يعاير نشاط الحركي لدراسة ايقاعات كل يوم والمعلمات في النوم ذبابة الفاكهة

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف الأنماط الظاهرية للنظم اليوماوي والنوم في ذبابة الدروزوفيلا عن طريق تحليل الإيقاعات اليومية للنشاط الحركي. ويتم تحقيق ذلك من خلال إنتاج ذباب معدل جينياً، أو الحصول على طفرات محددة، أو إجراء التزاوجات اللازمة لتجهيز الحيوانات التجريبية. وكخطوة ثانية، يجب تحضير أنابيب نشاط زجاجية تحتوي على مصدر غذائي، والتي ستعمل كموطن للذباب خلال التجربة.

بعد ذلك، يتم وضع الذباب الذي يتراوح عمره من يوم إلى خمسة أيام في أنابيب النشاط، والتي تُحمّل في أجهزة مراقبة النشاط DAM لمراقبة إيقاعات النشاط الحركي. وباستخدام نظام DAM، يتم الحصول على نتائج تُظهر عيوباً واختلافات في معلمات الساعة البيولوجية والنوم استناداً إلى تحليل إيقاعات النشاط الحركي اليومية باستخدام برامج مثل far sex وinsomniac. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الساعة البيولوجية، مثل البروتينات والآليات التنظيمية المشاركة في توليد الإيقاعات السليمة، وعلى سبيل المثال، كيف تقوم العوامل البيئية مثل الضوء ودرجة الحرارة بتعديل الإيقاعات السلوكية من خلال مسارات جزيئية محددة.

يتكون نظام مراقبة النشاط الحركي من عدة قطع من المعدات مثل أجهزة مراقبة متخصصة، وحاضنات بيئية ذات قدرة على التحكم في الضوء النهاري، وأجهزة لجمع البيانات، وحواسيب، ومواد طرفية مثل الأسلاك. اختر غرفة مظلمة ذات تهوية جيدة وتحكم في درجة الحرارة لوضع نظام مراقبة النشاط الحركي لتجنب العبء الزائد على الحاضنات ومنع أي فشل محتمل في الحفاظ على درجة الحرارة؛ قم بعزل الغرفة عن مصادر الضوء الخارجية. ليس من الضروري العمل في ظلام تام، حيث أن النظام اليوماوي لذبابة الفاكهة غير حساس للأشعة تحت الحمراء.

وبناءً على ذلك، في الحالات التي نحتاج فيها للرؤية داخل الغرفة المظلمة، نستخدم ببساطة مصباحاً يدوياً قياسياً مغطى بمرشح أحمر، ووحدة تغذية كهربائية غير منقطعة (UPS) كنسخة احتياطية للطوارئ ذات سعة واط كافية لتشغيل مكونات نظام مراقبة النشاط. في حالة حدوث ارتفاع مفاجئ في الجهد أو انقطاع التيار الكهربائي في المبنى، قم بتوصيل وحدة UPS الاحتياطية بدائرة النسخ الاحتياطي للطوارئ في المبنى إذا كانت متوفرة. أما إذا كان النظام الذي يتحكم في الإضاءة داخل الحاضنة لا يخضع لتنظيم مباشر من قبل الحاضنة نفسها، فيكفي توصيل الحاضنة بالطاقة الاحتياطية دون الحاجة إلى وحدة UPS، حيث إن فقدان الطاقة لبضع ثوانٍ لن يؤثر على درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بإعداد جهاز كمبيوتر، سواء كان PC أو Macintosh، مخصص بالكامل لجمع البيانات و/أو للتحكم في الحضانات. قم بترتيب شبكة خطوط الهاتف يدويًا وبشكل منظم حول أرفف الحضانات ذات البيئة المتحكم بها لتسهيل عمليات توصيل وفصل النشاط. قم بتثبيت الشاشات وتوصيل خطوط هاتف متعددة بحيث تلتقي في خط رئيسي واحد يمتد خارج الحضانة للاتصال بجهاز الكمبيوتر، ثم صِل أجهزة المراقبة الموجودة داخل الحضانات بجهاز الكمبيوتر عبر وحدة واجهة مزود الطاقة، والتي تعمل على تزويد شاشة مراقبة النشاط بالطاقة عبر خط الهاتف.

