تمييز خلايا محددة HIV - 1 الإيجابية باستخدام المتجهات التي تعتمد على رؤيا Lentiviral وإذ تعرب عن البروتين الأخضر نيون

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الخلايا الإيجابية لفيروس HIV باستخدام ناقل لنتيفيروسي يعتمد على rev الخاص بفيروس HIV-1 ويحمل البروتين الفلوري الأخضر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنتاج جسيمات لنتيفيروسية تعتمد على rev من خلال التعداء المشترك (cot transfection). وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إصابة خلايا T البشرية من نوع CD4 بفيروس HIV-1.

بعد ذلك، يتم إجراء عدوى فائقة لخلايا T CD4 البشرية الإيجابية لفيروس HIV بجسيمات الفيروس البطيء التي تحمل جين GFP. وتتمثل الخطوة النهائية في تحديد الخلايا الإيجابية لفيروس HIV من خلال قياس الخلايا الإيجابية لـ GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لـ GFP عبر قياس التدفق الخلوي.

تمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل علاج عدوى HIV نظراً لأن الناقل المعتمد على rev يمكنه أيضاً نقل الجينات العلاجية والتعبير عنها بشكل انتقائي في الخلايا المصابة بـ HIV لتحفيز القضاء على الخلايا الإيجابية لـ HIV. سيقوم gi، وهو أستاذ مساعد للبحوث من مختبرنا، بشرح الإجراء لإنتاج جزيئات lentiviral المعتمدة على rev. يتم ترانسفكشن خلايا HEK 2 93 T بثلاثة بلازميدات، وهي ناقل GFP lentiviral المعتمد على rev، وبنية تغليف HIV one، وبلازميد يحمل البروتين السكري VSVG؛ وقبل يوم واحد من عملية ترانسفكشن البلازميد، يتم استزراع 2×10⁶ من خلايا HEK 2 93 T في 10 milliliters من الوسط الغذائي.

في طبق بتري بقطر 100 millimeter، يتم إنماء الخلايا طوال الليل عند 37 °C و5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، يُستبدل السائل الطافي من الخلايا بخمسة milliliters من وسط غذائي جديد.

ثم استمر في زراعة الخلايا لمدة أربع ساعات عند 37 °C، و5% carbon dioxide. قم بتحضير كواشف التعداء قبل نهاية فترة الحضانة التي تستغرق أربع ساعات. سيتم تعداء خلايا HEK 2 93 T بالبلازميدات الثلاثة بنسبة 10 µg من ناقل GFP lentiviral المعتمد على rev، و7.5 µg من بنية تعبئة HIV one، و2.5 µg من البروتين السكري VSVG.

أولاً، قم بالخلط المسبق لثلاثة من حمض الـ DNA البلازميدي بالنسب المطلوبة. بعد ذلك، جهز أنبوبين من البوليسترين سعة 5 mL. أضف 480 µL من محلول HBS المنظم بتركيز 2× إلى الأنبوب الأول وإلى الأنبوب الثاني.

أضف 60 µL من محلول منظم كلوريد الكالسيوم بتركيز 2 M إلى حمض DNAs البلازمي ومحلول التعداء (transfection buffer) ليصل الحجم الإجمالي إلى 480 µL. بعد ذلك، أضف خليط حمض DNA البلازمي وكلوريد الكالسيوم قطرة بقطرة إلى أنبوب HPS بتركيز 2×، ثم يتم تحضينه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

سيتكون راسب ناعم تدريجياً. الآن، أضف جميع الـ 960 µL من المزيج قطرة بقطرة بواسطة الماصة إلى خلايا HEK 2 9 3 T. تُحضن الخلايا عند 37 °C، و5% carbon dioxide طوال الليل.

في اليوم التالي، قم بإزالة السائل الطافي (S supernatant) وأضف 10 milliliters من الوسط الغذائي الطازج. قم بتحضين الخلايا مرة أخرى عند 37 degrees Celsius، و5%carbon dioxide طوال الليل. وبعد 48 ساعة من عملية عفن الخلايا (transfection)، قم بحصاد الفيروس عن طريق إزالة السائل الطافي (SUP natant) ونقله إلى أنبوب معقم سعة 50 milliliter.

أضف 10 milliliters من الوسط الغذائي الطازج إلى أطباق Petri واستمر في الزرع طوال الليل. احفظ الرائق الفيروسي عند درجة حرارة أربع degrees Celsius. استمر في الحصاد بعد 72 hours من عملية transfection عن طريق جمع الرائق ودمجه مع الرائق الذي تم حصاده مسبقاً.

ثم قم بطرد مركزي للطافي S عند 500 ×g لمدة 15 دقيقة لترسيب وإزالة حطام الخلايا. بعد الطرد المركزي، اجمع الطافي S وانقله إلى أنبوب جديد. ثم قم بترشيح الطافي عبر مرشح millipore بمسامية 0.22 µm.

سيتم تركيز الفيروس بشكل أكبر باستخدام عمود استبعاد الحجم، وهو ما سيتم توضيحه في الخطوة التالية لتركيز الجسيمات الفيروسية. قم بتحميل الطافي الفيروسي في عمود استبعاد الحجم ثم قم بالطرد المركزي عند 6,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة. اجمع الطافي الفيروسي المركز، مع تخصيص حوالي 100 µL لتحديد العيار الفيروسي.

