35 millimeter تحتوي على شرائح غطاء زجاجي مع 2 mL من الوسط. جهز طبقاً واحداً لتقييم تعبير كل مستقبل بشكل فردي، بالإضافة إلى طبق واحد لكل زوج من المستقبلات.

اترك الخلايا لتتحضن في جو يحتوي على 95% carbon dioxide عند 37 degrees Celsius حتى اليوم التالي. يجب أن تكون نسبة التلاقي (confluence) في المزرعة حوالي 70 إلى 90% في يوم عفن الخلايا (transfection). قم بتحضير معقدات النيوكليوليبيد عن طريق خلط 2 µg من DNA ناقل المستقبل الخيمري مع 8 µL من Fuji N HD في 200 µL من optimum المسبق التدفئة؛ وبالنسبة لأزواج المستقبلات، يتم عفن الخلايا باستخدام 1 µg من كل مستقبل بإجمالي 2 µg، ثم تخلط بلطف عن طريق القلب وتتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

خلال فترة التحضين، قم بتجهيز الخلايا لعملية عفن الخلية (transfection) عن طريق شفط الوسط الغذائي الطازج، ثم اغسل كل طبق بلطف وبسرعة باستخدام PBS دافئ قبل إضافة 2 mL من وسط DMEM الكامل المسخن مسبقاً والخالي من المضادات الحيوية. ومن المهم تجنب وجود البنسلين والستريبتومايسين نظراً لكونهما أكثر سمية بشكل ملحوظ للخلايا أثناء المعالجة بـ FU gene HD؛ حيث يُضاف المعقد إلى الخلايا قطرة تلو الأخرى، ثم تُحضن لمدة إضافية تتراوح من 20 إلى 24 ساعة. وبعد مرور 24 ساعة، اشفط الوسط الغذائي من الخلايا بعناية، ثم أضف وسط DMEM كامل وطازج مع المضادات الحيوية بعد إتمام عملية عفن الخلية.

يجب أن تظل حيوية الخلايا مرتفعة نسبيًا. كما يجب ألا يُلاحظ وجود خلايا عائمة إلا في حالات قليلة أو منعدمة. لإجراء التصوير الحي للخلايا، نستخدم مجهراً بؤرياً ماسحاً بالليزر من نوع A-T-C-S-P two A OBS مجهزاً بليزر أرجون ديود أزرق وليزرات هيليوم نيون خضراء وبرتقالية وحمراء، وعدسة غمر بالجلسرين H-C-X-P-I-A-O 63 x 1.3 NA، ومنصة XY آلية، وحاضنة منصة يتم التحكم فيها من حيث درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون.

تعد الضوابط التجريبية ضرورية للقضاء على التداخل الفلوري (crosstalk) بين قنوات الانبعاث، وكذلك لتقييم مشكلات التعبير والفلورة غير النوعية. وبناءً على ذلك، تُستخدم عينات منقولة بفلوروفور واحد لإعداد كل جلسة تصوير من أجل إزالة التداخل بين قنوات الانبعاث الخاصة بـ CFP و YFP. ضع ضابط التعبير عن CFP في حاضنة المنصة باستخدام الضوء الأبيض.

قم بضبط لوحة Z للتركيز على الخلايا. اضبط إعدادات نافذة SP للكشف عن انبعاث CFP من 465 إلى 505 نانومتر وYFP من 525 إلى 600 نانومتر، وأثناء مراقبة قناتي الانبعاث معاً، قم بإثارة CFP عند 458 نانومتر. باستخدام A OTF، اضبط قدرة الليزر للقضاء على أي تداخل ملحوظ (bleed over) من CFP إلى قناة انبعاث YFP.

احفظ هذا الإعداد. قم بإجراء التحكم نفسه للتداخل الضوئي لـ YFP في قناة CFP عن طريق ضبط قدرة الاستثارة عند 514 nanometers. احفظ هذا الإعداد للخلايا التي تعبر عن YFP فقط.

بعد ذلك، ضع الخلايا التي تعبر عن CFP وYFP في الحاضنة الموجودة على المنصة. وباستخدام إعدادات التسلسل الخاصة ببرنامج LICO confocal، حدد الخلايا التي تعبر عن مستويات مماثلة من CFP وYFP مع تموضع غشائي صحيح باستخدام برنامج LICO، باستثناء برنامج التبييض الضوئي المقبول في البرنامج.

