Name: تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-13T23:59:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: اكتشف طرق الفحص المختبري لدراسة تفاعلات خلايا شفان مع الخلايا النجمية في إصلاح إصابات الحبل الشوكي. تساعد هذه التقنيات الباحثين على فهم ديناميكيات الهجرة والتكامل الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر فيليبا ارن للحصول على مساعدة عينية لها.

1. حدود الفحص : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد الشرائح المغلفة الدائرة مع بولي - D - يسين الشرائح الزجاجية بين عشية وضحاها ومعقمة قبل بدء التجربة : إعداد الأساسية. مستعدة المتوسطة التي تستخدم في التعديل متوسطة Dulbecco النسر (DMEM) ، على أن تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) ، و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين - Fungizon (PSF). كما يتم تحضير زجاجة من الكالسيوم / المغنيسيوم حل هانكس مجانا الملح المتوازن (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وtrypsinized الأولية الفئران خلايا شوان المستزرعة في قارورة لمدة 3 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو trypsinized الأولية ثقافة نجمية الفئران لمدة 5 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو inactived التربسين بإضافة DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ PSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل Trypsinized خلايا شوان والخلايا النجمية لفصل 15 مل أنابيب الصقر وطرد في 300G لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي خلايا شوان والخلايا النجمية إعادة علقت في كثافة 2 × 10 6 (انظر القسم لممثل نتائج التغيرات في كثافة الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع قطرة 50 ميكرولتر من تعليق خلية شوان في نهاية واحدة من الآبار المغلفة PDL الشريحة الغرفة. وقد استخدم الشريط الزجاج لتشويه الانخفاض نحو وسط الغرفة لإنشاء حافة مستقيمة. (استخدام قطع الزجاج ، وقطع الزجاج coverslips مستطيلة طوليا بحيث أنه يلائم عرض الشرائح المستخدمة في غرفة المقايسات الحدود) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت قطرة والثاني من 50 ميكرولتر من تعليق نجمية في الطرف الآخر من نفس البئر وطخت نحو الوسط لخلق حافة مستقيمة موازية للتشهير مع أول قطرة صغيرة 0.2mm فجوة بينهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغرفة التي تحتوي على شرائح توضع قطرات في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة ، وكانت تغسل مع الثقافات DMEM لإزالة غير المرفقة الحطام الخلوية والمتوسطة الطازجة التي تحتوي على DMEM / 10 ٪ FCS / 1 ٪ PSF المضافة. ملاحظة : DMEM / 10 ٪ FCS / 1 ٪ يمكن أن تستكمل قوات الأمن الفلسطينية مع forskolin (2μM) واستخراج الغدة النخامية البقري (BPE) (10μg / مل) تحفز تكاثر الخلايا شوان. وسوف تزود BPE عوامل النمو اللازمة للسماح طويلة المدى خلية شوان الثقافة وforskolin يثير مستويات الأدينوزين الحلقي الأدينوساين داخل خلايا شوان للحث على الانتشار </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم استزراع خلايا لحوالي 8-10 أيام عند 37 درجة مئوية ، و 7 ٪ CO 2 الحاضنة. المتوسط ​​يتطلب تغيير كل 3 أيام. سوف الجبهات الخلية two تصل في النهاية بعضها البعض ، وحدود حادة ستشكل بين أنواع الخلايا اثنين. ويمكن في هذه المرحلة يتم تحليل التجارب من العوامل التي تدخل في تشكيل الحدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن ان تكون ثابتة شارك في ثقافة استخدام الفورمالدهايد 4 ٪ ويمكن immunostained خلايا شوان مع P75 المضادة للأجسام المضادة والخلايا النجمية مع أجسام مضادة للGFAP لتحديد الخلايا في الثقافة المشتركة. P75 الضد تعترف منخفضة تقارب NGF مستقبلات على خلايا شوان التي تفتقر الخلايا النجمية. الأضداد المضادة للGFAP تعترف الدبقية firbrillary البروتين الحمضية التي يموضع إلى السيتوبلازم نجمية. (يرجى الرجوع إلى الشكل 1A ممثل عن الحدود) </li></ol> 2. الهجرة الفحص : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 لوحات جيدا (15mm الآبار) والمغلفة PDL بين عشية وضحاها ، وأعد لخلق monolayers نجمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة هي trypsinized نجمية الابتدائية لمدة 5 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. هو المعطل التربسين بإضافة DMEM تستكمل مع FCS 10 ٪ و 1 ٪ PSF وطرد في الخلية 300G لمدة 5 دقائق. (انظر الشكل 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والنجمية إعادة علقت في الخلايا 1x10 5 / مليلتر. يضاف 1 مل من هذا الحل لكل PDL مغلفة جيدا في 4 لوحات جيدا. يتم استزراع الخلايا النجمية ل24-48 ساعة حتى أحادي الطبقة غير متلاقية تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم شوان الهجرة خلية على monolayers نجمية ، بالتوازي مع خلق monolayers نجمية ، يتم وضع الزجاج الدائرية coverslips PDL المغلفة في أنبوب 50 مل وسحقت