أخيرًا، قم بتغطية مصادر الضوء المحتملة الناتجة عن مصابيح LED في الأجهزة الإلكترونية أو باب الحاضنة غير المحكم الإغلاق باستخدام شريط لاصق أو قماش أسود؛ وذلك لضمان قياس الإيقاعات الحرة في غياب الضوء غير المرغوب فيه. ومن الضروري تقييم هذه الأنماط الظاهرية باستخدام حيوانات ضابطة مناسبة يتم تربيتها في نفس الظروف البيئية وتكون من نفس العمر.

بالإضافة إلى ذلك، يوجد تباين جنسي في الإيقاع اليوماوي. والممارسة العامة هي استخدام ذباب الذكور البالغين في هذه المقاييس، بحيث يتم تربيتها عند 25 درجة Celsius وتتراوح أعمارها بين يوم واحد إلى خمسة أيام، لأن نشاط وضع البيض في إناث الذباب سيؤثر على القياس الحقيقي للنشاط الحركي. وعند فحص معايير الإيقاع اليوماوي والنوم والراحة لسلالات طافرة محددة محل الدراسة، فمن الحكمة إجراء تهجين خارجي للسلالة الطافرة مع سلالة النوع البري ذات الخلفية الجينية نفسها.

على سبيل المثال، W 1118 أو yw. ونظراً لعدم حدوث عبور وراثي في ذكور ذبابة الفاكهة (drosophila)، فمن الأفضل إجراء التهجين الخارجي عن طريق تزاوج الإناث الطافرة مع ذكور من النوع البري. يتم تربية كل من ذباب التحكم من النوع البري والذباب الطافر في نفس الوقت، وذلك في غذاء drosophila القياسي لمدة تتراوح من 10 إلى 14 يوماً تقريباً قبل تجربة إيقاع النشاط الحركي. وعند فقس النسل، يتم جمع الذكور التي تتراوح أعمارها بين يوم واحد وخمسة أيام وعزلها لاستخدامها في التجارب.

تمثل أنابيب النشاط الموطن الطبيعي للذبابة. وتكون هذه الأنابيب أثناء التجربة عبارة عن أنابيب زجاجية رفيعة بقطر 5 مليمتر، تحتوي على مادة غذائية في أحد طرفيها، وتُسد من الطرف الآخر باستخدام خيوط صوفية أو سدادة بلاستيكية. ويُفضل استخدام أنابيب نشاط مُحضرة حديثاً.

يتم تحضيرها عموماً قبل بضعة أيام إلى أسبوع من بدء التجربة. ونظراً لإمكانية إعادة استخدام أنابيب النشاط الزجاجية عدة مرات، تصف إجراءات التحضير التالية استخدام أنابيب نشاط مستعملة وغير نظيفة كنقطة بداية. أما في حال استخدام أنابيب نشاط جديدة، فيمكن الانتقال مباشرة إلى خطوة تعقيم الأنابيب بالـ autoclave كما هو موضح لاحقاً.

قم بإزالة السدادات من أنابيب النشاط المستخدمة وضعها في بيكر زجاجي كبير. يجب أن تملأ الأنابيب نصف البيكر فقط. املأ البيكر بمياه الصنبور، مع التأكد من غمر الأنابيب بالكامل.

ضع الكأس المملوء بالأنابيب الزجاجية في الميكروويف حتى يصل الماء إلى درجة الغليان الشديد. توخَّ الحذر عند إذابة الشمع وغذاء الآجار لأن الماء يكون ساخناً. أخرج الكأس من الميكروويف وحرك الأنابيب باستخدام ملعقة مسطحة (spatula) أو أداة بلاستيكية.

ماصة سعة 10 مليمتر للسماح للشمع المحبوس بالطفو إلى السطح. ثم كرر خطوة التسخين في الميكروويف. أخرج الكأس من الميكروويف وانتظر حتى يبرد.

سيؤدي وضع الكأس في الغرفة الباردة إلى تسريع العملية. ومع تبرد الماء، سيتجمع الشمع على سطح الماء ويتصلب تدريجيًا. قم بإزالة الشمع المتصلب يدويًا.

من شأن هذه الخطوة أن تزيل معظم الشمع الموجود على الأنابيب. انقل أنابيب النشاط إلى دورق جديد يحتوي على مياه صنبور نظيفة، وكرر عملية التسخين في الميكروويف وإزالة الشمع. وبما أن معظم الشمع قد أزيل في الخطوة السابقة، فليس من الضروري الانتظار حتى يتجمد الشمع.