اضبط إعدادات المانح والمستقبل على إعدادات CFP و YFP المحفوظة لديك على التوالي. عند تكبير الصورة على الخلية، حدد منطقة اهتمام (ROI) التي سيحدث فيها التدمير الضوئي لـ YFP على الغشاء الخلوي، وابدأ برنامج التدمير الضوئي للمستقبل. اضبط A OTF على 100% من 514 nanometers واترك عملية التبييض بالليزر تستمر حتى يتم استنفاد 70% من انبعاث YFP.

لتسريع عملية التبييض، يتم عادةً اختيار مناطق الاهتمام (ROIs) على محور المسح لليزر أثناء التبييض الضوئي. راقب حركة الخلايا واستبعد القياسات التي تم الحصول عليها مع وجود حركة ملحوظة في المستوى XY. نظرًا لأن هذه القياسات قد تعطي قيمًا خاطئة لكفاءة FRET، يتم تسجيل صور ما قبل وما بعد التبييض لكل من المانح والمستقبل، ويتم حساب كفاءة FRET وفقًا للمعادلة: كفاءة FRET تساوي (post - DLO) مقسومة على depost لجميع قيم depost الأكبر من D pre، حيث تمثل D pre و D post شدة المانح قبل التبييض الضوئي وبعده على التوالي.

يُستخدم برنامج JMP لتحديد مدى التباين التجريبي. يجب دمج المستقبلات الفردية مع كل من CFP و YFP بأطوال متفاوتة من التسلسل المجاور للغشاء. ولتحديد أفضل زوج ممكن من شركاء FRET للمستقبلات، تكون كفاءات عفن الخلية عادةً بين 30 إلى 40% على الرغم من النتائج السابقة التي توصل إليها آخرون.

لم نلاحظ أن عملية ترانسفكشن وتعبير ناقل واحد تعزز من تعبير الناقل الآخر. وبالفعل، فإننا غالباً ما نلاحظ تعبيراً حصرياً لسلالة واحدة، إما هذه أو تلك. وتظهر هذه الصور التمثيلية تحليل تبييض المتقبل الضوئي لعملية fret التي تحدث بين CFP و YFP في خلية EAHY 9 26.

تمت مراقبة قناتي انبعاث CFP وYFP بشكل منفصل قبل وبعد عملية التبييض الضوئي، واقتصرت الحسابات على المنطقة المحددة. وضمن المربع الأحمر، تظهر كفاءة FRET كنطاق مطلق يتدرج من القيمة العالية الملونة بالأحمر عند 1.0 إلى القيمة المنخفضة الملونة بالأرجواني عند الصفر، وذلك على صورة مدمجة مكبرة لـ A-C-F-P-Y-F-P لأغراض التوجيه فقط لنظام مستقبل T. وتتراوح قيم كفاءة FRET النموذجية بين 20 إلى 28% للخلايا الظهارية و19 إلى 23% للخلايا البطانية كما هو موضح هنا.

وبمجرد إتقان هذه التقنية، ستستغرق عادةً من ثلاثة إلى أربعة أيام إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر أن طول الرابط بين البروتين المستهدف والبروتين الفلوري المدمج، بالإضافة إلى مستويات تعبيرهما وحركتهما الخلوية، تؤثر بشكل مباشر على قياس fret بعد تنفيذ الإجراء. علاوة على ذلك، يمكن إجراء مقايسات كيميائية حيوية فيما يتعلق بتنشيط الإشارة من أجل اكتساب رؤية أعمق حول مسارات نقل الإشارة بعد تطويرها.

توفر هذه التقنية مقايسة يمكن من خلالها دراسة التفاعلات بين البروتينات سواء كانت ضعيفة أو عابرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء مقايسات التقارب القائمة على نقل طاقة الرنين الفلوريسنتي (FRET) في الخلايا الحية. ولا تنسَ أنه عند العمل مع الخلايا في المزارع النسيجية، يجب دائمًا اتباع احتياطات السلامة المناسبة.

شكرًا لكم على المشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم المستقبلية على الـ fret.