قم بتقسيم الكمية المتبقية إلى حصص متساوية وخزنها في درجة حرارة 80- درجة مئوية. يعد تحديد العيار الفيروسي أحد أكثر الجوانب أهمية في هذا الإجراء. حيث يلزم وجود تعددية عدوى أعلى لتحقيق عدوى فائقة للخلايا باستخدام ناقل GFP VIR.

من أجل الحصول على نسبة الخلايا الموجبة لبروتين GFP التي يمكن الكشف عنها بواسطة قياس التدفق الخلوي لتحديد عيار الفيروس. سيتم إصابة خط خلايا jerk cat الموجبة لفيروس HIV-1 والمعالجة بـ TNF بالرائق الفيروسي. يتم استنبات هذه الخلايا الموجبة لفيروس HIV-1.

في طبق يحتوي على 96 بئراً بكثافة 2.5 × 10⁵ خلية/مل في حجم إجمالي قدره 100 µL. يتم تحضير ستة تخفيفات متسلسلة بمعدل عشرة أضعاف من الجزيئات الفيروسية اللنتيفيرية المعتمدة على الريفرساز لإصابة الخلايا الموجبة لـ HIV-1؛ أضف 100 µL من كل تخفيف متسلسل للفيروس إلى كل بئر من الخلايا. تحضن العينات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 °C لمدة سبعة أيام.

يتم تقدير عيار الجسيمات عن طريق ملاحظة الخلايا الموجبة لـ GFP تحت مجهر فلوري. وتُجرى الحسابات وفقًا لطريقة Reid و MU، ويُحدد العيار بنقطة التخفيف التي يمكن أن تؤدي إلى ظهور آبار موجبة لـ GFP. في 50% من الآبار المصابة بعلامة IV تظهر خلايا موجبة واحدة باستخدام الجسيمات lentiviral المعتمدة على rev.

سيتم أولاً إصابة خط خلوي من خلايا T CD4 البشرية بفيروس HIV-1. نستخدم 2×10⁵ خلية لكل عملية إصابة. قبل الإصابة بساعتين.

أضف poly brain إلى الخلايا ليصل التركيز النهائي إلى 4 µg/mL. تُحضن الخلايا عند 37 °C لمدة ساعتين. بعد ذلك، يتم إصابة الخلايا عن طريق تقطير محلول HIV في أحد أنابيب الـ 5 mL.

أما أنبوبا الخلايا الآخران فغير مصابين وسيعملان كمجموعات ضابطة. تُحضن جميع الخلايا عند 37 °C لمدة ساعتين. بعد مرور ساعتين، تُفصل الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة 10 دقائق، ثم يُغسل الفيروس الخالي من الخلايا عن طريق التخلص من الطافي، وتُعلق الخلايا مجدداً في وسط غذائي جديد بتركيز 2 × 10⁵ خلية/مل، وتُزرع عند 37 °C لمدة 48 ساعة.

بعد مرور 48 ساعة، تصبح الخلايا المصابة بـ HIV جاهزة للعدوى. وبالنسبة للجسيمات lentiviral المعتمدة على rev، يتم استخدام 2×10⁵ من الخلايا للعدوى بإضافة 100 µL من الجسيمات lentiviral إلى الخلايا المصابة بـ HIV V1؛ وكعينة ضابطة، يتم أيضاً إصابة خلايا T CD4 البشرية غير المصابة بـ HIV V1 بـ 100 µL من الجسيمات lentiviral. تُحضن الخلايا عند 37 °C طوال الليل، ثم يتم المتابعة في اليوم التالي.

استبدل الوسط المستنفد بوسط جديد، وأعد تعليق الخلايا بتركيز 2 × 10⁵ خلية/ملل. بعد 48 ساعة من العدوى، قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، ثم أعد تعليقها في 500 µL من Paraformaldehyde بتركيز 1%، وانقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي لإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي. بعد تحضين الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، يمكن تحليلها باستخدام محلل fax scan للكشف عن إيجابية GFP.

في حالة تنفيذ التجارب بنجاح، سيسمح الناقل اللينتي فيروسي V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A المعتمد على النسخ بالكشف عالي التخصص عن فيروس HIV المتضاعف في مجموعات الخلايا الحية من خلال قياس تعبير البروتين الفلوري الأخضر GFP. في هذا المثال، تم صبغ خلايا C-E-M-S-S المحصودة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة من الجرذ موسوم بـ PE ضد mouse CD 24 HSA، ثم تم تحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي للكشف عن تعبير كل من HSA وGFP كما هو موضح هنا. وقد تم رصد مجموعة كبيرة من GFP في الخلايا المصابة بفيروس HIV one والتي تعرضت لعدوى فائقة بـ V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.

في المقابل، لم يتم الكشف عن خلايا موجبة لـ GFP سواء في خلايا C-E-M-S-S غير المصابة بـ HIV V one بدون عدوى فائقة بالفيروسات البطيئة أو في الخلايا غير المصابة بـ HIV one مع عدوى فائقة بالفيروسات البطيئة. تذكر أن العمل مع HIV يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل مستويات السلامة البيولوجية من خلال الممارسات المعتمدة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.