خلية الى خلية ضخم الجزيئات النقل الفحص في بلانتا الاستفادة من قصف Biolistic

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل مدى انتقال البروتين المسمى بفلوروسنت من خلية إلى أخرى في بشرة النبات. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحصول على جزيئات ذهبية مغلفة بـ DNA للتعبير العابر عن بروتين اندماجي محدد في بشرة النبات. وكخطوة ثانية، يتم إيصال DNA إلى بشرة النبات، مما يسمح بتعبير وحركة البروتين الاندماجي المختبر.

بعد ذلك، يتم فحص البروتين الاندماجي المُعبّر عنه تحت مجهر بؤري (confocal microscope) لمراقبة تعبير وتوطن البروتينات المختبرة والموسومة فلورياً. يتم الحصول على نتائج توضح مدى انتقال البروتين الموسوم فلورياً من خلية إلى أخرى بناءً على تحليل توزيع الإشارة الفلورية بواسطة المجهر البؤري. مرحباً، أنا بن مايرز من مختبر KY في قسم الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية بجامعة ولاية نيويورك في ستوني بروك.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحليل مدى انتقال البروتينات الموصومة بفلورية من خلية إلى أخرى في بشرة النبات. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة النقل من خلية إلى أخرى لبروتينات حركة الفيروسات النباتية في خلفيات نباتية متنوعة، ولمقارنة القدرة على التنقل من خلية إلى أخرى لأنواع مختلفة من البروتينات. لذا، فلنبدأ.

لبدء هذا البروتوكول، قم بزراعة نبات arabidopsis واحد على تربة Promix bx. وفي وعاء بحجم مناسب، استخدم غرفة محكومة بيئياً ذات فترة ضوئية قصيرة ورطوبة نسبية تتراوح بين 40 إلى 65%؛ أما بالنسبة لنباتات nicotiana, hamana ونباتات تبغ nicotiana، فقم بزراعة كل نبات على تربة Promix BX في وعاء أكبر. ومرة أخرى، وفر غرفة محكومة بيئياً ذات فترة ضوئية طويلة ورطوبة نسبية تتراوح بين 40 إلى 65%.

قم بتسميد النبات من حين لآخر باستخدام المنتجات المتاحة تجارياً كما تم وصفه سابقاً. بعد زراعة نبات Opsis لمدة تتراوح من ستة إلى ثمانية أسابيع، اختر للأعمال التجريبية الأوراق التي يزيد حجمها عن 15 millimeter في 35 millimeter، حيث يشمل قياس الطول العنق. وبالنسبة لنباتات end benanna وNAC، تُزرع النباتات لمدة تتراوح من سبعة إلى 10 أسابيع؛ ثم اختر أوراقاً يزيد حجمها عن 50 millimeter في 70 millimeter لنبات end benanna و100 millimeter في 125 millimeter لنبات nac.

في هذه الحالات، لا تشمل قياسات الطول منطقة الـ peole. وقبل البدء في عملية توصيل الجسيمات الدقيقة المغلفة بـ DNA عبر الـ BIC، قم بتجهيز خرطوشة مسدس الجينات بجسيمات ذهبية دقيقة مغلفة بـ DNA كما تم وصفه بالتفصيل سابقاً. بعد ذلك، قم بإزالة الأوراق التي تمر بنفس المرحلة التنموية باستخدام شفرة حلاقة حادة، وضعها على الفور بحيث تكون جوانب AAL متجهة للأعلى على سطح مستوٍ من مادة الستيروفوم.

يمثل الجانب السفلي (ABA) للورقة ركيزة أفضل للقذف بسبب انخفاض كثافة الشعيرات وطبقة الكيوتيكل الرقيقة. يمكن تثبيت الأوراق الصغيرة، مثل أوراق نبات rapid opsis، عن طريق تغطيتها بقطعة من شبكة سلكية وتثبيت الشبكة بدبابيس ضغط على سطح البوليسترين. حافظ على استواء الأوراق لزيادة كفاءة توصيل الجسيمات وتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة أثناء القذف المجهري.

بعد ذلك، أدخل الخرطوشة التي تحتوي على جسيمات دقيقة مغلفة بالـ DNA في مسدس الحقن. بالنسبة لعملية الحقن في أرنب، يتم إطلاق الحقن عند ضغوط تتراوح من 140 إلى 160 PSI للجسيمات الدقيقة بحجم 0.6 micron.