باستخدام ماصة بلاستيكية لإنشاء أجزاء صغيرة من الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل شظايا الزجاج في بئر في 6 طبق طبق بشكل جيد ومناسب باستخدام الملقط شظايا يتم اختيار الحجم وتوضع في آبار أخرى. توضع شظايا الزجاج 5 في كل بئر في 6 لوحات جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وtrypsinized الأولية خلايا شوان المستزرعة في قارورة لمدة 3 دقائق باستخدام التربسين 0.1 ٪. يتم نقل Trypsinized خلايا شوان لفصل 15 مل أنبوب الصقر وطرد في 300 G لمدة 5 دقائق. هي خلايا شوان إعادة علقت في 2X 10 6 خلية / مل في DMEM/10 ٪ PSF FCS / 1 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف 20 قطرات ميكرولتر من خلايا شوان تعليق على كل أجزاء ساترة 5 6 لوحات وضعت في الخلايا بشكل جيد ويتم تحضين في 37 ° C CO ، 7 2 ٪ لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 2 ساعة ، هي التي تعلق على خلايا شوان إلى شظايا ساترة وDMEM/10 ٪ FCS / 1 ٪ PSF (تستكمل مع 2μM من forskolin و10μg / مل من BPE يضاف إلى كل بئر بحيث يتم تغطيتها بالكامل مع شظايا متوسطة) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم توضع على لوحات تحتوي على 6 جيدا شظايا في حاضنة لل24-48 ساعة حتى شظايا الزجاج ويخدع بالكاملبطلاقة مع خلايا شوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة هي شظايا متموجة مع خلايا شوان ، واختار كل قطعة بعناية حتى باستخدام الملقط حادة وتراجع في HBSS لإزالة الخلايا غير مرتبط ثم وجه مقلوب أسفل إلى المونولاير نجمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم تغطية كل جيدا مع 1 مل من DMEM/10 ٪ مسموح FCS / 1 ٪ PSF وخلايا شوان لترحيل للفترة 24-48. ويمكن خلال هذه الفترة التجريبية يمكن إضافة الكواشف مثل عوامل النمو لتقييم تأثيرها على عدد وبعد الهجرة من خلايا شوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة والهجرة ، ويتم إصلاح شظايا الزجاج في الجزء السفلي من كل بئر وذلك بإضافة بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) لمدة 30 دقيقة. التثبيت التالية ، immunostain خلايا شوان لP75 (الاعتراف انخفاض مستقبلات تقارب NGF) ثم وصمة عار لهم باستخدام ABC strepavidin محفظة diaminobenzidine (DAB) ، للسماح التصور للخلايا شوان تحت المجهر الخفيفة. </li></ol> 3. ممثل النتائج : بعد 8-10 أيام شفان نجمية المشترك الثقافات تظهر حدود حادة بين أنواع الخلايا اثنين. هذه الحدود هي أكثر وضوحا إذا تم استخدام forskolin وBPE في الثقافة وشوان تكاثر الخلايا ويتعزز. إذا لوحظ أي الحدود خلال الفترة من يوم 10 ، ويمكن زيادة الوقت للثقافة أخرى حتى يتم تأسيس حدود. تغيير نسبة كثافة الخلية هو وسيلة بديلة لزيادة تكوين الحدود. ويمكن استخدام الخلايا نجمية الكثافة عند إعداد تعليق الخلية 8،18 : نسبة شفان 3:1. immunostaining التالية للتعرف على خلايا شوان والخلايا النجمية ، لتقييم اختلاط الخلية يمكن رسم خط حيث تم تأسيس الحدود ويمكن عدها عدد خلايا شوان يهاجرون إلى الأراضي نجمية تحت المجهر مضان. وأدناه مثالين من الصور التي تم الحصول عليها حدود ، واحدة مع الفصل بشكل جيد من خلايا شوان والخلايا النجمية الشكل (1A) واحد حيث لم يفصل الخلايا بشكل جيد في المناطق المختلفة بسبب أسلوب الفقراء (الشكل 1B). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig2.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> مقايسة الحدود الرقم 1 : شفان نجمية التفاعل. أ) لمدة 10 أيام شارك في ثقافة الفحص في حضور وforskolin BPE شوان لتحفيز تكاثر الخلايا يوضح حدود حادة بين أنواع الخلايا اثنين (الحمراء = P75 ، أخضر = GFAP). ب) يوم 10 شارك في الثقافة مقايسة حيث لم يتم تشكيل الحدود والجبهات two الخلية المختلطة. كان هذا بسبب اختلاط قطرات اثنين في حين وضع قطرات خلية نجمية وشوان بجوار بعضها البعض أثناء إعداد الحدود (الحمراء = P75 ، أخضر = GFAP). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig1.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. صورة ممثل المونولاير نجمية متكدسة المقايسات تقييم حركة الهجرة من نوع خلية واحدة على سطح الخلية ونوع آخر تقييم بالتالي ظاهرة مختلفة عن تلك التي تشكل الحدود. وهناك حاجة لضمان الممارسة على عكس coverslips على monolayers لا يؤدي إلى الأضرار التي لحقت خلية شوان المغطاة شظايا الزجاج وmonolayers نجمية بواسطة الملقط حادة. ويمكن لتقييم الهجرة من خلايا شوان ، والمسافة القصوى للهجرة وعدد من الخلايا المهاجرة من على حافة ساترة تقاس تحت المجهر الخفيفة. وأدناه صورة خلايا شوان ملطخة P75 باستخدام الأجسام المضادة تلطيخ DAB على سطح المونولاير نجمية (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/2214/2214fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> فحص الهجرة الرقم 3. مقلوب باستخدام مقايسة ساترة. أ) خلايا شوان (البني ، immunostained مع P75 الضد) المهاجرة بعيدا عن حافة ساترة. يشير السهم إلى اتجاه الهجرة بعيدا عن الخلية ساترة.

