اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف جزيئات صغيرة تعمل على تعديل جوانب رئيسية من التطور والفيزيولوجيا الجنينية بشكل محدد. ويتم تحقيق ذلك من خلال وضع عدد كبير من البيوض المخصبة في أطباق فحص ذات 96 بئراً كخطوة ثانية. تُضاف حصص محددة من مكتبة الجزيئات الصغيرة إلى الأطباق ذات الـ 96 بئراً بجانب الأجنة الموجودة في الـ 96.

يتم فحص أطباق الآبار للكشف عن الأنماط الظاهرية الناتجة عن الجزيئات الصغيرة. وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها الجزيئات الصغيرة التي تؤثر بشكل محدد على نمو أو فيزيولوجيا الأسماك الفائقة. مرحباً، اسمي تشارلز هونغ من كلية الطب بجامعة فاندربيلت.

نقوم في مختبرنا بإجراء عمليات فحص كيميائية عالية الإنتاجية باستخدام أجنة zebrafish. وتعد هذه التقنية سهلة نسبياً ويمكن تكييفها على نطاق واسع لاكتشاف مركبات نشطة بيولوجياً جديدة. في فترة ما بعد ظهر اليوم السابق ليوم الفحص الكيميائي، قم بتجهيز من 10 إلى 20 حوضاً لتكاثر zebrafish.

ضع فاصلاً في كل حوض واملأ كل حوض بالماء من نظام الاستزراع المائي باستخدام شبكة نقل الأسماك، مع وضع ذكر واحد بالغ وأنثيين من البالغات في الوعاء الداخلي. قم بتسمية أحواض التفريخ ووضع غطاء فوقها في صباح يوم الفرز. أزل الفواصل من أحواض التفريخ واترك أسماك الزيبرا للتزاوج.

على مدار الساعة القادمة، اترك البيوض المخصبة تسقط عبر الشبكة الموجودة في قاع كل حاوية داخلية. وبعد مرور ساعة واحدة، أعد أسماك الزبرا البالغة إلى خزانات التخزين الدائمة.

قم بإزالة الحاوية الداخلية واجمع البيض عن طريق تصفية المياه في كل حوض تفريخ باستخدام مصفاة شاي بلاستيكية. اقلب المصفاة فوق طبق بتري واشطف المصفاة بلطف لدفع البيض إلى داخل طبق بتري. باستخدام زجاجة غسيل تحتوي على وسط E three، يجب إزالة جميع البيوض غير المخصبة التي تظهر معتمة.

باستخدام ماصة بلاستيكية ذات استخدام واحد، يجب أن ينتج عن كل عملية تزاوج ما يقرب من 200 جنين. بعد ذلك، يتم نقل حوالي خمسة أجنة في وسط E three إلى كل بئر من آبار طبق ذو 96 بئرًا باستخدام ماصة باستير زجاجية. وبمجرد توزيع الأجنة على طبق ذو 96 بئرًا.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط E three من الآبار باستخدام ماصة ذات 12 قناة، مع الحرص على عدم ثقب الأجنة. وباستخدام الماصة ذات 12 قناة، أضف 250 microliters من E three.

أضف الوسط الذي يحتوي على 0.5 µg/mL من الـ canmycin إلى كل بئر بأسرع ما يمكن لتجنب جفاف الأجنة. ضع أطباق الـ 96 بئر في حاضنة درجة حرارتها 28.5 °C حتى تصل الأجنة إلى المرحلة المطلوبة التي سيتم فيها إضافة المركبات. في هذا البروتوكول، نبحث عن المركبات التي تخل بنمط التكوين الجنيني المبكر، وسنقوم بحضن الأجنة لمدة ثلاث ساعات أو حتى تصل أكثر من 90% من الأجنة إلى مرحلة الـ 1000 خلية، وعادة ما يتم توفير مكتبات الجزيئات الصغيرة.

في لوح مصدر مكون من 96 بئراً حيث يتم تخزين كل مركب في DMSO كمخزون بتركيز 10 millimolar، وقبل حوالي 60 دقيقة من وصول الأجنة إلى المرحلة المطلوبة، قم بإذابة عدد مناسب من ألواح 96 بئراً التي تحتوي على حصص من الجزيئات الصغيرة. دون الرقم التسلسلي أو أي رقم تعريف آخر للألواح المصدر لتقليل التكثف على الألواح. ضعها في غرفة تجفيف تحتوي على مجفف.