قم بقذف العينة باستخدام خرطوشة واحدة لكل ورقة لتوزيع الجسيمات الدقيقة على مساحة سطح يتراوح قطرها من 10 إلى 12 مليمتر. بالنسبة لـ end benanna و end baum، يتم إجراء القذف عند ضغوط تتراوح من 160 إلى 180 PSI للجسيمات الدقيقة بحجم 0.6 ميكرون مع أوراق end benanna و end tobacco الأكبر حجماً.

من الممكن إجراء عمليات قذف متعددة على الورقة نفسها، ومع ذلك، يجب تنفيذها في مواضع متماثلة على كل جانب من العرق الوسطي لاستهداف مناطق الورقة التي تمر بنفس المرحلة التنموية. يتم تصور الإشارة الفلورية للبروتينات الموسومة المعبر عنها بشكل عابر بواسطة المجهر البؤري. يجب توخي الحذر لإيجاد إعدادات المجهر المثلى للكشف عن كل بروتين تم اختباره.

استخدم عدسة شيئية بقوة 40x لملاحظة البروتينات التي تظهر تراكمًا داخل خلويًا محدودًا مع شدة إشارة ضعيفة، مثل التموضع في الغشاء البلازمي لفيروس موزاييك التبغ، أو بروتين الحركة T-M-V-M-P. يوفر هذا دقة أعلى وحساسية معززة. ومع ذلك، يمكن استخدام عدسة شيئية بقوة 10x مع وظيفة التكبير البؤري (confocal zoom) للتصوير السريع للبروتينات التي تظهر توزيعًا سيتوبلازميًا مع شدة إشارة قوية، مثل البروتين الفلوري الأصفر الحر YFP. ويُستدل على النقل البسيط من ظهور تجمعات خلوية متعددة تحتوي على الإشارة الفلورية.

يشير عدد هذه العناقيد وعدد الخلايا في كل عنقود إلى مدى النقل من خلية إلى أخرى. وللحصول على بيانات موثوقة، سجل ما لا يقل عن 100 من عناقيد التعبير لكل نظام تجريبي، مع الحرص على إجراء التجارب في وقت واحد.

عند إجراء المقارنات. هنا، تم رصد النقل المبسط للبروتينات الملحقة بعلامات فلورية. وتظهر الصور المجهرية البؤرية التقليدية التي تم الحصول عليها بعد القصف المجهري لورقة نبات end hamana باستخدام بناء يعبر عن A TMV mp YFP.

تُلاحظ الحركة المبسطة لبروتين TMV MP YFP بناءً على ظهور تجمعات متعددة الخلايا من إشارة YFP. ومع ذلك، ليست كل بروتينات TMV MP YFP التي تم التعبير عنها بشكل عابر قادرة على الحركة، كما يتضح من الإشارة أحادية الخلية في بعض عمليات القذف الميكروي.

إحصائياً، في أقل من 40% من مجموعات الإشارات التي تم عدّها، يعجز TMV MP YFP عن الانتقال بين الخلايا. بينما في أكثر من 60% من المجموعات، ينتقل البروتين بين خليتين إلى خمس خلايا. وبما أن الانتشار عبر خليتين هو الأكثر تكراراً، فإن البروتينات ذات الحجم الجزيئي الصغير نسبياً والتي تفتقر إلى نشاط حركي ذاتي يمكنها الانتشار عبر غشاء الخلية البلازمي لتنتقل من خلية إلى أخرى.

على سبيل المثال، ينتشر البروتين YFP الحر أو جزيء واحد من XYFP بين عدة خلايا وفي أكثر من 30% من التجمعات التي تم عدها. وعلى العكس من ذلك، لا يحدث هذا الانتشار غير النوعي في حالة dimer YFP انتقالي أو جزيئين من XYFP، وهو ما يماثل في حجمه البروتين الاندماجي TMV MP YFP ويكون مستقلاً تماماً داخل الخلية. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحليل الحركة من خلية إلى أخرى للبروتينات الموُسّمة فلورياً باستخدام التعبير العابر عن طريق نظام مسدس الجينات في بشرة النبات.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تحضير نباتات صحية وقوية، وجسيمات ذهبية مغلفة بـ DNA عالية الجودة لإيصال الـ DNA، وتحليل عدد كافٍ من عناقيد التعبير الجيني للحصول على نتائج موثوقة إحصائياً. هذا كل شيء، شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.