Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية المصل الطاعم خالية استبدال متوسطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحفاظ على خلايا IPS بالتبريد واستعادتها في ظروف الاستزراع القائمة على التغذية أو التغذية الخالية من التغذية. يتم تحقيق ذلك من خلال البدء أولا في تعبئة IPCs الخاصة بك كما تفعل عادة. الخطوة الثانية من الإجراء هي نقل الخلايا إلى وسط تجميد خال من المصل.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي الحفظ بالتبريد كما تفعل عادة. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي إذابة الخلايا والبدء في الصيانة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر تجميدا ناجحا وذوبان خلايا IPS في وسط تجميد خال من المصل من خلال التشكل الصحي والتعافي بعد الذوبان.

مرحبا ، أنا كيت فاغنر في موقع GCO في Life Technologies. يعد العرض المرئي لهذا البروتوكول أمرا بالغ الأهمية لأن IPCs يمكن أن تكون حساسة جدا للتجميد و T الدقيقة. ما يجعل هذا البروتوكول أسهل هو أنه يمكن استخدام استبدال مصل خروج المغلوب طوال سير عملك بالكامل.

تتضمن عائلة منتجات KSR اليوم قائمة كاملة من الوسائط والكواشف للتغذية القائمة على العلف الخالي من الزينة والزراعة الخالية من الزينة للخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. يمكن استخدام KSR لنمو الاشتقاق ، والحفظ بالتبريد ، والتوسع ، والخطوات الأولية الأولى للتمايز. سيظهر لك الفيديو التالي ذوبان الجليد والتجميد باستخدام KSR في آلة بيتر الحرة.

لبدء هذا الإجراء. أولا دافئة بكمية مناسبة من وحدة التغذية الكاملة الخالية من الوسط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي ، يستنشق وسط المستهلك من وعاء الاستزراع ، وهو طبق 60 ملم. في هذه الحالة ، اشطف الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان مرتين باستخدام DPBS.

ثم أضف ملليلتر واحد من الديسبا إلى الطبق. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط محلول ديسبا واغسل الخلايا برفق باستخدام DPBS.

بعد ذلك ، أضف وسيطا خاليا من وحدة التغذية بالكامل لتغطية الطبق واستخدم مكشطة خلية لكشط الخلايا بلطف ، ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. اشطف الطبق بتغذية كاملة من الوسط الحر ، ورش أي خلايا لم تنفصل. انقل محلول الشطف إلى نفس أنبوب 15 مل الذي يحتوي على الخلايا.

اشطف الطبق مرة ثانية بوسيط واسحب محلول الشطف هذا بخلايا بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بالشفط بعناية والتخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. قم بنقر الأنبوب برفق لإخراج حبيبات الخلية بالكامل من قاع الأنبوب.

ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط التجميد A ، باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل. بعد التعليق المنتظم للكتل ، أضف ملليلترا واحدا من وسط التجميد B إلى الأنبوب بطريقة متساقطة مع تحريك تعليق الخلية برفق للخلط. خصص ملليلترا واحدا من تعليق الخلية في كل خلايا تجميد بالتبريد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل في غرفة الأيزوبروبانول.

في اليوم التالي ، انقل قوارير الخلايا إلى خزان نيتروجين سائل للتخزين طويل الأجل. قم بإذابة قارورة الخلايا المجمدة بسرعة عن طريق وضعها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع دقائق حتى تبقى قطعة صغيرة مجمدة في القارورة. بعد إزالة القارورة من حمام الماء ، رذاذ الأيزوبروبانول بنسبة 70٪ لتطهيرها ، استخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لنقل محتويات القارورة بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

قد تكون الخطوة التالية هي أصعب جانب في الإجراء. يجب إضافة الوسط الخالي من التغذية ببطء وحذر إلى الخلايا. لتقليل الصدمة التناضحية أضف ببطء أربعة ملليلتر من الوسط الخالي من وحدة التغذية الكاملة بالتنقيط إلى الخلايا الموجودة في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.

أثناء إضافة الوسيط ، حرك الأنبوب برفق ذهابا وإيابا لخلط الخلايا. سيؤدي ذلك إلى تقليل الصدمة التناضحية للخلايا. يمكن استبدال وسط التغذية الكامل الخالي من التغذية ببديل مصل خروج المغلوب الذي يحتوي على وسط مكيف بالميثامفيتامين أو وسط بديل مصل خروج المغلوب للاستخدام مع المغذيات ، راجع نص البروتوكول للحصول على تعليمات إعداد الوسائط.

بمجرد إضافة كل أربعة ملليلتر من الوسط ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بالشفط بعناية والتخلص من العقل دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في أربعة ملليلتر من وسط كامل خال من التغذية.

باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر، أضف تعليق الخلية برفق إلى طبق ثقافة مطلي بسعة 60 ملليمتر من شاحنات الجلت. ضع طبق الاستزراع في حاضنة من 36 إلى 38 درجة مئوية مع جو مرطب من أربعة إلى 6٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء. قم بتدوير الطبق بعناية في نمط من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب لتوزيع الخلايا بالتساوي.

24 ساعة بعد الذوبان. استبدل الوسط في الطبق بوسط طازج. استبدل الوسط المستهلك يوميا بعد ذلك حتى تصبح الخلايا حوالي 70 إلى 80٪ ملتقية.

تظهر هذه الصورة المتباينة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية المزروعة على أطباق الاستزراع المطلية ب TRX باستخدام بديل مصل كامل ، وسط خال من المغذي. يظهر التصنيف الدولي للسرطان مورفولوجيا مشابها للخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تتميز بنوك كبيرة وسيتوبلازم ضئيل. مثال على الخلايا بعد الذوبان واستبدال مصل بالضربة القاضية.

عرض وسيط مجاني على gelt TrackX هنا. عند اتباع هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تحافظ على جميع مستعمرات الخلايا بنفس الحجم. عند الحفاظ على التبريد ، يحسن هذا استعادة الخلايا.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.