عزل الخلايا البطانية صمامي

يتم في هذا البروتوكول المرئي توضيح كيفية عزل الخلايا الخلالية المقيمة والخلايا البطانية المحددة لكل جانب من صمام قلبي أبهري. يتم استئصال وريقة الصمام من القلب ووضعها في محلول ملحي بارد. يمكن إزالة الطبقة البطانية من كلا جانبي الوريقة عن طريق قشط النسيج بلطف وهو مغمور في محلول كولاجيناز باستخدام مسحة قطنية للعزل المحدد لكل جانب، وتُثبت وريقة الصمام على سرير من البارافين بحيث يكون السطح البطاني مكشوفاً.

تُضاف بعد ذلك بضع قطرات من إنزيم الكولاجيناز (collagenase) البارد إلى وريقة الصمام، وتُحضن الوريقات لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. وبعد التحضين مع الكولاجيناز، تُزال الطبقة البطانية المحددة للجانب عن طريق قشط الأنسجة بلطف. ومن ثم تُجمع الخلايا البطانية المتحررة باستخدام مسحة، ثم تُغسل وتُزرع في أطباق الزرع.

يتم بعد ذلك هضم الوريقات المتبقية طوال الليل لعزل الخلايا الخلالية التي يتم جمعها وغسلها. تُزرع جميع الخلايا المعزولة ويمكن استخدامها لفهم دورها في إصلاح صمامات القلب وإعادة تشكيلها استجابةً للإشارات الميكانيكية والبيولوجية المحلية. مرحبًا، اسمي راسل غولد.

أنا هنا في جامعة كورنيل، في قسم الهندسة الطبية الحيوية، حيث أعمل في مختبر بوتشر. سأوضح لكم اليوم كيفية عزل الخلايا البطانية الصمامية. وتمتد آثار هذه التقنية إلى فهم كيفية قيام الخلايا البطانية الموجودة باستمرار بالإصلاح وإعادة التشكيل استجابةً للإشارات الميكانيكية والبيولوجية.

لنبدأ الآن. في البداية، احصل على خنزير من المسلخ المحلي، واعمل بطريقة معقمة لاستئصال جذر الأبهر. اشطف جذر الأبهر جيداً للتخلص من الدم.

باستخدام DPBS بارد ومعقم، من الضروري إزالة جميع مكونات الدم في أسرع وقت ممكن للحد من موت الخلايا البطانية الصمامية أو VEC والتلوث البكتيري. لا ينصح باستخدام المضادات الحيوية ومضادات الفطريات في هذه المرحلة لأنها قد تكون ضارة بالخلايا. بعد ذلك، يتم العزل مباشرة من الجذر الثلاثي.

شرفات الصمام من كل صمام. يجب توخي الحذر عند عزل الشرفة لأن أي نسيج حلقي سيؤدي إلى تلوث المجموعة الخلوية. ضع الشرفات المعزولة في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 milliliter مملوء بـ 12 milliliters من DPBS البارد.

رجّ الوعاء عدة مرات لإزالة الشوائب وأعد ملأه بمحلول DPBS طازج. وأخيراً، انقل وريقات الصمام إلى المختبر على الثلج. عند الوصول إلى المختبر، ضع الحاوية التي تحتوي على النسيج تحت غطاء التعقيم، ثم ابدأ في عزل الطبقة البطانية، وقم بتعقيم الأدوات التالية في صينية أدوات مغطاة باستخدام الموصدة (autoclave): ملاقط نسيج مسننة، ومقصات نسيج، ومسحات قطنية.

قم أيضاً بتحضير محلول الكولاجيناز المعقم والوسط البطاني والوسط الخلالي، كما هو مفصل في البروتوكول المكتوب المرفق. املأ طبقاً معقماً بقطر 35 مليمتر بثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجيناز البارد لكل صمام، ثم ضع جميع الشرفات الثلاث من الأنبوب سعة 15 ملليلتر في الطبق.

يتم تحضين النسيج لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند درجة حرارة 37 °C. بعد ذلك، تُزال الطبقة البطانية برفق من كلا جانبي الوريقة عن طريق تدوير مسحة معقمة وجافة على السطح. ويعد اتجاه التدوير ومقدار قوة القص المطبقة أمرين حاسمين لضمان نقاء العينة.

يتم تدوير المسحة في اتجاه معاكس للحركة الخطية لليد التي تمسك بمسحة القطن. يؤدي ذلك إلى إيجاد قوة قص محكومة تعمل على رفع الخلايا البطانية من النسيج. وتكون كمية القوة المطبقة كافية للشعور بمقاومة النسيج، ولكن دون اختراق الغشاء القاعدي؛ ثم يتم غمس المسحة من حين لآخر في محلول collagenase لتحرير الخلايا من ألياف الطرف.

