تصور الوسطيات المتماثل للأشعة فوق البنفسجية يتسبب في E. القولونية ثنائي الأبعاد باستخدام Agarose جل التحليل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الوسيطات الهيكلية للحمض النووي التي تحدث عندما يواجه النسخ المتماثل آفات الحمض النووي باستخدام تحليل هلام ثنائي الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الحمض النووي أولا عن الخلايا المنقسمة بنشاط والتي تم فيها إحداث آفات منع النسخ المتماثل. ثم يتم استخدام الرحلان الكهربائي للهلام لفصل الحمض النووي المستعاد بناء على الحجم.

بعد ذلك ، يتم قطع الممرات وإعادة صياغتها أفقيا في هلام ثان يفصل الحمض النووي بناء على الحجم والشكل. أخيرا ، يتم استخدام التحليل الجنوبي لتصور هياكل الحمض النووي المرتبطة بتكرار شظايا الحمض النووي في بعض الأحيان قبل وبعد إدخال الضرر الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية. في النهاية ، يمكن استخدام هذا الإجراء لإظهار أن عدم القدرة على معالجة آفات الحمض النووي في بعض الطفرات يؤدي إلى تراكم وسيطات إصلاح الحمض النووي.

مرحبا ، اسمي آرثر إيان. أنا من مختبر كوريلا في جامعة ولاية بورتلاند. مرحبا ، اسمي براند هي ، أنا أيضا من مختبر كوريلا.

سنعرض لك اليوم إجراء الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تكرار الحمض النووي وإصلاح المواد الوسيطة. لذلك دعونا نبدأ.

لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة 200 ميكرولتر بين عشية وضحاها من الإشريكية القولونية التي تحتوي على البلازميد PBR 3 22 في وسط الفخذ DGC مع أمبيسلين عند 37 درجة مئوية. يقلل استخدام وسط الفخذ DGC من التدريع من الأشعة فوق البنفسجية. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بتحبيب الخلايا عند 14 ، 000 RRP M لمدة 30 ثانية.

ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من DG C الوسط الذي يفتقر إلى الأمبيسلين وتلقيحه. 20 مل من متوسط الفخذ DG C تنمو المزارع بدون اختيار الأمبيسلين. في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية إلى OD 600 من 0.5 ، وهو ما يتوافق مع حوالي خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الثامنة لكل مليلتر نمو بدون أمبيسلين يتجنب الانتقاء ضد وسيطات النسخ المتماثل غير الطبيعية أو غير المنتجة التي قد تنشأ في بعض الطفرات.

بالإضافة إلى ذلك ، في حالة استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية لإحداث الضرر ، فإن إزالة الأمبيسلين من الوسائط أمر ضروري لأنه يمتص بقوة عند هذه الأطوال الموجية والدروع. تقلل الخلايا من الجرعة الفعالة من الأشعة فوق البنفسجية أثناء نمو الخلايا. استخدم مقياس ضوئي UVC لتحديد المسافة من مصباح مبيد للجراثيم بقوة 15 وات ينتج معدل تعرض يبلغ حوالي واحد جول لكل متر مربع في الثانية.

يجب تنفيذ الخطوات اللاحقة تحت الضوء الأصفر لأن هذا سيمنع انعكاس إعادة تنشيط الصورة لثنائيات بيرين سيكلو بوتان عن طريق الاتصال بالصور بعد الأشعة فوق البنفسجية. بمجرد الوصول إلى كثافة الخلايا المطلوبة ، استخدم ماصة لنقل المزرعة إلى طبق بتري قطره 15 سم على منصة دوارة لضمان تشعيع متساو لمجموعة الخلايا بأكملها. بعد ذلك ، قم بتشعيع الثقافات ب 50 جول لكل متر مربع وانقلها على الفور إلى قارورة معقمة للتدفئة ووضعها مرة أخرى في الحاضنة المهتزة 37 درجة مئوية.

طوال مدة التجربة ، تنتج هذه الجرعة في المتوسط ديمر واحد من سيكلو بوتان بيرين ، كل 4.5 كيلوقواعد من الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل لكل نقطة زمنية يتم فحصها. ماصة 0.75 ملليلتر من الثقافة داخل 0.75 ملليلتر من شبكة الجليد الباردة 30. تعمل شبكة المخزن المؤقت 30 كمخزن مؤقت للتوقف يمنع النسخ المتماثل وإصلاح استئصال النيوكليوتيدات من المتابعة.

