Cryopreserving واسترداد خلايا الجذع من الإنسان الكامل باستخدام الضربة القاضية المصل الطاعم خالية استبدال متوسطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحفظ بالتجميد واستعادة خلايا IPS في ظروف استزراع تعتمد على الخلايا المغذية أو ظروف خالية من الخلايا المغذية. يتم تحقيق ذلك من خلال البدء أولاً بتعبئة خلايا IPC كما تفعل عادةً. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في نقل الخلايا إلى وسط تجميد خالٍ من المصل.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في الحفظ بالتجميد كما تفعل عادةً. والخطوة النهائية من الإجراء هي إذابة الخلايا وبدء عملية الصيانة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر نجاح عملية تجميد وإذابة خلايا IPS في وسط تجميد خالٍ من المصل من خلال المورفولوجيا السليمة والتعافي بعد الإذابة.

مرحباً، أنا كيت واغنر من موقع GCO في Life Technologies. يعد العرض المرئي لهذا البروتوكول أمراً بالغ الأهمية لأن الخلايا السلفية المحفزة (IPCs) قد تكون حساسة جداً للتجميد ودرجة الحرارة. وما يجعل هذا البروتوكول أسهل هو إمكانية استخدام بديل المصل بالضرب القاضي (knockout serum replacement) طوال سير العمل بالكامل.

تتضمن عائلة منتجات KSR اليوم قائمة كاملة من الأوساط والكواشف للزراعة القائمة على الخلايا المغذية، والزراعة الخالية من الخلايا المغذية، والخالية من المكونات الحيوانية الغريبة للخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. يمكن استخدام KSR في الاشتقاق، والنمو، والحفظ بالتجميد، والتوسع، والخطوات الأولية للتمايز. سيوضح الفيديو التالي كيفية إذابة وتجميد الخلايا باستخدام KSR في بيئة خالية من المكونات الحيوانية الغريبة.

لبدء هذا الإجراء، قم أولاً بتدفئة كمية مناسبة من الوسط الغذائي الكامل الخالي من الخلايا المغذية إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي، ثم اسحب الوسط المستهلك من وعاء الزرع، وهو عبارة عن طبق بقطر 60 مليمتر. في هذه الحالة، اشطف الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات مرتين باستخدام DPBS.

ثم أضف 1 mL من dispa إلى الطبق. حضن الطبق عند 37 °C لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، اشفط محلول dispa واغسل الخلايا برفق باستخدام DPBS.

بعد ذلك، أضف وسطاً غذائياً كاملاً خالياً من الخلايا المغذية (complete feeder free medium) لتغطية الطبق، واستخدم كاشطة الخلايا لكشط الخلايا برفق ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 milliliter. اشطف الطبق باستخدام الوسط الغذائي الكامل الخالي من الخلايا المغذية، مع رش أي خلايا لم تنفصل برفق. انقل محلول الشطف إلى نفس أنبوب الـ 15 milliliter الذي يحتوي على الخلايا.

اشطف الطبق مرة ثانية بالوسط، واسحب محلول الشطف الذي يحتوي على الخلايا، ثم قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الطرد المركزي، قم بسحب السائل الطافي بعناية والتخلص منه دون تحريك كتلة الخلايا المترسبة. هز الأنبوب برفق لإزالة كتلة الخلايا تماماً من قاع الأنبوب.

بعد ذلك، أضف 1 mL من وسط التجميد A، باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 5 mL، وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب والدفع اللطيف بالماصة. وبعد تعليق التكتلات بشكل متجانس، أضف 1 mL من وسط التجميد B إلى الأنبوب على شكل قطرات مع تدوير معلق الخلايا بلطف للمزج. وزع 1 mL من معلق الخلايا في كل أنبوب تجميد (cryo vile)، وجمد الخلايا عند -80 °C طوال الليل في غرفة إيزوبروبانول.

في اليوم التالي، انقل أنابيب الخلايا إلى خزان نيتروجين سائل للتخزين طويل الأمد. قم بإذابة أنبوب الخلايا المجمد بسرعة عن طريق وضعه في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح بين ثلاث إلى أربع دقائق تقريبًا حتى يتبقى جزء صغير مجمد فقط في الأنبوب. بعد إخراج الأنبوب من الحمام المائي، قم برشّه بـ 70% isopropanol لتطهيره، ثم استخدم ماصة سعة 5 mL لنقل كامل محتويات الأنبوب بطريقة معقمة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL.

قد تكون الخطوة التالية هي الجانب الأكثر صعوبة في الإجراء. يجب إضافة الوسط الخالي من الخلايا المغذية ببطء وعناية إلى الخلايا. وللحد من الصدمة الاسموزية، أضف أربعة ملي لتر من الوسط الخالي من الخلايا المغذية الكامل قطرة تلو الأخرى ببطء إلى الخلايا الموجودة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملي لتر.

أثناء إضافة الوسط، حرك الأنبوب بلطف ذهاباً وإياباً لخلط الخلايا؛ حيث سيؤدي ذلك إلى تقليل الصدمة الاسموزية التي تتعرض لها الخلايا. يمكن استبدال الوسط الخالي من الخلايا المغذية (feeder free medium) ببديل المصل (knockout serum replacement) الذي يحتوي على وسط مكيف من mth، أو بوسط بديل المصل المخصص للاستخدام مع الخلايا المغذية، ويرجى الرجوع إلى نص البروتوكول للحصول على تعليمات تحضير الأوساط.

بمجرد إضافة أربعة ملي لتر من الوسط، قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي، اسحب السائل بعناية وتخلص منه دون تعكير ترسيب الخلايا. أعد تعليق ترسيب الخلايا برفق في أربعة ملي لتر من الوسط الخالي من الخلايا المغذية الكامل.

باستخدام ماصة سعة 5 mL، أضف معلق الخلايا برفق على شكل قطرات إلى طبق زراعة قطر 60 mm مطلي بـ gelt trucks. ضع طبق الزراعة في حضانة عند درجة حرارة 36 إلى 38 °C مع توفير جو رطب يحتوي على 4 إلى 6% من ثاني أكسيد الكربون في الهواء. حرّك الطبق بعناية بحركة دائرية من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب لتوزيع الخلايا بالتساوي.

بعد 24 ساعة من الإذابة، استبدل الوسط في الطبق بوسط جديد. استبدل الوسط المستنفد يومياً بعد ذلك حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 70 إلى 80% تقريباً.

تُظهر هذه الصورة التباينية خلايا جذعية بشرية مستحثة متعددة القدرات نمت في أطباق زراعة مطلية بـ gelt TRX باستخدام وسط خالٍ من الخلايا المغذية وبديل مصل كامل. وتُظهر هذه الخلايا مورفولوجيا مشابهة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية، والتي تتميز بنوى كبيرة وسيتوبلازم شحيح. هذا مثال للخلايا بعد الإذابة وبديل مصل knockout.

يظهر هنا الوسط الخالي من الخلايا المغذية على gelt TrackX. عند اتباع هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على جميع مستعمرات الخلايا بنفس الحجم. يؤدي ذلك إلى تحسين استعادة الخلايا عند الحفظ بالتجميد.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.