التغذية الخالية من التكيف والثقافة والركض للخلايا البشرية باستخدام IPS الطاعم كاملة خالية من خروج المغلوب استبدال المصل متوسطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تكييف الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات والحفاظ عليها في استزراع خالٍ من الخلايا المغذية باستخدام وسط استزراع خالٍ من الخلايا المغذية يحتوي على بديل مصل الإيقاف الكامل. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير أطباق مغطاة بـ gelt أو TRX أو cell start. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في نقل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (IPS) من الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) إلى وسط خالٍ من الخلايا المغذية باستخدام تقنية disc space.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في الحفاظ المستمر على خلايا IPS خالية من الخلايا المغذية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر نمواً خلوياً وخصائص جذعية مماثلة لتلك الموجودة في مستنبتات meth من خلال التلوين المناعي باستخدام علامات تعدد القدرات. مرحباً، أنا كيت واغنر من موقع GIB co في Life Technologies.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الحالية في إمكانية توفير الوقت وزيادة الاتساق في المزرعة الخلوية عند استخدام بديل المصل knockout طوال سير العمل بالكامل. وتضم مجموعة منتجات knockout اليوم قائمة كاملة من الأوساط والكواشف للظروف القائمة على الخلايا المغذية، والخالية من الخلايا المغذية، والخالية من المكونات الغريبة (xeno free) للخلايا الجذعية الجنينية البشرية، والخلايا الجذعية الجنينية للفئران، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. ويمكن استخدام KSR في عمليات الاشتقاق، والنمو، والتوسيع، والحفظ بالتجميد، والخطوات الأولية من التمايز.

سيوضح لك الفيديو التالي كيفية تهيئة وتعبئة خلاياك باستخدام KSR في ظروف خالية من الخلايا المغذية. تتطلب تهيئة وتعبئة الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات في ظروف خالية من الخلايا المغذية استخدام أطباق زراعة مطلية بـ Gel TRX؛ قبل يوم واحد من تحضير هذه الأطباق المطلية، قم بإذابة أنبوب واحد من Gel TRX ببطء عن طريق تركه في الثلاجة طوال الليل، وفي اليوم التالي، قم بتخفيف أنبوب Gel TRX المذاب بنسبة 1 إلى 100 في الوسط الأساسي عن طريق نقل 1 mL من Gel TRX إلى زجاجة تحتوي على 99 mL من الوسط الأساسي. اخلط المحلول بلطف.

نوصي باستخدام knockout D-M-E-M-F 12 كوسط أساسي، ولكن يرجى مراجعة نص البروتوكول للاطلاع على الخيارات الأخرى. قم بتغطية السطح بالكامل لكل طبق زراعة بمحلول gel Rex. أضف 1.5 milliliters من محلول gel trek لكل طبق بقطر 60 millimeter.

تُحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. ويمكن تغليف الأطباق الإضافية بورق البارافيلم وتخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع. كما يمكن تقسيم كميات إضافية من Gelt TRX المخفف وتخزينها عند -20 إلى -80 °C، ولكن يجب تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة قبل الاستخدام.

انقل أطباق الـ TRX المغلفة والمجمدة إلى غرفة نظيفة أو خزانة تدفق هوائي واتركها حتى تتوازن مع درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى ذلك، قم بتحضير جميع الكواشف الأخرى المطلوبة وتأكد من موازنة جميع الأوساط الغذائية عند 37 درجة Celsius وتزويدها بالغازات المناسبة. لتكييف خلايا IPCs البشرية مع الوسط الخالي من الخلايا المغذية، ابدأ بالزراعة الأولى.

توضع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (IPSC) على خلايا مغذية من نوع meth حتى تصل نسبة تلاقيها إلى 70 إلى 80%. يتم سحب الوسط من كل طبق زراعة مقاس 60 مليمتر وإضافة كمية مناسبة من محلول dispa، وهي 1 ملليلتر. في هذه الحالة، يتم تحضين الأطباق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق.

قم بشفط محلول dispa من كل طبق زرع، واغسل خلايا meth المغذية بلطف باستخدام DPBS من مرتين إلى ثلاث مرات. بعد ذلك، أضف كمية مناسبة من وسط استبدال المصل الكامل إلى كل طبق زرع. وباستخدام كاشطة الخلايا، قم بكشط الخلايا بلطف عن سطح الطبق.

اجمع معلق الخلايا من كل طبق في أنابيب مخروطية منفصلة سعة 15 milliliter. اشطف كل طبق زراعة بكمية مناسبة من وسط استبدال المصل الكامل وأضف وسط الشطف إلى الأنابيب المخروطية سعة 15 milliliter التي تحتوي على معلق الخلايا. قم بطرد مركزي للأنابيب المخروطية سعة 15 milliliter عند 200 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا.