بمجرد إضافة المخزن المؤقت للتوقف ، يمكن الاحتفاظ بالعينة على الجليد حتى نهاية الدورة الزمنية. بعد الدورة الزمنية ، قم بتقطيع كل عينة وإعادة تعليق الكريات. في 150 ميكرولترا من محلول التحلل ، قم بتحلل الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة دون تحريض.

نظرا لأن الهياكل المتماثلة ذات مناطق الخصلة المفردة أو النقاط الفرعية تكون أكثر عرضة للقص ، فقم بقطع أطراف الماصة بشفرة حلاقة لجعل الفم أوسع وتقليل قوى القص. بشكل عام ، يجب الحفاظ على سحب العينات والتحريض إلى الحد الأدنى حتى بعد هضم الحمض النووي بإنزيمات التقييد ، بعد التحلل ، أضف البروتيناز K وخلية الساركاس والسماح للحضانة بالاستمرار لمدة ساعة واحدة. هذا يعمل على إطلاق شظايا الحمض النووي المرتبطة بالبروتين.

نظرا لأن تكرار الحمض النووي النشط غالبا ما يرتبط بمجمعات البروتين أو الأغشية ، فإن هذا يساعد على زيادة إنتاجية شظايا النسخ المتماثل. بعد ساعة واحدة ، استخرج العينات عن طريق إضافة مجلدين من الفينول إلى كل عينة وقلب الأنابيب برفق لمدة خمس دقائق. ثم أضف مجلدين من الكلوروفورم ، الأيزواميل ، الكحول ، واقلب الأنابيب برفق لمدة خمس دقائق إضافية.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 14 ، 000 دورة في الدقيقة في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق ونقل المرحلة المائية العلوية لكل عينة إلى أنبوب جديد. ثم أضف أربعة أحجام من كحول الكلوروفورم ISO ، ومرة أخرى ، اقلب الأنابيب برفق لمدة خمس دقائق. الطرد المركزي للعينات مرة أخرى عند 14 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

ضع غشاء غسيل الكلى فوق 250 مل من 0.1 xte في دورق ووضع 100 ميكرولتر من كل عينة على الغشاء. دع العينات تغسل الكلى لمدة ساعة واحدة بعد غسيل الكلى. ضع 80 ميكرولترا من كل عينة في أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 20 ميكرولترا من مزيج الإنزيم.

هضم العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية. يعمل ال PV Two على خطية البلازميد في اتجاه مجرى النهر مباشرة من أصل النسخ المتماثل. قبل تحميل هلام agros ، أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم و 20 ميكرولترا من صبغة التحميل ستة × تحتوي على البرومو.

سيؤدي الفينول الأزرق والزيلين السماوي إلى كل عينة وخلط الكلوروفورم إلى تجريد أي PV متبقي مرتبطين بنهايات الحمض النووي. ابدأ تحليل هلام aros ثنائي الأبعاد عن طريق تشغيل عينات الحمض النووي المقيدة من خلال البعد الأول. قم أولا بتحميل علامة Lambda الخلفية بثلاثة أحجام في الممر الأول من جل agros 0.4٪ المعد مسبقا في XTBE واحد.

ثم قم بتحميل 40 ميكرولترا من المرحلة المائية التي تحتوي على صبغة التحميل لكل عينة ، وتخطي الممرات لتسهيل تقطيع الجل. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتشغيل البعد الأول بجهد فولت واحد لكل سنتيمتر لمدة 12 إلى 15 ساعة تقريبا. يعمل هلام AGROS ذو الجهد المنخفض والنسبة المنخفضة على فصل شظايا الحمض النووي بناء على الحجم.

بعد تشغيل البعد الأول ، استخدم سكين جزار كبير لقطع الممر الأول الذي يحتوي على علامة Lambda الخلفية الثلاثة وصمة عار ببروميد الأثيريوم. بالنسبة للبعد الثاني ، قم بتقطيع ممرات الجل باستخدام سكين الجزار الكبير باستخدام علامة Lambda Hind الثلاثة كمحصول إرشادي وتخلص من المنطقة أدناه حيث من المتوقع أن يعمل البلازميد الخطي في كل حارة. لإلقاء البعد الثاني ، ضع كل شريحة أفقيا عبر الجزء العلوي من عجلة جل فارغة.