<ol><li>Assouline, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+astrocytes+and+Schwann+cells+in+culture+synthesize+nerve+growth+factor-like+neurite-promoting+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors.</a> Brain Res. 428, 103-118 (1987).</li>
<li>Taylor, J. S., Bampton, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+secreted+by+Schwann+cells+stimulate+the+regeneration+of+neonatal+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells.</a> J Anat. 204, 25-31 (2004).</li>
<li>Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+and+cell+adhesion+molecules%3A+neuronal+receptors+that+regulate+axon+growth+on+extracellular+matrices+and+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Integrins and cell adhesion molecules: neuronal receptors that regulate axon growth on extracellular matrices and cell surfaces.</a> Dev Neurosci. 11, 332-347 (1989).</li>
<li>Chiu, A. Y., Monteros,, Espinosa de los, A., Cole, R. A., Loera, S., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+and+s-laminin+are+produced+and+released+by+astrocytes%2C+Schwann+cells%2C+and+schwannomas+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Laminin and s-laminin are produced and released by astrocytes, Schwann cells, and schwannomas in culture.</a> Glia. 4, 11-24 (1991).</li>
<li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+of+CNS+axons+by+Schwann+cells+transplanted+from+the+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Remyelination of CNS axons by Schwann cells transplanted from the sciatic nerve.</a> Nature. 266, 68-69 (1977).</li>
<li>Andrews, M. R., Stelzner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+olfactory+ensheathing+and+schwann+cells+after+implantation+into+a+dorsal+injury+of+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Evaluation of olfactory ensheathing and schwann cells after implantation into a dorsal injury of adult rat spinal cord.</a> J Neurotrauma. 24, 1773-1792 (2007).</li>
<li>Iwashita, Y., Fawcett, J. W., Crang, A. J., Franklin, R. J., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+transplanted+into+normal+and+X-irradiated+adult+white+matter+do+not+migrate+extensively+and+show+poor+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Schwann cells transplanted into normal and X-irradiated adult white matter do not migrate extensively and show poor long-term survival.</a> Exp Neurol. 164, 292-302 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li>
<li>Lakatos, A., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+ensheathing+cells+induce+less+host+astrocyte+response+and+chondroitin+sulphate+proteoglycan+expression+than+Schwann+cells+following+transplantation+into+adult+CNS+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olfactory ensheathing cells induce less host astrocyte response and chondroitin sulphate proteoglycan expression than Schwann cells following transplantation into adult CNS white matter.</a> Exp Neurol. 184, 237-246 (2003).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Schwann+cell+interactions+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Schwann cell interactions in culture.</a> Glia. 11, 367-377 (1994).</li>
<li>Ghirnikar, R. S., Eng, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycan+staining+in+astrocyte-Schwann+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycan staining in astrocyte-Schwann cell co-cultures.</a> Glia. 14, 145-152 (1995).</li>
<li>Plant, G. W., Bates, M. L., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+proteoglycan+immunoreactivity+is+higher+at+the+caudal+than+the+rostral+Schwann+cell+graft-transected+spinal+cord+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface.</a> Mol Cell Neurosci. 17, 471-487 (2001).</li>
<li>Fishman, P. S., Nilaver, G., Kelly, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrogliosis+limits+the+integration+of+peripheral+nerve+grafts+into+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrogliosis limits the integration of peripheral nerve grafts into the spinal cord.</a> Brain Res. 277, 175-180 (1983).</li>
<li>Fok-Seang, J., Mathews, G. A., ffrench-Constant, C., Trotter, J., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+oligodendrocyte+precursors+on+astrocytes+and+meningeal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Migration of oligodendrocyte precursors on astrocytes and meningeal cells.</a> Dev Biol. 171, 1-15 (1995).</li>
<li>Wilby, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Cadherin+inhibits+Schwann+cell+migration+on+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes.</a> Mol Cell Neurosci. 14, 66-84 (1999).</li>
<li>Grimpe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+proteoglycans+in+Schwann+cell%2Fastrocyte+interactions+and+in+regeneration+failure+at+PNS%2FCNS+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of proteoglycans in Schwann cell/astrocyte interactions and in regeneration failure at PNS/CNS interfaces.</a> Mol Cell Neurosci. 28, 18-29 (2005).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., White, L., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+migration+is+integrin-dependent+and+inhibited+by+astrocyte-produced%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced.</a> Glia. , (2010).</li>
<li>Santos-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF%2Fheparin+differentially+regulates+Schwann+cell+and+olfactory+ensheathing+cell+interactions+with+astrocytes%3A+a+role+in+astrocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis.</a> J Neurosci. 27, 7154-7167 (2007).</li>
<li>Afshari, F. T., Kwok, J. C., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-produced+ephrins+inhibit+schwann+cell+migration+via+VAV2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-produced ephrins inhibit schwann cell migration via VAV2 signaling.</a> J Neurosci. 30, 4246-4255 (2007).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