بعد عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي بعناية وتخلص منه دون تحريك كتلة الخلايا. قم بنقر الأنبوب برفق لفصل كتلة الخلايا تماماً عن قاع الأنبوب. أضف كمية مناسبة من بديل المصل الكامل، والوسط الخالي من الخلايا المغذية وفقاً لنسبة التقسيم المطلوبة.

أعد تعليق الراسب برفق. لا تقم بتفتيت تكتلات الخلايا إلى حجم أصغر لأن التكتلات الصغيرة لا تلتصق جيداً بالسطح. اشفط أي محلول gel TRE متبقٍ من أطباق الزرع المغطاة بـ gel Rex والمحضرة مسبقاً، وأضف ببطء كمية مناسبة من معلق الخلايا إلى كل طبق زرع.

حرك طبق الزرع ذهاباً وإياباً ومن جانب إلى آخر عدة مرات لتوزيع الخلايا عبر سطح الطبق. ضع أطباق الزرع برفق في حضانة عند درجة حرارة 37 degree Celsius مع جو مرطب يحتوي على 4 إلى 6%CO2 في الهواء. استبدل الوسط المستنفد يومياً بعد ذلك حتى تصبح الخلايا متلاحمة بنسبة 70 إلى 80% تقريباً.

عندما تصل الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات التي تنمو في وسط خالٍ من الخلايا المغذية وبديل كامل للمصل إلى درجة تلاقي تتراوح بين 70 إلى 80%، تصبح جاهزة للاستزراع الفرعي. وفي حال وجود أي خلايا متمايزة، يجب إزالتها قبل عملية التعبئة. يتم سحب الوسط المستنفد من طبق الزرع بقطر 60 مليمتر باستخدام ماصة، ثم تُغسل الخلايا مرتين.

باستخدام DPBS، أضف بلطف 1 mL من المحلول القائم على الأقراص المسخن مسبقاً إلى طبق الزرع. حرك طبق الزرع بشكل دائري لتغطية سطح الخلايا بالكامل. حضن المزرعة عند 37 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق.

بعد ذلك، قم بشفط محلول مساحة التفكيك واغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام DPBS، ثم أضف بديل المصل الكامل، والوسط الخالي من الخلايا المغذية، وكشط الخلايا برفق عن سطح طبق الزرع. وباستخدام كاشطة الخلايا، انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 milliliter. اشطف طبق الزرع مرتين باستخدام بديل المصل الكامل.

رش الوسط الخالي من الخلايا المغذية برفق لإزالة أي خلايا لم تنفصل. اسحب الوسط من كلا عمليتي الشطف مع الخلايا في أنبوب سعة 15 milliliter. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 200 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا دون تعكير كتلة الخلايا المترسبة.

قم بسحب السائل الطافي بعناية والتخلص منه. قم بنقر الأنبوب برفق لفصل كتلة الخلايا تماماً عن قاع الأنبوب. أعد تعليق الخلايا برفق في بديل المصل الكامل.

وسط خالي من الخلايا المغذية باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 5 mL. لا تقم بالترقيق الثلاثي. انقل الخلايا إلى طبق Geltrex مطلي جديد بقطر 60 mm وفقاً لنسبة التقسيم المطلوبة.

حرك طبق الزرع للأمام والخلف ومن جانب إلى آخر عدة مرات لتوزيع الخلايا على سطحه. ضع طبق الزرع في حضانة بدرجة حرارة 37 degree Celsius مع توفير بيئة رطبة تحتوي على 4 إلى 6%carbon dioxide في الهواء حتى اليوم التالي. استبدل الوسط المستهلك برفق ببديل مصل كامل.

تغذية بوسط خالٍ من الخلايا المغذية لإزالة حطام الخلايا. استبدل الوسط المستهلك يومياً بعد ذلك. تظهر صورة تباين الطور هذه خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات منمّاة في أطباق زراعة مطلية بـ gelt TRX باستخدام بديل مصل كامل، وهو وسط خالٍ من الخلايا المغذية.

تُظهر المورفولوجيا الظاهرية لخلايا IPC تشابهًا مع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، حيث تتميز بنوى كبيرة وسيتوبلازم شحيح، كما يوضح التلوين المناعي أن خلايا IPC المستزرعة في وسط استبدال المصل knockout مع خليط عوامل النمو، قد أعربت عن مؤشرات تعدد القدرات، OCT four و SSEA four. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكييف وصيانة خلايا IPC الخاصة بك في ظروف خالية من الخلايا المغذية وباستخدام استبدال المصل knockout. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.