بعد الانتهاء من عملية المسح، يجب أن يبدو ملمس الطبقة البطانية أكثر نعومة قليلاً مما كان عليه من قبل. اجمع الخلايا المعلقة في محلول الكولاجيناز وانقلها إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 لتر. بعد مسح الخلايا البطانية من الوريقات، ضع الوريقات فوراً في أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على 10 milliliters من محلول الكولاجيناز لعزل الخلايا الخلالية.

قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 1000 RPM لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب أي خلايا معزولة، ثم اسحب السائل الطافي. أضف ثلاثة ملليلتر من الوسط الغذائي للخلايا البطانية (endothelial medium) إلى الأنابيب سعة 15 ملليلتر. قم بالطرد المركزي مرة ثانية كما سبق واسحب الوسط الغذائي.

تساعد عملية الطرد المركزي الثانية هذه في ترشيح بعض المواد غير المرغوب فيها مثل ألياف الرؤوس. أعد تعليق الخلايا البطانية المجهزة بالطرد المركزي في 5 mL من الوسط الزرعي للخلايا البطانية وازرع الخلايا في دورق T 25 مطلي مسبقاً بالكولاجين. باستخدام دورق واحد لكل أنبوب طرد مركزي، اترك الخلايا تنمو لمدة يومين إلى ثلاثة أيام على الأقل قبل تغيير الوسط الزرعي للخلايا البطانية.

يساعد هذا الخلايا على التعافي والانقسام. وبما أن عملية العزل قاسية إلى حد ما وقد يكون عائد الخلايا منخفضاً، فمن الضروري نقل الخلايا عندما تقترب من حالة التلاقي. ونظراً لأن التثبيط بالتلامس قد يؤدي إلى تحول الخلايا، يمكن أيضاً عزل الخلايا البطانية من جانب محدد.

للقيام بذلك، قم أولاً بتجهيز طبق بتري يحتوي على طبقة من البارافين. استخدم أطباق بتري زجاجية بقطر 60 مليمتر مع رقائق ألومنيوم. احسب طبقين زجاجيين لكل وريقة.

يساعد ورق الألومنيوم في إزالة البارافين لإعادة استخدام طبق بتري. بعد ذلك، ضع حبيبات البارافين في الأطباق حتى تمتلئ إلى النصف تقريبًا وقم بتغطيتها تمهيدًا للتعقيم بالأتوكلاف. بمجرد اكتمال عملية التعقيم وانصهار البارافين، انقل مجموعة الأطباق إلى سطح مستوٍ وبارد.

عندما يبرد البرافين، فإنه يتصلب ويشكل طبقة تدعم ثقوب الإبر. بعد مرور 60 دقيقة، يمكن استخدام الطبق المعقم لتثبيت أنسجة الشريحة. قم بإخراج الشريحات المعزولة من الصمام من أنابيب 15 milliliter وضعها على طبقة البرافين.

قم بتعديل وضع الوريقات بحيث يكون الجانب البطيني مواجهاً لأسفل على سطح البرافين، مع ترك جانب التليف مكشوفاً. ثبت حواف الوريقة بالدبابيس لكشف الطبقة البطانية. بعد ذلك، ضع بضع قطرات من إنزيم الكولاجيناز البارد على كل سطح بطاني مواجه للأعلى، واحضن النسيج لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند درجة حرارة 37 °C.

عند اكتمال فترة التحضين، قم بإزالة الطبقة البطانية برفق كما سبق عن طريق تدوير مسحة معقمة وجافة على سطح الوريقة. قم بغمس المسحة من حين لآخر في محلول الكولاجيناز (collagenase) لفصل الخلايا عن ألياف الطرف. بعد اكتمال عملية المسح، يجب أن يكون ملمس الطبقة البطانية أكثر نعومة قليلاً مما كان عليه في السابق.

اجمع معلق الخلايا وانقله إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 milliliter. تشير خصوصية الجانب إلى أنه يمكن تجميع الوريقات المأخوذة من نفس الصمام معاً. اشطف الصمام المثبت باستخدام بضع قطرات من DPBS البارد لغسل أي خلايا أو حطام متبقٍ.

انقل الوريقات إلى طبق زراعة جديد بحيث يكون الجانب البطيني مكشوفاً الآن، ثم اجمع الخلايا البطانية كما هو موضح للتو. بمجرد الانتهاء من مسح الخلايا البطانية من الوريقة G، ضع الوريقات فوراً في أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على 10 milliliters من محلول الكولاجيناز. اغسل الخلايا المعاد تعليقها، وقم بتعليقها وزراعتها كما هو موضح في عملية عزل الخلايا البطانية غير المحددة بالجانب.

