تقدير معدلات الإنتاج الفيروسات في النظم المائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد معدل إنتاج الفيروسات في المجتمعات الميكروبية المائية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تقليل وفرة الفيروسات الحرة في العينة المعنية مع الحفاظ على المجتمع الميكروبي الأصلي. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحضين العينات تحت ظروف محفزة وجمع عينات فرعية كل ساعتين إلى ثلاث ساعات لمدة تصل إلى 10 ساعات.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تعداد الفيروسات داخل العينات الفرعية التي تم جمعها من كل نقطة زمنية. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تحديد المعدل الذي زادت به وفرة الجزيئات الفيروسية داخل العينة وتحديد معدلات إنتاج الفيروسات. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح معدلات إنتاج الفيروسات داخل المجتمع الميكروبي من خلال عمليات التعداد، مما يسمح للباحثين باستنتاج معدلات نفوق الميكروبات الناتجة عن النشاط الفيروسي.

مرحباً بالجميع. اسمي أودري ماديسون، وأعمل في مختبر الدكتور Steven Milham وقسم الميكروبيولوجيا بجامعة تينيسي. اليوم، وبمساعدة تشارلز بودوف وكلير كامبل، سنعرض لكم إجراءً لتحليل معدلات إنتاج الفيروسات في الأنظمة المائية.

للقيام بذلك، نقوم بتقليل عدد الفيروسات الحرة في العينات وحساب المعدل الذي تعاود فيه الظهور نتيجة تحلل الكائنات الحية الدقيقة المصابة فيروسياً. نستخدم حالياً هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة إيكولوجيا الفيروسات وكيفية تأثيرها في تشكيل المجتمعات الميكروبية. والآن بعد أن قدمنا هذه المقدمة، دعونا نبدأ.

قبل البدء في هذا الإجراء، اجمع حوالي 20 لترًا من مياه البحر بطريقة معقمة قدر الإمكان. وبمجرد جمع العينة، قم بترشيح المياه مسبقاً عبر مرشح بقطر 142 ملم ومسامية 0.8 ميكرون. وبالنسبة للأنظمة ذات الإنتاجية البيولوجية العالية، يمكن القيام بذلك مسبقاً عن طريق الترشيح عبر مرشح ذو مسام أكبر أو مرشح من الألياف الزجاجية.

للحصول على مياه فائقة الترشيح، قم بتجهيز نظام ترشيح فائق مثل نظام AmCon M 12 المزود بخرطوشة غشاء ملفوف حلزونيًا لاستبعاد جميع الفيروسات. يتم بعد ذلك إزالة الفيروسات الموجودة في العينة وتركيزها عند سرعة تبلغ حوالي 25% من السرعة القصوى مع ضغط عكسي يتراوح بين 15 إلى 16 kilo pascals. يحتوي الرشاح، الذي يبلغ حجمه حوالي 500 milliliters، الآن على المجتمع الفيروسي المركز، والذي يمكن حفظه لدراسات أخرى، بينما يُستخدم الرشاحة الخالية من الفيروسات في فحوصات الإنتاج الفيروسي.

بعد كل يوم من الاستخدام، قم بتنظيف نظام Omicron M 12 لمنع تلف غشاء خرطوشة المرشح. عند العمل بمياه البحر، اشطف الغشاء بما لا يقل عن ستة لترات من مياه Milli Q، يليه غسيل بمحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 molar لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة. ثم اشطف الخرطوشة بما لا يقل عن ستة لترات إضافية من مياه Milli Q.

عند الانتهاء، يمكن تخزين الخرطوشة الحلزونية في محلول حمض الفوسفوريك بتركيز 0.05 molar عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. لبدء طريقة تقليل الفيروسات، يتم وضع 500 milliliters من عينة مياه البحر المأخوذة من نفس الموقع الذي جهزنا منه المياه الخالية من الفيروسات في وحدة ترشيح معقمة تحتوي على مرشح منخفض الارتباط بالبروتين وبحجم مسام اسمي 0.2 micro. في هذه المرحلة، يتم أيضاً جمع عينة فرعية لتحديد الوفرة الإجمالية للفيروسات والبكتيريا في المياه البدئية.

قم بتطبيق ضغط تفريغ بسيط على العينة بحيث يكون أقل من 200 millimeters of mercury مع الاستمرار في إعادة تعليق العينة باستخدام ماصة نقل معقمة لمنع تركيز الخلايا البكتيرية على المرشح، ثم أضف ببطء ثلاثة أضعاف الحجم (500 milliliters) من الرشاحة فائقة الترشيح إلى المعلق البكتيري لتقليل وفرة الفيروسات الحرة في العينة مع الحفاظ على المجموعات البكتيرية بكثافة ثابتة. وأخيراً، خفف الجزء البكتيري ليعود إلى 500 milliliters باستخدام مياه فائقة الترشيح خالية من الفيروسات. بعد ذلك، قسم العينة إلى ثلاث مكررات بحجم 150 milliliters لكل منها، وضع هذه المكررات في زجاجات بولي كربونات شفافة سعة 250 milliliter.

تمثل هذه المجموعة عينات الزمن صفر. خذ عينات لتقدير وفرة البكتيريا والفيروسات من عينات الزمن صفر الخاصة بك. انقل العينات إلى أنابيب حفظ بالتبريد (cryo vials) بتركيز نهائي يتراوح بين 2.0 إلى 2.5% من glutaraldehyde المعقم.