قم بطرد الصفائح مركزياً لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي مكتبي مجهز بمحول للصفائح متعددة الآبار. أزل شريط الألمنيوم السقفي من الصفيحة المصدر باستخدام ماصة ذات 12 قناة، ثم خفف المركبات في الصفيحة المصدر إلى التركيز المطلوب باستخدام DMSO. في هذا البروتوكول، نستخدم تركيزاً نهائياً قدره 0.5 millimolar ونضيف 4.75 µL من DMSO لتخفيف صفيحة المخزون ذات التركيز 10 millimolar.

عندما تصل الأجنة في طبق الـ 96 بئراً إلى المرحلة المطلوبة، استخدم ماصة ذات 12 قناة لنقل 2.5 µL من المركبات من أطباق المصدر إلى الأطباق المستقبلة التي تحتوي على الأجنة. غطِّ الأطباق التي تحتوي الآن على الأجنة والمركبات بالأغطية، وسجّل رقم تعريف أطباق المصدر على أطباق الأجنة. اخلط الأطباق عن طريق التدوير اللطيف وضعها في حاضنة عند درجة حرارة 28.5 °C.

قم بتغطية كل لوحة مصدر تحتوي على جزيئات صغيرة غير مستخدمة بسقف من الألومنيوم، وثبتها بالشريط اللاصق ثم ضعها في مجمد بدرجة حرارة 80- درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. وقبل إجراء الفحص البصري، حدد معياراً محدداً لإصابة الهدف. على سبيل المثال، في فحص للمثبطات من الجزيئات الصغيرة لـ four brainin development، قد تكون الإصابة عبارة عن مركب يؤدي إلى فقدان الدماغ الأمامي.

يُعد غياب العينين مؤشراً بصرياً سهلاً لفقدان الدماغ الأمامي، ولا يتطلب استخدام الفلورسنت لتقييمه في الأوقات المحددة من التطور. قم بإزالة أطباق الـ 96 بئراً التي تحتوي على أجنة معالجة بالمركبات من الحضانة، وافحص كل بئر تحت مجهر ستيريو؛ وعند الفحص عن المثبطات الجزيئية الصغيرة لتطور الدماغ الأمامي، افحص الأطباق عند الساعة 28 للتأكد من فقدان العين كعلامة على تثبيط تطور الدماغ الأمامي. سجل هوية الطبق وموقع البئر لأي بئر يظهر فيه على الأقل ثلاثة من أصل خمسة أجنة النمط الظاهري المحدد. أعِد طبق الـ 96 بئراً إلى الحضانة.

أكّد مجدداً فقدان العينين والدماغ الأمامي عند 48 ساعة. وبالرغم من أن الأجنة لن يكون لديها دماغ أمامي، إلا أنها ستعيش لمدة أربعة أيام على الأقل. أكّد وجود تأثير محتمل عن طريق إعادة اختبار تأثيرات المركب بعدة جرعات، حيث يتم اختبار 10 أجنة لكل جرعة في 0.5 milliliters من وسط E3 في طبق يحتوي على 48 بئراً.

يجب أن يكون توقيت تحضير المركب لإعادة الاختبار مطابقاً لتوقيت الفحص الأصلي. يتم تأكيد وجود HIIT عندما يتم إعادة إنتاج النمط الظاهري المستحث بطريقة تعتمد على الجرعة عند إعادة اختبار المركب. وأخيراً، يتم تحديد المركب النشط (hi) من قاعدة بيانات الجزيئات الصغيرة في المكتبة الكيميائية.

باستخدام الفرز الكيميائي البصري المعتمد على سمك الزيبرا، اكتشفنا جزيئاً صغيراً مثبطاً لإشارات hedgehog بناءً على تأثيره على محور الجسم. تُظهر هذه الصورة أجنة تعرضت لمثبط hedgehog وتظهر انحناءً بطنياً ملحوظاً في الذيل. وعند مرور 24 ساعة، لا تزال الأجنة نفسها التي فُحصت عند 48 ساعة تُظهر النمط الظاهري المنحني بطنياً.

تُظهر هذه الصورة الجنين المعالج بالمركب مقارنة بالجنين الطافر في مسار hedgehog. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن لشخص واحد فحص ما يقرب من 400 مركب أسبوعياً في غضون بضع ساعات فقط. كما مهدت هذه التقنية الطريق لعلماء البيولوجيا الكيميائية لدراسة أمور مثل تطور الخلايا، ومسارات إشارات الخلايا، والتطور الجنيني.

عند العمل مع جزيئات صغيرة غير محددة الخصائص، من المهم مراعاة تدابير السلامة المناسبة وارتداء معاطف المختبر والقفازات، حيث إن هذه الجزيئات غير المحددة قد تكون خطيرة.