إذا كان عائد الخلايا منخفضاً جداً، فكر في الانتقال إلى دورق أصغر أو استخدام طبق آبار. ونظراً لأن التصاق الخلايا ببعضها يعزز نموها، تذكر نقل الخلايا عندما تكون قريبة من مرحلة التلاقي. وبما أن التثبيط بالتلامس قد يؤدي إلى تحول الخلايا، ابدأ في عزل الخلايا الخلالية أثناء طرد الخلايا البطانية مركزياً، ثم قم بحضن الأنابيب التي تحتوي على الشرفات لمدة تتراوح تقريباً بين 12 إلى 18 ساعة.

في محلول الكولاجيناز (collagenase)، مع الرج بلطف إذا لزم الأمر. وفي نهاية فترة الحضانة، استخدم ماصة سيرولوجية لخلط النسيج المهضوم بلطف حتى يصبح معلق الخلايا متجانساً. يساعد هذا التجانس في تفتيت النسيج وتحرير الخلايا الخلالية، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً وغسلها كما هو موضح للخلايا البطانية.

باستثناء استخدام خمسة ملليلتر من وسط إعادة تعليق الخلايا الخلالية، يتم تعليق الخلايا الخلالية المفصولة بجهاز الطرد المركزي في 15 ملليلتر من الوسط الخلالي، ثم تُزرع الخلايا في قارورة T 75، مع استخدام قارورة واحدة لكل أنبوب طرد مركزي. تُترك الخلايا لتنمو لمدة يوم إلى يومين على الأقل قبل تغيير الوسط الخلالي، مع توقع وجود المزيد من حطام الأنسجة مقارنة بالخلايا البطانية. كما أن الخلايا الخلالية تصل إلى حالة التلاقي بشكل أسرع من الخلايا البطانية بطبيعتها، وتوفر إنتاجية خلوية أعلى كما هو موضح في هذه الصور التمثيلية.

يظهر شكل الخلايا البطانية الصمامية V Cs والخلايا الخلالية الصمامية المستزرعة بعد مرور يومين إلى ثلاثة أيام. وتظهر الخلايا البطانية شكلًا نموذجيًا حيث تتخذ الخلايا نمطًا يشبه رصف الحجارة وتبدأ في تكوين تجمعات.

تظهر مورفولوجيا VS.Exhibit تشابهاً مع الخلايا الليفية العضلية (myofibroblasts)، حيث تكون الخلايا عموماً مغزلية الشكل وقليلة الكثافة عند زراعتها حتى الوصول إلى درجة التلاقي، بينما تظهر ECS مورفولوجيا بطانية نموذجية حيث تتخذ الخلايا نمطاً يشبه رصيف الشارع (cobblestone pattern) ويكون نموها مثبطاً بالتلامس. أما VI CS فتظهر مورفولوجيا مشابهة للخلايا الليفية العضلية (myofibroblasts)، حيث تكون الخلايا عموماً مغزلية الشكل وغير مثبطة بالتلامس. ويمكن استنتاج الخصائص الوظيفية لكل من VEC و VIC من خلال التلوين. بالنسبة لـ امتصاص LDL المفلور.

ترتبط خلايا VEC بمستويات عالية من امتصاص LDL المأسيتل. وبينما ترتبط خلايا VIC بمستويات منخفضة من امتصاص LDL المأسيتل، يتم عرض المؤشرات الخلوية لكل من VEC وVIC هنا. تُظهر صبغة ECS نتيجة إيجابية لعامل von Willebrand بينما

لا تظهر صبغاً لعامل فون ويلبراند. علاوة على ذلك، تكون صبغة V CS سلبية لبروتين اكتين العضلات الملساء ألفا بينما تكون صبغة V CS إيجابية لبروتين اكتين العضلات الملساء ألفا. حسناً، أتمنى أن تكونوا قد تعلمتم الكثير من عمليات العزل التي أجريناها اليوم.

ومع ذلك، من المهم تذكر أن الغشاء القاعدي للخلايا البطانية هش للغاية، وأي خلل في المصفوفة الأساسية غالبًا ما يؤدي إلى تحرر خلايا ملوثة من بقية النسيج. وللتأكد من نجاح عملية العزل، يعد التوصيف أمرًا بالغ الأهمية لتقييم نقاء العزلات التي حصلتم عليها. نتمنى لكم التوفيق.