ببساطة، اسكب الماء من الكأس وانقل الأنابيب إلى كأس جديد. توخَّ الحذر لأن الماء لا يزال ساخناً. كرر عملية التسخين في الميكروويف للمرة الأخيرة.

قم بسكب الماء من الكأس وانتظر حتى تبرد أنابيب النشاط. بعد ذلك، ضع أنابيب النشاط رأسيًا في كؤوس زجاجية سعة 250 milliliter أو 500 milliliter. تأكد من عدم تكديسها بشكل وثيق جدًا.

قم بتعقيمها باستخدام جهاز التعقيم (autoclave) في دورة تجفيف، أو ببساطة جفف الأنابيب في فرن تجفيف لتحضير الغذاء الذي سيتم تحميله في أنابيب النشاط. قم بإعداد محلول يتكون من 5% sucrose و 2% bact to agar في ماء مقطر أو ماء صنبور، ثم قم بتعقيم المحلول باستخدام جهاز التعقيم (autoclave). يمكن استخدام الغذاء المعقم فوراً أو تخزينه في درجة حرارة أربع درجات Celsius لفترة طويلة.

من الناحية المثالية، يجب أن تكون درجة حرارة الغذاء حوالي 65 درجة Celsius عند ملء أنابيب النشاط. استخدم ماصة سعة 10 milliliter لسحب محلول الغذاء السائل ووضعه على طول الجدار الداخلي للبيكر الزجاجي، مع ملء الأنابيب حتى تصل إلى ثلث سعتها من الأسفل إلى الأعلى. قم بهز البيكر برفق للتأكد من ملء جميع الأنابيب بمحلول الغذاء بشكل متساوٍ.

انتظر حتى يتصلب الغذاء تماماً إما في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 °C. وبمجرد اختفاء التكثف داخل الأنابيب الزجاجية، يمكن إخراج الأنابيب من الكأس. ولإزالة أنابيب النشاط من الكأس، ادفع الأنابيب باتجاه قاع الكأس وقم بتدويرها في الوقت ذاته بحيث ينفصل الغذاء المتصلب داخل الأنابيب عن قاع الكأس.

أخرج الأنابيب من البيكر، ويفضل سحبها كمجموعة واحدة. بعد ذلك، نظف الأنابيب واحدة تلو الأخرى باستخدام مناشف ورقية لإزالة بقايا الطعام الزائدة عن السطح الخارجي للأنابيب. ضع الأنابيب جانباً في حاوية نظيفة.

استخدم سخان كتل مختبري عام بدون حامل الأنابيب، وقم بتغطية بئر التسخين بعناية. باستخدام عدة طبقات من ورق الألمنيوم القوي، أضف حبيبات البارافين إلى بئر التسخين المبطن بالألمنيوم لصهرها، ثم أمسك الأنابيب من الطرف غير المخصص للغذاء واغمر الطرف المخصص للغذاء في الشمع المصهور. اغمر جزء الشمع في دورق زجاجي مملوء بالماء البارد لتسريع تصلب الشمع. كرر العملية.

سيؤدي غمس أنابيب الشمع في الماء مرة واحدة إلى منع التصاق الأنابيب ببعضها البعض. يمكن استخدام الأنابيب على الفور أو تخزينها في حاوية محكمة الإغلاق عند درجة حرارة 4 °C لاستخدامها لاحقاً. إن التخزين لفترة طويلة تتجاوز أسبوعاً واحداً سيؤدي إلى جفاف مفرط للغذاء.

إذا كانت الأنابيب مخزنة في درجة حرارة أربع درجات Celsius، فقم بتدفئتها حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق تركها على طاولة المختبر قبل الاستخدام. وقبل وضع الذباب في أنابيب النشاط، قم بتشغيل الحضانات التي ستُستخدم لإيواء أجهزة مراقبة النشاط. اضبط درجة الحرارة باستخدام مفاتيح تحكم الحضانة، وحدد نظام الإضاءة والظلام باستخدام وحدة التحكم في الإضاءة الخاصة بنظام DAM أو نظام التحكم في الإضاءة الخاص بالحضانة وفقاً للتصميم التجريبي المطلوب.

بعد ذلك، يتم تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون. ثم باستخدام فرشاة رسم دقيقة، انقل ذبابة واحدة بلطف إلى أنبوب النشاط. أمسك بمنتصف قطعة واحدة من الخيط يبلغ طولها حوالي نصف بوصة باستخدام ملقط دقيق، وأدخل الخيط في الطرف غير المخصص للغذاء من أنبوب النشاط لسد الفتحة ومنع الذبابة من الهروب أثناء التجربة.