استخدمت المقايسات المبينة أعلاه في الدراسات المختلفة مما يدل على دور عوامل متعددة تشارك في تشكيل الحدود بين شفان النجمية ومحدودية الهجرة خلية شوان في بيئة نجمي. فهم الآليات الكامنة وراء هذه الأحداث هو ضروري لأنه يسمح بوضع استراتيجيات لتحسين وتعزيز التكامل بين الطعوم زرع خلايا شوان التالية ، وبذلك تسهل الخروج من المحاور تجديد من الخلف الكسب غير المشروع في النسيج المضيف السماح بتشكيل اتصالات مع الأنسجة المضيف.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>PSF</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344273</td><td></td></tr><tr><td>غطاءات شرائح</td><td>VWR international</td><td>631-0149</td><td></td></tr><tr><td>غطاءات شرائح (مستطيلة)</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td></td></tr><tr><td>شرائح حجيرات</td><td>Nalge Nunc international</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>أطباق 4 عيون، أطباق 6 عيون</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>أطباق 4 عيون، أطباق 6 عيون</td></tr><tr><td>جسم مضاد p75 للجرذان</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB365</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>أجسام مضادة ثانوية (مقترنة بـ Alexa)</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004 A-11034</td><td>جسم مضاد للماوس من الماعز 568، جسم مضاد للأرنب من الماعز 488</td></tr><tr><td>أجسام مضادة ثانوية مبيوتينية</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td>جسم مضاد للماوس من الماعز</td></tr><tr><td>أقراص DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4418</td><td></td></tr><tr><td>طقم ABC elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ملاقط دقيقة</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>بارافورمالدهيد</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6168</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosave</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

