تقييم الاستجابة للعيش فوهي الخلايا البكتيرية باستخدام التصوير الجامعة ليف

في هذا الإجراء، يتم استخدام تصوير الأوراق لتقييم حركة الخلايا الحارسة استجابةً للخلايا البكتيرية الحية. أولاً، يتم استزراع البكتيريا من مخزون الجلسرين وتحضير اللقاح. بعد ذلك، يتم جمع أوراق شابة وسليمة وصبغها بصبغة propidium iodide.

يتم قص الأوراق المصبوغة وتحضين قطع الأوراق فوق معلق بكتيري. وفي النهاية، يتم فحص سطح الورقة تحت المجهر حيث يمكن قياس فتحات الثغور. وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر الفلوري تغيرات في فتحة الثغور استجابةً للبكتيريا.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام التقشير البشروي، في أن الورقة الملامسة للبكتيريا تظل سليمة، مما يحاكي الظروف الطبيعية لاختراق البكتيريا للأوراق. لبدء هذا الإجراء، تُزرع بذور Arabidopsis في خليط من وسط النمو والبيرميكوليت بنسبة 1:1:1 حجماً. تُنمّى النباتات في غرفة نمو وتُروى حسب الحاجة.

تصبح النباتات جاهزة للاستخدام في غضون أربعة إلى ستة أسابيع، عندما تظهر أوراق فتية مكتملة التمدد قبل مرحلة الساق الزهرية. قبل يومين من بدء التجربة، قم بتحضير مسحة مزرعة البكتيريا؛ حيث يتم تخطيط Pseudomonas ringe من مخزون الجلسرين على وسط LB المعدل، وتحضن لمدة 24 ساعة عند 28 درجة Celsius.

استخدم مزرعة حديثة لتحضير اللقاح، وابدأ دائماً أطباق المزرعة من مخزونات الجلسرين. ونظراً لأن البكتيريا تصبح أقل ضراوة بعد الاستزراع الفرعي، استخدم البكتيريا التي نمت على الطبق لبدء مزرعة سائلة بحجم 10 milliliter من pseudomona singe. قم بتحضين المزرعة في دورق إرلنماير بحجم 50 milliliter طوال الليل عند درجة حرارة 28 °C مع الرج الشديد حتى تصل الكثافة الضوئية (od) عند 600 nanometers إلى قيمة تتراوح بين 0.8 و1.

قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) عند 600 نانومتر واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1,360 ×g لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الخلايا في ماء مقطر بحيث تكون الكثافة الضوئية النهائية 0.2. تعادل هذه القيمة 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة لكل ملليلتر.

بعد تجهيز البكتيريا، ابدأ في تحضير الأوراق وإجراء المقايسة من أجل صبغ الأوراق. أولاً، قم بتحضير محلول يوديد البروبيديوم (PI) بتركيز 20 micromolar في الماء. وتكفي 10 milliliters من المحلول لصبغ ثلاث أوراق صغيرة في المرة الواحدة.

استخرج النباتات من غرفة النمو، وباستخدام الملاقط، افصل ثلاث أوراق شابة متمددة بالكامل. اغمر الأوراق كاملة في محلول PI لمدة خمس دقائق. ثم أخرج الأوراق واشطفها لفترة وجيزة بالماء المقطر.

بعد ذلك، ضع ورقة بحيث يكون سطحها السفلي متجهًا للأسفل على شريحة مجهرية. قم بتقطيع الورقة باستخدام شفرة حلاقة حادة إلى أربع قطع، مع استبعاد العرق الوسطي لضمان استواء الورقة على الشريحة من أجل تحضين البكتيريا مع الأوراق. أضف 300 µL من المعلق البكتيري تحت قطع الأوراق على الشريحة، مع التأكد من ملامسة السطح السفلي للورقة للملقح.

قم بحضن العينات تحت نفس الظروف البيئية التي استُخدمت لنمو النباتات. وعندما يحين وقت فحص الأوراق تحت المجهر، انقل قطع الأوراق إلى شريحة جديدة بحيث يكون السطح السفلي موجهاً للأعلى. لاحظ أنه لا يتم استخدام غطاء الشريحة عند تثبيت العينات على الشرائح.

يمكن تصوير عينة الورقة نفسها عدة مرات أثناء فترة الحضن، كما يمكن إعداد سلسلة زمنية وفقاً لأهداف البحث. هنا، يُستخدم مجهر بؤري ماسح بالليزر لفحص الأوراق، ومراقبة السطح السفلي للأوراق للكشف عن فلورة PI باستخدام عينات الأوراق نفسها، والتقاط صور للثغور بمرور الوقت. احفظ الصور لقياس عرض فتحة الثغور.

قِس عرض فتحة الثغور لـ 60 ثغرة على الأقل لكل معاملة عند كل نقطة زمنية. وباستخدام متصفح صور LSM، احسب المتوسط والخطأ المعياري لعرض فتحة الثغور. ويمكن حساب الدلالة الإحصائية للنتائج باستخدام اختبار t للطلاب (Students t-test) المقترن ثنائي الذيل.

هنا صورة مجهرية نموذجية لسطح ورقة نبات arabidopsis باستخدام مجهر confocal الماسح بالليزر. وفي وضع الحقل المضيء، يقوم يوديد البروبيديوم بصبغ جدران الخلايا الحية، مما يزيد من وضوح الخلايا الحارسة بالإضافة إلى السماح بتحديد الخلايا غير التالفة. ويمكن رؤية مجموعة من فتحات الثغور في هذه الصور المجهرية، بدءاً من الثغور المغلقة تماماً وصولاً إلى الثغور المفتوحة على اتساعها.

يتم تحديد الثغور المغلقة تماماً من خلال شكل الخلايا الحارسة. ويُعتبر عرض الفتحة صفراً ميكرومتر بالنسبة للثغور المفتوحة. يتم قياس عرض الفتحة الموضح باستخدام خط مستقيم يُرسم عبر أوسع منطقة في مسام الثغر.

تمثل هذه النتائج التجريبية النموذجية لاختبار التلقيح الورقي الحي. تم تحضين أوراق نبات Arabidopsis في الظلام مع ثلاث سلالات مختلفة من بكتيريا pseudomonas Cy Ringe، وكانت البكتيريا P-S-T-D-C 3000 هي الوحيدة القادرة على فتح الثغور في الظلام، وفقاً لقياس عرض فتحة 60 ثغراً تم اختيارها عشوائياً لكل سلالة بكتيرية. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التفاعلات بين البكتيريا والنبات لاستكشاف آليات الاستجابة المبكرة لمسببات الأمراض في الأنواع النباتية.