التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم وجود تفاعلات بروتين البروتين على سطح الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنساخ مستقبلين مهمين ، محطة myo لاثنين من الفلوروفورات التي لها انبعاث متداخل وأطياف كخطوة ثانية. يتم نقل المتجهين في وقت واحد إلى خلايا بطانية للتعبير عن المستقبلات.

في هذه المرحلة ، تساعد الفلوروفورات في تقييم المدى الكلي للتعبير بالإضافة إلى توطين المستقبلات. بعد ذلك ، يتم إنشاء معلمات التصوير باستخدام جهاز منقل واحد كعنصر تحكم في المجهر متحد البؤر. بشكل فردي ، يتم اختيار الخلايا المنقولة بناء على مستوياتها النسبية للتعبير عن المستقبلات وتوطينها.

ثم يتم تصوير المناطق داخل هذه الخلايا من أجل تقييم مدى الحصول على نتائج الحنق. يظهر ذلك ربط واحد وربط تفاعلين على سطح الخلية البطانية بناء على الفحص المجهري fre و متحد البؤر. مرحبا ، أنا توم سيجر من مختبر الدكتور ويليام بارتون في قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة فرجينيا كومنولث.

سنعرض لك اليوم إجراء حول تقييم تفاعلات بروتين البروتين في الخلايا البطانية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر القائم على الحنق. في مختبرنا ، نستخدم هذا لدراسة تفاعلات المستقبلات أثناء تكوين الأوعية. لذلك دعونا نبدأ.

لتصوير تفاعلات البروتين البروتيني باستخدام مقايسة القرب القائم على الحنق ، ابدأ باستنساخ مستقبلاتك ذات الأهمية في مواقع NHE one eco R واحدة من pcd ، وهو ناقل مائي أو جديد 3.1 يحتوي على CFP أحادي أو YFP. تحديد الحنق تجريبي ويعتمد بشكل حاسم على طول الرابط بين المنطقة الممتدة عبر الغشاء وبداية الفلور. لذلك ، يجب استكشاف العديد من الروابط المختلفة للرابط لكل زوج مستقبلات جديد قيد التحقيق ، قم بتحويل وتضخيم النواقل وفقا للبروتوكول المصاحب.

ثم قم بإعداد الحمض النووي لدرجة التعدي ، وتحويل وتضخيم المتجهات وفقا للبروتوكول المصاحب. ثم قم بإعداد الحمض النووي بدرجة التعداء وتخفيفه إلى تركيز عمل قدره ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر لإعداد الخلايا للتعداء تحت غطاء لزراعة الأنسجة ، وتقسيم EAHY 92 6 خلايا نمت في DMEM كامل في أطباق خط انزلاق 35 ملم مع ملليلترين من المتوسط. قم بإعداد طبق واحد لتقييم التعبير عن كل مستقبل فردي بالإضافة إلى طبق واحد لكل زوج من المستقبلات.

اسمح للخلايا باحتضان أكثر من 95٪ من الغلاف الجوي لثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. يجب أن تكون الثقافة حوالي 70 إلى 90٪ من التقاء في يوم التعدين. قم بإعداد مجمعات دهون النواة عن طريق خلط ميكروغرامين من الحمض النووي الناقل للمستقبلات الخيميرية مع ثمانية ميكرولتر من Fuji N HD في 200 ميكرولتر من التسخين الأمثل لأزواج المستقبلات مع ميكروغرام واحد من كل مستقبل ليصبح المجموع ميكروغرامين ممزوجين بلطف عن طريق الانعكاس واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

خلال فترة الحضانة ، قم بإعداد الخلايا للتعداء ، واستنشق من الوسائط الطازجة ، واغسل كل طبق برفق ولفترة وجيزة باستخدام PBS الدافئ قبل إضافة ملليلترين من DMEM الكامل قبل الحرب بدون مضادات حيوية. من المهم تجنب وجود البنسلين والستربتومايسين لأنهما أكثر سمية للخلايا أثناء العلاج باستخدام جين FU HD في المركب بالتنقيط للخلايا واحتضانه لمدة 20 إلى 24 ساعة إضافية. بعد 24 ساعة ، قم بشفط الوسط بعناية من الخلايا وماصة DMEM كاملة طازجة مع المضادات الحيوية بعد التعداد.

يجب أن تظل صلاحية الخلية عالية نسبيا. يجب ملاحظة عدد قليل من الخلايا العائمة أو معدومة. لإجراء تصوير الخلايا الحية ، نستخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر مثل A-T-C-S-P المجهز بأرجون الصمام الثنائي الأزرق وليزر النيون الهيليوم الأخضر والبرتقالي والأحمر ، وغمر الجلسرين H-C-X-P-I-O 63 × 1.3 NA ، ومرحلة XY آلية وحاضنة مرحلة يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون.

الضوابط التجريبية ضرورية للقضاء على الحديث المتبادل الفلوري بين قنوات الانبعاث وكذلك لتقييم مشكلات التعبير وتكوين الفلور الرابع غير المحدد. على هذا النحو ، يتم استخدام الفلورو الأربعة القاطع لإعداد كل جلسة صورة للتخلص من الحديث المتبادل بين قنوات الانبعاث ل CFP و YFP. ضع عنصر التحكم في تعبير CFP في حاضنة المسرح باستخدام الضوء الأبيض.