خلايا شوان هي واحدة من الخلايا تستخدم عادة في استراتيجيات إصلاح التالية اصابات النخاع الشوكي. خلايا شوان هي قادرة على دعم التجديد ومحواري تنتشر عن طريق إفراز عوامل النمو وتوفير النمو 1،2 تعزيز التصاق الجزيئات والجزيئات 3 4 المصفوفة خارج الخلية. بالإضافة إلى أنها myelinate المحاوير عديمة الميلين في موقع الإصابة 5. لكن بعد الزرع ، وخلايا شوان لا تهاجر من موقع والزرع لا تتداخل مع المضيف 6،7 النجمية. هذه النتائج في تشكيل حدود حادة بين خلايا شوان والخلايا النجمية ، وخلق عقبة أمام تزايد المحاوير تحاول الخروج من الكسب غير المشروع مرة أخرى في النسيج المضيف قريب وبشكل أقصى. النجمية على اتصال مع خلايا شوان يخضع أيضا تضخم وتصل تنظيم الجزيئات المثبطة 8-13. في فحوصات المختبر استخدمت لنموذج التفاعلات خلية نجمية شوان وكانت مهمة في فهم الآلية الكامنة وراء السلوك الخلوية. هذه المقايسات في المختبر وتشمل فحص الحدود ، حيث يتم إجراء التعاون ثقافة باستخدام اثنين من خلايا مختلفة مع كل نوع من الخلايا الأراضي المحتلة مختلفة مع فجوة صغيرة فقط تفصل بين الجبهات الخلية اثنين. كما انقسام الخلايا ، وترحيل ، والجبهتين الخلوية الاقتراب من بعضها البعض ، وتصطدم في نهاية المطاف. هذا يسمح للسلوك المجموعتين السكانيتين الخلوية ليتم تحليلها على الحدود. اختلاف آخر من نفس الأسلوب هو مزيج المجموعتين السكانيتين الخلوية في الثقافة وبمرور الوقت أنواع الخلايا two عزل خلايا شوان مع تجمعت معا كما في الجزر بين النجمية خلق معا متعددة شفان نجمية الحدود. في مقايسة الثانية المستعملة في دراسة التفاعل بين أنواع الخلايا اثنين هو مقايسة الهجرة حيث يمكن تتبع حركة الخلوية على السطح من نوع من الخلايا الأخرى المونولاير 14،15. ومن المعروف عموما هذا الاختبار كما مقايسة ساترة مقلوب. يتم استزراع خلايا شوان على شظايا زجاجية صغيرة والمقلوب التي يواجهونها باستمرار على سطح monolayers نجمية ويتم تقييم الهجرة من على حافة ساترة. وقد تم كل من المقايسات مفيدة في دراسة الآليات الكامنة وراء المشاركة في استبعاد الخلوية وتشكيل الحدود. حددت بعض الجزيئات باستخدام هذه التقنيات تشمل Cadherins N - 15 ، شوندرويتين البروتيوغليكان كبريتات (CSPGs) 16،17 ، جمعية جيل المستقبل / الهيبارين 18 ، أفسس / Ephrins 19. وتعتزم هذه المقالة لوصف مقايسة الحدود والهجرة في مقايسة أزياء متدرج وإلقاء الضوء على المشاكل التقنية الممكنة التي قد تحدث.

وتعتزم هذه المقالة لوصف بطريقة متدرجة واستخداما<em&gt; في المختبر</em&gt; المقايسات المستخدمة في دراسة الخلية شوان asrtocyte التفاعلات.

تعد خلايا شوان من الخلايا الشائعة الاستخدام في استراتيجيات الإصلاح التي تلي إصابات النخاع الشوكي. وتمتلك خلايا شوان القدرة على دعم المحاور العصبية...

