تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

في هذا الإجراء، يُستخدم تصوير الأوراق لتقييم حركة الخلايا الحارسة استجابةً للخلايا البكتيرية الحية. أولاً، يتم استزراع البكتيريا من مخزون الجلسرول وتحضير اللقاح. بعد ذلك، تُجمع أوراق شابة وسليمة وتُصبغ بـ propidium iodide.

تُقطع الأوراق المصبوغة وتُحضن قطع الأوراق فوق معلق بكتيري. وأخيرًا، يُفحص سطح الورقة تحت المجهر ويمكن قياس فتحات الثغور. تُظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر الفلوري تغيرات في فتحة الثغور استجابةً للبكتيريا.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنةً بالطرق الحالية، مثل استخدام القشور البشرية، في أن الورقة التي تتلامس مع البكتيريا تظل سليمة، مما يحاكي الظروف الطبيعية لاختراق البكتيريا للأوراق. لبدء هذا الإجراء، تُزرع بذور Arabidopsis في خليط بنسبة 1:1:1 من الوسط الزراعي، والفيرميكوليت، والبتموس. تُنمى النباتات في غرفة نمو وتُسقى حسب الحاجة.

تكون النباتات جاهزة للاستخدام في غضون أربعة إلى ستة أسابيع، عندما تظهر أوراق فتية متمددة بالكامل قبل مرحلة الساق الزهرية (bolting). قبل يومين من بدء التجربة، قم بتحضير خطوط زراعة البكتيريا؛ حيث يتم تخطيط Pseudomonas ringe من مخزون الجلسرول على وسط LB المعدل، وتحضينها لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية.

استخدم مزرعة حديثة لتحضير اللقاح، وابدأ دائمًا أطباق المزرعة من مخزونات الجلسرين. ونظرًا لأن البكتيريا تصبح أقل ضراوة بعد الزراعة الفرعية، استخدم البكتيريا التي نمت على الطبق لبدء مزرعة سائلة بحجم 10 milliliter من pseudomona singe. وفي دورق إرلينماير سعة 50 milliliter، قم بحضن المزرعة طوال الليل عند 28 degrees Celsius مع الرج القوي حتى تصل الكثافة الضوئية (od) عند 600 nanometers إلى قيمة تتراوح بين 0.8 و1.

قُم بقياس الكثافة الضوئية (OD) عند 600 نانومتر، ثم احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1,360 ×g لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا في ماء مقطر بحيث تكون الكثافة الضوئية النهائية 0.2. تقابل هذه القيمة 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر.

بعد تجهيز البكتيريا، انتقل إلى تحضير الأوراق وإجراء المقايسة لصبغها. أولاً، قم بتحضير محلول يوديد البروبيديوم (propidium iodide) أو PI بتركيز 20 micromolar في الماء. وتكفي كمية 10 milliliters من المحلول لصبغ ثلاث أوراق صغيرة في المرة الواحدة.

استخرج النباتات من غرفة النمو، وباستخدام الملاقط، افصل ثلاث أوراق فتية متمددة بالكامل. اغمر الأوراق كاملة في محلول PI لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أخرج الأوراق واشطفها سريعاً بالماء المقطر.

بعد ذلك، ضع ورقة بحيث يكون سطحها السفلي مواجهاً لأسفل على شريحة مجهرية. اقطع الورقة باستخدام شفرة حلاقة حادة إلى أربع قطع، مع استبعاد العرق الوسطي لضمان استواء الورقة على الشريحة من أجل تحضين البكتيريا مع الأوراق. أضف 300 µL من المعلق البكتيري تحت قطع الأوراق على الشريحة، وتأكد من ملامسة السطح السفلي للورقة للملقح.

قم بحضن العينات تحت نفس الظروف البيئية التي استُخدمت لنمو النباتات. وعندما يحين وقت فحص الأوراق تحت المجهر، انقل قطع الأوراق إلى شريحة جديدة بحيث يكون السطح السفلي موجهاً للأعلى. لاحظ أنه لا يتم استخدام غطاء الشريحة عند تثبيت الشرائح.

يمكن تصوير عينة الورقة نفسها عدة مرات أثناء الحضن، كما يمكن إعداد تسلسل زمني وفقاً لأهداف البحث. هنا، يُستخدم مجهر بؤري ماسح بالليزر لفحص الأوراق، ومراقبة السطح السفلي للأوراق للكشف عن فلورية PI باستخدام عينات الأوراق نفسها، والتقاط صور للثغور بمرور الوقت. احفظ الصور لقياس عرض فتحة الثغور.

قم بقياس عرض فتحة الثغور لـ 60 ثغرة على الأقل لكل معاملة عند كل نقطة زمنية. وباستخدام متصفح صور LSM، احسب المتوسط والخطأ المعياري لعرض فتحة الثغور. ويمكن حساب الدلالة الإحصائية للنتائج باستخدام اختبار t للطلاب (students t-test) المزدوج ذو الطرفين.

تمثل هذه الصورة نموذجاً لصورة مجهرية لسطح ورقة نبات arabidopsis باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر. في عرض المجال المضيء، يقوم صبغ بروبيديوم يوديد بتلوين الجدار الخلوي للخلايا الحية، مما يزيد من وضوح الخلايا الحارسة بالإضافة إلى السماح بتحديد الخلايا غير التالفة. ويمكن رؤية مجموعة من فتحات الثغور في هذه الصور المجهرية، بدءاً من الثغور المغلقة تماماً وصولاً إلى الثغور المفتوحة على اتساعها.

يتم تحديد الثغور المغلقة تماماً من خلال شكل الخلايا الحارسة. ويُعتبر عرض الفتحة صفر ميكرومتر بالنسبة للثغور المفتوحة. ويتم قياس عرض الفتحة الموضح باستخدام خط مستقيم يُرسم عبر أوسع منطقة في مسام الثغر.

هذه نتائج تجريبية نموذجية لمقايسة التلقيح الورقي الحي. تم تحضين أوراق نبات Arabidopsis في الظلام مع ثلاث سلالات مختلفة من بكتيريا pseudomonas Cy Ringe، وكانت البكتيريا P-S-T-D-C 3000 وحدها قادرة على فتح الثغور في الظلام، وفقًا لما تم قياسه من عرض فتحة 60 ثغرًا تم اختيارها عشوائيًا لكل سلالة بكتيرية. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تفاعلات البكتيريا والنبات لاستكشاف آليات الاستجابة المبكرة لمسببات الأمراض في الأنواع النباتية.