مع السماح بتدفق الهواء إلى الأنبوب في الوقت ذاته، حافظ على وضع الأنبوب بشكل أفقي حتى تستيقظ الذبابة. ولمنع التصاق الذبابة بالطعام، أدخل الأنابيب في أجهزة مراقبة النشاط. وفي الموديل الأحدث والأكثر دمجاً من أجهزة مراقبة Tri Kinetics، من الضروري تثبيت الأنابيب في مكانها باستخدام أربطة مطاطية لضمان مرور شعاع الأشعة تحت الحمراء عبر الأنبوب في الموضع المركزي. وأخيراً، ضع أجهزة مراقبة النشاط في الحاضنات وقم بتوصيلها بنظام جمع البيانات عبر أسلاك الهاتف للتحقق.

استخدم برنامج تجميع نظام DAM للتأكد من توصيل جميع أجهزة المراقبة بشكل صحيح ومن أن البيانات يتم جمعها من كل جهاز منها. الآن وبعدما تم وضع الذباب في أنابيب النشاط وأصبح نظام مراقبة النشاط الحركي جاهزاً، يمكن البدء في تسجيل البيانات. يتم مزامنة الذباب وتدريبه عن طريق تعريضه لنظام الإضاءة المطلوب، سواء كان ضوءاً أو ظلاماً أو دورة LD، بالإضافة إلى نظام درجة الحرارة المحدد، وذلك لمدة تتراوح من يومين إلى خمسة أيام كاملة.

إن حالة التزامن الأكثر شيوعاً هي دورة ضوئية مظلمة تتكون من 12 ساعة من الضوء و12 ساعة من الظلام عند 25 درجة Celsius. ولدراسة الإيقاعات اليوماوية بالنسبة لهذا البروتوكول، يتم تحديد الوقت الذي تضاء فيه المصابيح في الحاضنة على أنه ZT 0، وتكون جميع الأوقات الأخرى نسبية لهذه القيمة. في ظل ظروف LD 12:12 القياسية، تظهر ذباب *Drosophila melanogaster* النمطي عادةً نوبتين من النشاط؛ إحداهما تتمركز حول ZT 0 وتسمى ذروة الصباح، والأخرى حول ZT 12 وتسمى ذروة المساء. وتُقاس إيقاعات النشاط الحركي ذات التشغيل الحر تحت ظروف الظلام ودرجة الحرارة الثابتة بعد فترة التزامن.

يمكن تغيير إعداد دورة الضوء في أي وقت خلال المرحلة المظلمة في اليوم الأخير من ld، بحيث يمثل اليوم التالي من التجربة اليوم الأول من dd. وتعد عملية جمع البيانات لمدة سبعة أيام من DD كافية لحساب الفترة اليوماوية وسعة أو قوة الإيقاع لدى الذباب. وبشكل عام، يلزم حجم عينة لا يقل عن 16 ذبابة للحصول على فترات تشغيل حرية موثوقة لنمط جيني معين.

عند ختام التجربة، يتم تنزيل البيانات الثنائية الخام التي جُمعت باستخدام برنامج نظام DAM على جهاز تخزين بيانات محمول، مثل مفتاح USB. وتتم معالجة البيانات الثنائية الخام باستخدام DAM file scan 1 0 2 x وتجميعها في فترات زمنية مدتها 15 و30 دقيقة عند تحليل المعايير اليوماوية، أو في فترات تتراوح من دقيقة واحدة إلى خمس دقائق عند تحليل النوم.

معايير الراحة. حالياً، يُعد خمول خمس دقائق متواصلة هو التعريف القياسي لراحة النوم في ذبابة الدروزوفيلا (drosophila). عند الانتهاء من هذا البروتوكول، يمكن استخدام مجموعة البيانات نفسها لمقارنة معايير الساعة البيولوجية ومعايير النوم بين الحيوانات التجريبية والحيوانات الضابطة فيما يتعلق بمعايير الساعة البيولوجية.