خلايا شوان هي خلايا دبقية في الجهاز العصبي المحيطي استُخدمت في إصلاح إصابات النخاع الشوكي. فهي تعمل بشكل أساسي على توفير عوامل النمو التي تدعم تجدد المحاور العصبية، وتوفر جزيئات المصفوفة خارج الخلوية والالتصاق المعزز للنمو. بالإضافة إلى ذلك، تقوم هذه الخلايا بتكوين الغمد الميالينا حول المحاور العصبية في موقع الإصابة.لسوء الحظ، لا تهاجر خلايا swan المزروعة من موقع الغرسات ولا تختلط مع الخلايا النجمية المضيفة. يؤدي هذا إلى تكوين حد فاصل حاد ويمنع المحاور العصبية النامية من الاندماج مع أنسجة المضيف. في هذا الفيديو، يتم استخدام طريقتين لدراسة التفاعلات بين خلايا swan والخلايا النجمية في المختبر.أولاً، يتم استعراض مقايسة الحدود التي يتم فيها إنشاء مناطق للخلايا البجعية (swan cells) والخلايا النجمية (astrocytes) على شريحة زجاجية واستزراعها. بعد ذلك، تُضاف كواشف مختلفة إلى الشريحة وتُترك لفترة استزراع إضافية. ثم يتم تصوير الشرائح وتحليلها لتحديد تأثير الكواشف على هجرة الخلايا البجعية إلى منطقة الخلايا النجمية أو العكس.بعد ذلك، يتم توضيح مقايسة الهجرة التي يتم فيها قلب شظايا شرائح التغطية المغطاة بمجموعات من خلايا شوان فوق طبقات أحادية من الخلايا النجمية. ومرة أخرى، تُضاف كواشف مختلفة إلى الوسط الزراعي، ويلي ذلك تصوير المزرعة لتقييم مدى ومسافة هجرة خلايا شوان على الطبقات الأحادية للخلايا النجمية. في نهاية المطاف، من شأن هذا النوع من المقايسات أن يسهل تطوير استراتيجيات لتحسين وتعزيز دمج طعوم خلايا شوان بعد عملية الزرع.تتمثل ميزة هذه المقاييس المختبرية مقارنةً بالطرق الحالية التي يتم فيها تقييم الهجرة على ركائز نقية في أنها أكثر صلة بالمقاييس الحيوية التي تتلامس فيها الخلايا المزروعة مع الخلايا النجمية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه المقاييس المختبرية في مجالات أخرى مثل بيولوجيا الخلية للإجابة على أسئلة جوهرية مثل غزو الخلايا الورمية وهجرتها. قبل البدء في المقياس، يجب توفير العناصر التالية: شرائح غرف مطلية بـ poly D lysine، وشرائح زجاجية معقمة، ووسط زراعة الخلايا، وزجاجة من الكالسيوم.ابدأ باستخدام محلول هانكس المتوازن الخالي من المغنيسيوم لمعالجة خلايا شوان الأولية بإنزيم التريبسين لمدة ثلاث دقائق، وخلايا astrocytes الأولية للجرذ لمدة خمس دقائق. وبمجرد انفصال الخلايا، قم بإيقاف نشاط التريبسين بإضافة وسط استزراع الخلايا. بعد ذلك، انقل خلايا شوان وخلايا astrocytes إلى أنابيب فالكون منفصلة سعة 15 ملليلتر، ثم قم بطردها مركزياً عند 300 ×g لمدة خمس دقائق.وفي هذه الأثناء، باستخدام قاطع زجاج، يتم قص شرائح التغطية الزجاجية المستطيلة طولياً بحيث تتناسب مع عرض شرائح الحجرة المستخدمة في مقاييس الحدود، ولتسهيل عملية مسح قطرة معلق الخلايا. بعد عملية إعادة التعليق بالدوران (spin Resus)، يتم تعليق خلايا شوان والخلايا النجمية بكثافة 2 × 10⁶ خلية/مل. وعند أحد طرفي شريحة حجرة مطلية بالبولي لايسين، ضع قطرة واحدة بحجم 50 µL من معلق خلايا شوان.استخدم شريحة زجاجية لمسح القطرة باتجاه مركز الغرفة لإنشاء حافة مستقيمة. بعد ذلك، ضع قطرة ثانية بحجم 50 microliter من معلق الخلايا النجمية في الطرف المقابل من نفس البئر وامسحها باتجاه المركز. ولإنشاء حافة مستقيمة موازية للأولى، يجب أن تكون هناك فجوة بمقدار 0.2 millimeter بينهما.ضع شريحة الحجرة التي تحتوي على القطرات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد مرور ساعتين، اغسل المزارع باستخدام DMEM لإزالة أي حطام خلوي غير ملتصق.لتحفيز تكاثر خلايا شوان، أضف الوسط الغذائي إلى شرائح الغرفة. يتم تدعيم هذا الوسط بـ فورالين ومستخلص الغدة النخامية البقرية. يعمل الفورالين على رفع مستويات cyclic A MP داخل خلايا شوان لتحفيز التكاثر، بينما يوفر BPE عوامل النمو الضرورية للزراعة طويلة الأمد.قم بتحضين الشريحة لمدة تتراوح بين 8 إلى 10 أيام. ستلتقي جبهتا الخلايا في النهاية وسيتشكل حد فاصل واضح بين نوعي الخلايا. وفي هذه المرحلة، يمكن إجراء التجارب.