تحضير محلول 1٪ AROS في XTBE واحد وتبرد إلى 55 درجة مئوية. بمجرد أن يبرد ، اسكب محلول الجل لصب البعد الثاني ، مع التأكد من تغطية شرائح الجل بالكامل. من المهم التأكد من توجيه الشرائح بشكل متساو ومستوى الخروع قبل صب الجل.

بمجرد أن يتماسك الجل ، قم بتشغيل البعد الثاني ، خمس ساعات ونصف إلى سبع ساعات عند 6.5 فولد لكل سنتيمتر في وحدة الرحلان الكهربائي التي تسمح للمخزن المؤقت بإعادة تدوير الجهد العالي ونسبة عالية من هلام Agros يفصل بشكل فعال شظايا الحمض النووي بناء على شكلها وحجمها. تعمل الأشكال غير الخطية بشكل أبطأ من خلال البعد الثاني بعد الرحلان الكهربائي. اشطف الجل بالماء مرة واحدة ثم اغسله مرتين في 400 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.25 مولار لمدة 15 دقيقة مع تحريض لطيف.

تعمل الغسيل الحمضي على تقطيع جزيئات الحمض النووي جزئيا إلى أجزاء أصغر تنتقل بكفاءة أكبر أثناء التحليل الجنوبي وهي ضرورية بسبب الحجم الكبير والشكل غير العادي لوسيطات تكرار الحمض النووي. لتحضير الجل لنقل القلويات ، اشطف الجل مرة أخرى بالماء ، ثم اغسله مرتين في 400 مل من 0.4 مولار هيدروكسيد الصوديوم لمدة 30 دقيقة. ثم يتم نقل الحمض النووي الموجود في المواد الهلامية إلى غشاء نايلون عالي الرابطة n بالإضافة إلى غشاء نايلون باستخدام نظام نقل قلوي هابط مع هيدروكسيد الصوديوم 0.4 مولار كما هو موضح في الجزء المكتوب من هذا الإجراء ، دع نقل الحمض النووي لمدة ست إلى 12 ساعة بعد نقل الحمض النووي يستمر مع تهجين المسبار كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بمجرد فحص الغشاء وغسله ، ضع الغشاء على منشفة ورقية حتى يختفي السائل بشكل واضح. ثم لف الغشاء في غلاف بلاستيكي من البولي فينيل كلوريد وعرضه لشاشة تصوير الفوسفو. أخيرا ، يمكن تصور النشاط الإشعاعي وقياسه كميا باستخدام عاصفة ثمانية 40 وكمية الصورة المرتبطة بها.

رسم نمط الهجرة من PV اثنين من PBR المهضوم 3 22 البلازميد الذي لوحظ بواسطة تحليل هلام 2D aros. تعمل البلازميدات الخطية غير المتماثلة كجزء خطي 4.4 كيلوبايت يتكرر شكل البلازميد على شكل بلازميد يهاجر بشكل أبطأ من الأجزاء غير المتماثلة نظرا لحجمها الأكبر وشكلها غير الخطي. يشكل نمط الهجرة هذا قوسا يمتد من المنطقة الخطية باتجاه البئر بعد الأشعة فوق البنفسجية.

لوحظت جزيئات مزدوجة على شكل Y أو X في المنطقة المخروطية وتهاجر بشكل أبطأ من قوس الجزيئات على شكل Y. يظهر مثال على التحليل الجنوبي للهلام ثنائي الأبعاد الذي تم فحصه باستخدام P 32 المسمى PBR 3 22 للخلايا مباشرة بعد الأشعة فوق البنفسجية و 15 دقيقة بعد الأشعة فوق البنفسجية مباشرة بعد الأشعة فوق البنفسجية. يمكن العثور على ما يقرب من 1٪ من إجمالي الحمض النووي للبلازما في القوس Y عندما تنمو الخلايا بسرعة في المرحلة الأسية بعد الإشعاع.

لوحظت زيادة عابرة في الجزيئات على شكل YS حيث تتراكم شوكات النسخ المتماثل المسدودة في المواقع التالفة. كما أن وسيطات النسخ المتماثل على شكل حرف L تتراكم بشكل عابر وتستمر حتى وقت يرتبط بوقت إصلاح الآفات. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تصور المواد الوسيطة لإصلاح الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تكون على دراية بقوى القص التي يمكن أن تقلل من المحصول وأن تكون لطيفا مع جميع العينات والمواد الهلامية. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.