يمكن إنشاء رسوم بيانية تحريضية توضح الأنشطة الحركية اليومية أو متوسط الأنشطة للذباب على مدار عدة أيام في ظروف LD أو DD باستخدام fast x oph melanogaster، حيث تظهر عادةً نوبتان من النشاط، إحداهما تتركز حول ZT zero وتسمى ذروة الصباح، وأخرى حول ZT 12 وتسمى ذروة المساء. يتم التحكم في هاتين النوبتين من النشاط بواسطة الساعة الداخلية، ويمكن ملاحظتهما حتى في ظروف DD ذات التشغيل الحر. ويمكن ملاحظة التغيرات في توقيت ذروات النشاط هذه بسهولة في الرسوم البيانية التحريضية، وقد تشير إلى حدوث تغيير في خصائص الساعة الداخلية.

ثمة خاصية أخرى تشير إلى الوظيفة السليمة للساعة البيولوجية وهي الزيادة الاستباقية في النشاط الحركي الملحوظ في دورات LD، والتي تحدث قبل الانتقالات الفعلية من الظلام إلى الضوء أو من الضوء إلى الظلام. يظهر هذا السلوك بوضوح في ذباب النوع البري، ولكنه يغيب ويكون غير إيقاعي في طفرات per zero. في هذه الطفرة.

إن القمم الملحوظة في الصباح والمساء في ظروف LD هي مجرد استجابات جفلية ناتجة عن التغيرات المفاجئة في ظروف الضوء والظلام. لا تتوقع الذباب الذي يفتقر إلى الساعة البيولوجية التغيرات البيئية ولكنها تكتفي بالتفاعل معها. ويكون فقدان الإيقاع السلوكي أكثر وضوحاً في ظروف DD، ويتجلى عموماً في الفقدان التام لقمم نشاط الحركة الصباحية أو المسائية كما هو ملاحظ في ذباب per zero.

بالإضافة إلى رسومات الحث، يمكن تمثيل بيانات النشاط الحركي على شكل مخطط بياني مزدوج (double plot gram) لكل ذبابة فردية أو نمط جيني للذباب، حيث يتم رسم بيانات يومين بالتتابع على كل خط، ويبدأ ملف تعريف اليوم الأخير الخط التالي الذي يضم نشاط يومين إضافيين. على سبيل المثال، يتم رسم اليومين الأول والثاني من دورة الضوء والظلام (LD) على الخط الأول من مخطط ACTO. ويبدأ الخط التالي بتكرار اليوم الثاني من دورة LD، يليه اليوم الثالث، وهكذا.

باتباع هذا التنسيق، يتم توضيح بيانات النشاط الحركي التي تغطي التجربة بأكملها في مخطط ACTO gram، وتكمن إحدى مزايا مخططات ACTO grams مقارنة بمخططات الاختزال في أن التغير في طول فترة إيقاعات النشاط اليومي يمكن ملاحظته بسهولة، بالإضافة إلى إمكانية إنشاء مخططات الاختزال ومخططات ACTO grams.

يمكن إرسال بيانات النشاط الحركي من حالة DD إلى far X لحساب طول الفترة باستخدام عدد من البرامج المختلفة، بما في ذلك cycle P لتحليل معايير النوم والراحة، والتي تُعرّف بأنها خمس دقائق متصلة من عدم النشاط. ويمكن للمرء تحليل البيانات المسجلة من اختبارات النشاط الحركي وفحص معايير نوم متعددة باستخدام insomniac، وهو برنامج قائم على MATLAB، حيث يمكن حساب النسبة المئوية للوقت الذي تقضيه الذباب في النوم في فترات زمنية مختلفة. على سبيل المثال، النسبة المئوية للنوم كل ساعة أو كل 12 ساعة.

تشمل معايير النوم الأخرى الأكثر شيوعاً والتي يمكن فحصها متوسط طول فترة الراحة، وهو مقياس لمدى تماسك النوم ويمكن أن يوضح جودته. وهناك معيار آخر وهو عدد نشاط اليقظة، وهو مقياس لمعدل النشاط عندما تكون الذباب مستيقظة. يساعد هذا المعيار في التمييز بين الذباب المتأثر حقاً في سلوكيات النوم والراحة، وأولئك الذين يعانون من المرض أو فرط النشاط.

على سبيل المثال، قد يبدو أن الذباب المريض ببساطة ينام لفترات أطول لأنه ليس بنشط كالمعتاد، وبالنسبة لهذا الذباب، سيكون نشاط اليقظة لديه أقل مقارنة بالحيوانات الضابطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف الأنماط الظاهرية للساعة البيولوجية والنوم في ذبابة drosophila عن طريق المقايسة. الإيقاعات اليومية للنشاط الحركي.