لتحليل العوامل المشاركة في تكوين الحدود من أجل فحص هذه الحدود، يتم تثبيت المزارع المشتركة باستخدام 4% formaldehyde. وللتمييز بين خلايا شوان والخلايا النجمية، يتم إجراء صبغ مناعي باستخدام جسم مضاد لـ P 75 وجسم مضاد لـ GFAP على التوالي. يتعرف الجسم المضاد P 75 على مستقبل NGF منخفض الألفة الموجود في خلايا شوان، وهو ما تفتقر إليه الخلايا النجمية، بينما يتعرف الجسم المضاد GFAP على البروتين الحمضي الليفي الدبقي، الذي يتمركز في الخلايا النجمية لإجراء اختبار الهجرة.ابدأ عملية الزرع. أضف 1×10⁵ من الخلايا النجمية (astrocytes) في 1 ملليلتر من الوسط في كل بئر من أطباق ذات أربعة آبار بقطر 15 مليمتر. ضع الطبق في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة حتى تصبح الطبقة أحادية الخلايا متلاحمة تماماً.في هذه الأثناء، ولتحضير خلايا swan لتقييم الهجرة على طبقات أحادية من الخلايا النجمية، ضع شرائح زجاجية دائرية مغطاة بالبولي ليسين في أنبوب سعة 50 milliliter واستخدم ماصة بلاستيكية لسحقها، مما يؤدي إلى تكوين شظايا زجاجية صغيرة. انقل الشظايا الزجاجية إلى بئر واحد من طبق يحتوي على ستة آبار باستخدام الملقط. اختر شظايا يبلغ عرضها خمسة millimeters تقريبًا وانقل خمس شظايا منها إلى كل بئر من الآبار الأخرى.قم بمعالجة خلايا شوان بإنزيم Trypsin لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 milliliter وافصلها بجهاز الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة خمس دقائق. أعد تعليق خلايا شوان بتركيز 2 × 10⁶ cells/milliliter في وسط استزراع.ثم أضف 20 µL من معلق خلايا شوان فوق كل قطعة، وتحضن عند 37 °C و 7% CO2 لمدة ساعتين. وبعد مرور ساعتين، أخرج خلايا شوان من المحضنة. أضف كمية كافية من وسط الزراعة المدعم بـ 2 µM من 4-scale in و 10 µg/mL من BPE إلى كل بئر.وبالتالي، يتم تغطية الشظايا ذات الخلايا الملتصقة بالكامل بالوسط الغذائي وتحضن لمدة 24 إلى 48 ساعة حتى تكتسي الشظايا الزجاجية بالكامل بخلايا swan. وبمجرد أن تكتسي الشظايا بخلايا swan، يتم استخراج كل من خلايا swan والخلايا النجمية من الحاضنة. استخدم الملقط لالتقاط كل شظية ملتصق بها خلايا swan بعناية.اغمس القطعة في محلول HBSS لإزالة الخلايا غير الملتصقة، ثم اقلبها بحيث يكون الوجه لأسفل فوق الطبقة أحادية الخلايا النجمية. وبمجرد نقل جميع القطع، أضف 1 mL من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر.إذا كان سيتم تقييم تأثيرات الكواشف التجريبية مثل عوامل النمو، فيجب إضافتها إلى الوسط. تُعاد الطبقة إلى الحاضنة وتُترك خلايا شوان لتهاجر لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة بعد فترة الهجرة. يتم تثبيت شظايا الزجاج في قاع كل بئر عن طريق إضافة 4%para formaldehyde لمدة 30 دقيقة بعد التثبيت.قم بإجراء صبغ مناعي لخلايا شوان لـ P 75، ثم قم بصبغها باستخدام طقم A BC Strept ADIN المورد من DIAM benadine للسماح برؤية خلايا شوان تحت المجهر الضوئي بعد 10 أيام. يُظهر الاستزراع المشترك لخلايا شوان والمجرات النجمية حدوداً فاصلة واضحة بين نوعي الخلايا. هنا، يتم تحديد خلايا شوان بواسطة P 75.يظهر صبغ مستقبل NGF منخفض الألفة باللون الأحمر، بينما يتم تحديد الخلايا النجمية بواسطة صبغ GFAP الموضح باللون الأخضر. ويكون الحد الفاصل بين هذه الخلايا أكثر وضوحاً عند استخدام forskolin و BPE في المزرعة لأن تكاثر خلايا شوان يزداد. في المقابل، في هذا الاختبار للمزرعة المشتركة لمدة 10 أيام، لم تنفصل الخلايا بشكل جيد إلى مناطق مختلفة.كان هذا بسبب ضعف التقنية وخلط نوعي الخلايا. وبينما يتم إعداد اختبار الحدود، تقيم اختبارات الهجرة حركة نوع واحد من الخلايا فوق سطح نوع آخر من الخلايا، وبالتالي فهي تقيم ظاهرة مختلفة عن ظاهرة تكوين الحدود. وتظهر هذه الصورة خلايا swan وهي تهاجر بعيداً عن حافة الشريحة الغطائية، ويشير السهم إلى اتجاه هجرة الخلايا.عند إجراء هذه المقايسات في المختبر (in vitro)، من المهم تذكر أن تأثير الكواشف قد يكون على الخلايا النجمية أو خلايا شوان، وبالتالي يتطلب الأمر إجراء تجارب لاحقة لتحديد نوع الخلية المسؤول بدقة عن زيادة أو نقصان الهجرة الملحوظة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ تقنيات أخرى مثل الكيمياء المناعية، ولا سيما في مقايسة الحدود، لإظهار الجزيئات التي يزداد تنظيمها أو ينخفض تنظيمها عند الحدود الفاصلة بين خلايا شوان والخلايا النجمية.