كمادة مثبتة، قم بالتجميد السريع لهذه العينات فوراً باستخدام النيتروجين السائل وخزنها عند درجة حرارة -80 °C حتى يتم معالجتها. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام نظام الترشيح الجرياني المماسي لتركيز الميكروبات البحرية. لاستخدام طريقة TFF، احصل على 500 mL تقريباً من العينة الطبيعية.

قم بتركيز هذه العينة باستخدام نظام ترشيح التدفق المماسي بقطر مسام اسمي 0.2 micron عندما يتم تقليل الجزء البكتيري إلى حوالي 10 إلى 15 milliliters باستخدام مياه خالية من الفيروسات مرشحة للغاية كما هو موضح في طريقة تقليل الفيروسات، ثم قم بتحضين الزجاجات المكررة الناتجة في ظروف تحاكي البيئة الطبيعية. وباستخدام غرف بيئية في البحر، نستخدم حاضنات مياه بحر متدفقة متصلة بإمدادات من المياه السطحية التي تحافظ على درجات الحرارة المحيطة. ويمكن مواءمة مستويات الضوء مع الظروف السطحية عن طريق استخدام أكريليك ملون بالأزرق أو شبكة تظليل ذات كثافة محايدة لتقليل شدة الضوء.

عند العمل من محطة ميدانية أو مختبر، أو عند عدم توفر مياه البحر للتدفق، يمكن استخدام حاضنة نمو مضيئة. استمر في جمع العينات الفرعية كل 2.5 hours لمدة 10 hours على الأقل باتباع الطريقة المطبقة على العينة في الزمن صفر. وبالإضافة إلى عينات الفحص المجهري، قد يرغب بعض الباحثين في جمع المياه لإجراء تحليل quantitative PCR لفيروسات محددة.

بالنسبة لعينات QPCR، أضف خمسة ملليلتر من العينة إلى أنبوب تجميد (cryo vial) خالٍ من أي مادة مثبتة، ثم قم بالتجميد السريع فوراً في النيتروجين السائل استعداداً لمجهر إنتاج الفيروسات. قم بإذابة العينات المجمدة على الثلج وتحضير المحاليل حديثاً كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد ذلك، ضع قرص ترشيح بقطر 25 مليمتر وبحجم مسام 0.02 ميكرون فوق مرشح دعم سليلوزي بمسام 0.45 ميكرون. ثم أضف 850 µL من العينة المثبتة إلى الجزء العلوي من مرشح anadi، وقم بعملية الشفط تحت تفريغ أقل من 20 kilo Pascals حتى تجف العينة تماماً.

بمجرد جفاف مرشح القرص الأنودي، يتم سحب 100 µL من محلول العمل Cyber Green بواسطة الماصة ووضعها في طبق بتري معقم. ومع استمرار تشغيل جهاز التفريغ، يرفع القرص الأنودي بعناية من برج الترشيح ويوضع فوق محلول Cyber Green. تُحضن العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

أخرج المرشح بعناية من محلول cyber green وقم بتجفيف الجزء الخلفي منه باستخدام منديل Kim wipe لإزالة جميع بقايا الصبغة. بعد ذلك، أضف قطرة صغيرة من محلول Antifa إلى شريحة مجهرية وضع غطاء الشريحة فوقها. ارفع غطاء الشريحة ثم ضع المرشح المجفف على الشريحة المجهرية.

مرة أخرى، أضف كمية صغيرة من محلول Antifa إلى غطاء الشريحة وضعه ببطء فوق المرشح، مع التأكد من إزالة أي فقاعات قد تتكون. قم بتعداد الفيروسات باستخدام المجهر الفلوري مع مرشح أزرق واسع؛ عُدّ ما لا يقل عن 20 مجال رؤية لكل مرشح، مع الحرص على قياس إجمالي الفيروسات من كل شبكة مجال لضمان التوزيع المتساوي للفيروسات عبر غشاء المرشح. احسب متوسط معدلات تكرار الفيروسات من الثلاث مكررات المستقلة وحدد الانحراف المعياري من معدلات الإنتاج. أخيراً، قم بتصحيح هذه المعدلات بناءً على تخفيف الكائنات الحية الدقيقة من الوفرة الأولية إلى الوفرة المخففة في العينة المختزلة من الفيروسات.

تتمثل مجموعة البيانات الأساسية الناتجة عن هذه الدراسة في معدلات تكرار وفرة الفيروسات في العينات الفرعية المأخوذة من عمليات التحضين. وتشكل هذه النتائج تحليلات انحدار مستقلة لوفرة الفيروسات مقابل الوقت لكل عينة من العينات. وقد تمت مراقبة إنتاج الجسيمات الشبيهة بالفيروسات على مدار تحضين استمر لمدة 10 hour في ظروف تحاكي الواقع باستخدام مجهر الفلوريسنت فوق البؤري (epi fluorescence microscopy).

جُمعت هذه العينات أثناء ازدهار العوالق النباتية قبالة ساحل نيوزيلندا في سبتمبر من عام 2008. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية تقدير معدلات إنتاج الفيروسات، وهو ما يتضمن استخدام أنظمة ترشيح فائقة مختلفة وإجراء تجارب لقياس معدلات إنتاج الفيروسات.

كذلك، أوضحنا لكم كيفية تعداد هذه الفيروسات باستخدام مجهر الفلورسنت فوق البنفسجي (epi fluorescence microscopy). عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام معدات نظيفة، والتعامل بحذر مع الفيروسات المصبوغة، وتقليل الإضاءة، ومعالجة العينات بسرعة، وتنظيف خراطيش الترشيح الفائق (ultra filtration cartridges) بشكل صحيح بعد كل استخدام. وهذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.