اضبط لوحة Z للتركيز على الخلايا. اضبط إعدادات نافذة SP للكشف عن انبعاثات CFP على 465 إلى 505 و YFP على 525 إلى 600 نانومتر أثناء مراقبة كلتا قناتي الانبعاث تثير CFP عند 458 نانومتر. باستخدام A OTF ، قم بتعيين طاقة الليزر للتخلص من النزيف الملحوظ من CFP في قناة انبعاث YFP.

احفظ هذا الإعداد. قم بإجراء نفس التحكم في الحديث المتبادل YFP في قناة CFP عن طريق ضبط قوة الإثارة عند 514 نانومتر. تحفظ الخلايا التي تعبر عن YFP فقط هذا الإعداد.

بعد ذلك ، في المكان التالي ، الخلايا coex التي تعبر عن CFP و YFP في حاضنة المرحلة. استخدام إعداد التسلسل لبرنامج LICO متحد البؤر. حدد موقع الخلايا التي تعبر عن مستويات مماثلة من CFP و YFP مع توطين الغشاء المناسب باستخدام برنامج LICO باستثناء برنامج تبييض صور متقبل البرامج.

اضبط إعدادات المتبرع والقبول على إعدادات CFP و YFP المحفوظة على التوالي. تكبير الخلية ، وتسليط الضوء على منطقة ذات أهمية أو عائد استثمار يحدث فيها تدمير صور YFP على الغشاء الخلوي وبدء البرنامج لتدمير الصور من المتقبل. اضبط A OTF على 100٪ من 514 نانومتر واسمح للتبييض بالليزر بالاستمرار حتى يتم استنفاد 70٪ من انبعاث YFP.

لتسريع التبييض ، عادة ما يتم اختيار عائد الاستثمار في المحور النقطي لليزر أثناء التبييض الضوئي. راقب الحركة الخلوية وارفض القياسات التي تم الحصول عليها بحركة ملحوظة في المستوى XY. نظرا لأن هذه القياسات يمكن أن تبلغ عن كفاءات الحنق الكاذبة ، يتم تسجيل صور التبييض قبل وبعد كل من المتبرع والمتلقي ويتم حساب كفاءة الحنق على أنها كفاءة الحنق تساوي وظيفة الأصل المفتوحة مطروحا منها أقواس DLO مقسومة على depost لجميع depost أكبر من D pre حيث D و pre و D post هي شدة المتبرع قبل وبعد التبييض الضوئي على التوالي.

يستخدم JMP لتحديد مدى التباين التجريبي. يجب دمج المستقبلات الفردية في كل من CFP و YFP بأطوال متفاوتة من تسلسل الغشاء المجاور. لتحديد أفضل زوج ممكن من شركاء الحنق المستقبلات ، تتراوح كفاءات التعداء عادة بين 30 إلى 40٪ على الرغم من النتائج السابقة التي توصل إليها الآخرون.

نر أن تعداء وتعبير أحد المتجهات يفضل الآخر. في الواقع ، نلاحظ في كثير من الأحيان التعبير الحصري عن نباتات واحدة أو أربع مرآة KY أو أخرى. تظهر هذه الصور التمثيلية تحليلا للتبييض الضوئي للحنق الذي يحدث بين CFP و YFP في خلية EAHY 9 26.

تمت مراقبة قنوات انبعاث CFP و YFP بشكل منفصل قبل وبعد التبييض الضوئي ، وتبييض الصور ، واقتصرت الحسابات على المنطقة. داخل الصندوق الأحمر ، يتم عرض كفاءة الحنق كنطاق مطلق من الأحمر الملون العالي عند 1.0 إلى اللون الأرجواني المنخفض عند الصفر على تراكب مكبر للصورة المدمجة A-C-F-P-P-Y-F-P لأغراض التوجيه فقط لنظام مستقبلات T. قيم كفاءة الحنق النموذجية هي 20 إلى 28٪ للخلايا الظهارية و 19 إلى 23٪ للخلايا البطانية كما هو موضح هنا.

لذلك بمجرد إتقانها ، ستستغرق هذه التقنية عادة من ثلاثة إلى أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن طول الرابط بين البروتين المستهدف وبروتين الفلورسنت الانصهاري ، بالإضافة إلى مستويات التعبير والحركة الخلوية تؤثر بشكل مباشر على قياس الحنق بعد الإجراء. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء فحوصات كيميائية حيوية فيما يتعلق بتنشيط الإشارة من أجل اكتساب نظرة ثاقبة لمسارات نقل الإشارة بعد تطويرها.

توفر هذه التقنية اختبارا يمكن من خلاله دراسة تفاعلات بروتين البروتين الضعيفة أو العابرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحوصات القرب القائمة على الحنق والخلايا الحية. ولا تنس أنه أثناء العمل مع الخلايا في زراعة الأنسجة ، يجب دائما اتباع احتياطات السلامة المناسبة.

لذا شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك المستقبلية.