analysis-of-schwann-astrocyte-interactions-using-in-vitro-assays

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

توضح هذه المقالة بروتوكول الرواية وكاشف مجموعة مصممة لقياس التأثيرات السمية العصبية الحساسة للمركبات والعلاجات على الثقافات المشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية باستخدام عالية تحليل المحتوى. تظهر النتائج ان ارتفاع تحليل المضمون يمثل تكنولوجيا جديدة مثيرة لتقييم العصبية.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

هذه الدراسة توضح إجراءات إنشاء محور عصبي رواية العصبية و(الفلكية) الدبقية منصة شارك في الثقافة. في هذا النظام المشترك والثقافة، والتلاعب التفاعل المباشر بين محور عصبي واحد (واحد الخلية الدبقية) يصبح ممكنا، مما يسمح للتحليل الآلي للعصبون إشارات متبادلة لالدبقية.

تحليل التصوير من الخلايا العصبية إلى الخلايا الدبقية في التفاعل منهاج الثقافة ميكروفلويديك (MCP) على أساس الخلايا العصبية والخلايا الدبقية اكسون نظام المشاركة في الثقافة

نحن هنا وصف خلية شوان (SC) مقايسة الهجرة التي الطوائف المنبوذة هي قادرة على تطوير محاور عصبية على طول تمديد.

تحليل الفئران خلايا شوان التنمية جنبا إلى جنب المحوار النامي

يمكن استخدام الخلايا النجمية من النوع البري الظاهري والخلايا الجذعية العصبية التي تم حصادها من الفئران المصممة باستخدام أليلات مسرطنة مشروطة ومحولة عن طريق إعادة التركيب الفيروسي بوساطة Cre لنمذجة التسبب في الورم النجمي في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق الحقن التقويمي للخلايا المحولة في أدمغة زملاء القمامة المتخصصين في المناعة.

النمذجة الخلايا النجمية إمراض في المختبر و في فيفو استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

يصف هذا البروتوكول غير مباشر coculture الخلايا العصبية نجمية لتحليل مجزأة التفاعلات العصبية، الدبقية.

وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em&gt; في المختبر</em&gt; مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

الحفاظ على تغطية حاجز الدم في الدماغ هو المفتاح لتوازن الجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول في تقنيات المختبر لترسيم العمليات الأساسية والمرضية التي تعدل تغطية حاجز الدم في الدماغ.

في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه

بروتوكول أوسام الموصوفة هنا الأمثل لاستزراع astrocytes مورين بمعزل عن غيرها من خلايا المخ بطريقة سريعة وبسيطة وغير مكلفة. أستروسيتيس أوسام معرض عفوية Ca2 + إشارات ومورفولوجيا والجينات التعبير ملامح مشابهة ل astrocytes في فيفو.

استزراع في فيفو--مثل مورين Astrocytes استخدام بروتوكول أوسام سريعة وبسيطة وغير مكلفة

نقدم هنا، بروتوكولات للتحقيق في الأضرار بوحدة neurovascular خلال النخاع الذاتية التجريبية المجراة. ونحن على وجه التحديد معالجة كيفية تحديد نفاذية حاجز الدم في الدماغ والنشاط جيلاتيناسي المعنية بالهجرة الكريات البيض عبر ليميتانس إطلاق.

تصور ضعف الحواجز بطانية والدبقيه نيوروفاسكولار وحدة خلال النخاع الذاتية التجريبية في فيفو

هنا نقوم بوصف طريقة التصوير الحي في المختبر لتصور النقل داخل الخلايا من العضيات والاتجار ببروتينات غشاء البلازما في الخلايا النجمية المورين. ويقدم هذا البروتوكول أيضا منهجية لتحليل الصور لتحديد مسارات نقل البضائع وحركيتها.

تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية

يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.

إنشاء مزارع مختلطة للخلايا العصبية والدبقية من أدمغة الفئران الجنينية لدراسة العدوى والمناعة الفطرية

هنا ، نقدم منهجية مفصلة لعزل شبكية العين عن عين الفأر لإجراء تجارب ممتدة خارج الجسم الحي . يؤكد هذا البروتوكول على جعل هذا النهج المتطلب تقنيا متاحا للباحثين الذين يرغبون في الاستفادة من سبل البحث التي يوفرها الحفاظ على الخلايا الدبقية في الشبكية في الموقع في الأنسجة الحية.

نموذج Ex Vivo Explant لدراسة التفاعلات الدبقية في شبكية العين الفأر

اكتشف طرق الفحص المختبري لدراسة تفاعلات خلايا شفان مع الخلايا النجمية في إصلاح إصابات الحبل الشوكي. تساعد هذه التقنيات الباحثين على فهم ديناميكيات الهجرة والتكامل الخلوي.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

استكشف المزيد من الفيديوهات