اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف جزيئات صغيرة تعدل على وجه التحديد الجوانب الرئيسية للتطور الجنيني وعلم وظائف الأعضاء. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع عدد كبير من البويضات المخصبة في 96 أثناء فحص الأطباق كخطوة ثانية. أضيفت [ألكوبس] من مكتبة الجزيئات صغيرة إلى ال 96 بئر لوحات أجنة تالية في ال 96.

يتم فحص ألواح الآبار بحثا عن الأنماط الظاهرية التي تنتجها الجزيئات الصغيرة. تم الحصول على النتائج التي توضح الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على وجه التحديد على نمو الأسماك الفائقة أو علم وظائف الأعضاء. مرحبا ، اسمي تشارلز هونغ في كلية الطب بجامعة فاندربيلت.

في مختبرنا ، نقوم بإجراء شاشات كيميائية عالية الإنتاجية باستخدام أجنة ثنائي السمك. هذه تقنية سهلة نسبيا يمكن تكييفها على نطاق واسع لاكتشاف مركبات نشطة بيولوجيا جديدة. بعد ظهر يوم الفحص الكيميائي ، قم بإعداد 10 إلى 20 خزانا لتربية أسماك الزرد.

ضع مقسم في كل حوض واملأ كل خزان بالمياه من نظام الاستزراع المائي باستخدام شباك سمكية ، ذكر بالغ واحد وأنثى بالغة إلى أنثى بالغتين إلى الحاوية الداخلية. في كل خزان تربية ، قم بتسمية الخزانات وضع غطاء عليها في صباح الشاشة. قم بإزالة الفواصل من خزانات التكاثر واترك سمك الزرد يتزاوج.

على مدار الساعة التالية. اترك البيض المخصب يسقط عبر الشبكة في قاع كل حاوية داخلية. بعد ساعة واحدة ، أعد أسماك السيبر البالغة إلى خزانات التخزين الدائمة.

قم بإزالة الحاوية الداخلية واجمع البيض عن طريق تصفية الماء في كل خزان تكاثر من خلال مصفاة شاي بلاستيكية. اقلب المصفاة فوق طبق بتري واشطف المصفاة برفق لغسل البيض في طبق بتري. باستخدام زجاجة غسيل تحتوي على E ثلاثة متوسطة ، يجب إزالة جميع البويضات غير المخصبة التي تبدو معتمة.

باستخدام ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها ، يجب أن ينتج عن كل صليب تزاوج ما يقرب من 200 جنين. ثم انقل حوالي خمسة أجنة في E ثلاثة متوسطة إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر باستخدام ماصة زجاجية. بمجرد أن يتم ترتيب الأجنة على صفيحة 96 بئر.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط E الثلاثة من الآبار باستخدام ماصة 12 قناة. الحرص على عدم ثقب الأجنة. باستخدام الماصة ذات 12 قناة، قم بتوصيل 250 ميكرولتر من E ثلاثة.

يمكن للوسط الذي يحتوي على 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر أن يتحول إلى كل بئر في أسرع وقت ممكن حتى لا يسمح للأجنة بالجفاف. ضع ألواح الآبار البالغ عددها 96 في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة المرغوبة عند إضافة المركبات. في هذا البروتوكول ، نبحث عن المركبات التي تزعج الزخرفة الجنينية المبكرة وستحتضن الأجنة لمدة ثلاث ساعات أو حتى يتم تحقيق مرحلة 1000 خلية بأكثر من 90٪ من الأجنة التي يتم توفير مكتبات الجزيئات الصغيرة عادة.

في لوحة مصدر 96 بئر مع كل مركب مخزن في DMSO كمخزون 10 مللي مولار ، قبل حوالي 60 دقيقة من وصول الأجنة إلى المرحلة المرغوبة ، قم بإذابة عدد مناسب من 96 لوحة بئر تحتوي على حصصات من جزيئات صغيرة. لاحظ رقم التعريف التسلسلي أو غيره من الأرقام التعريفية للوحات المصدر لتقليل التكثيف على الألواح. تسقط في غرفة تجفيف تحتوي على مجفف. يمين.

قم بتدوير الألواح لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي منضدي مزود بمحول لوحة متعدد الآبار. قم بإزالة شريط السقف المصنوع من الألومنيوم من لوحة المصدر باستخدام ماصة ذات 12 قناة لتخفيف المركبات الموجودة في لوحة المصدر إلى التركيز المطلوب باستخدام DMSO. في هذا البروتوكول ، نستخدم تركيزا نهائيا 0.5 ملليمولار ونضيف 4.75 ميكرولتر من DMSO لتخفيف صفيحة المخزون 10 ملليمول.

عندما تصل الأجنة الموجودة في صفيحة البئر 96 إلى المرحلة المرغوبة ، استخدم ماصة 12 قناة لنقل 2.5 ميكرولتر من المركبات من ألواح المصدر إلى الصفائح المستقبلة التي تحتوي على الأجنة. قم بتغطية الصفائح التي تحتوي الآن على الأجنة والمركبات بأغطية ، وسجل رقم تعريف لوحات المصدر على ألواح الجنين. امزج الأطباق عن طريق التحريك برفق وضعها في حاضنة 28.5 درجة مئوية.

قم بتغطية كل لوحة مصدر تحتوي على جزيئات صغيرة غير مستخدمة بسقف من الألومنيوم وشريط لاصق وضعها في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل. قبل إجراء الشاشة المرئية ، قم بصياغة معيار ضرب معين. على سبيل المثال ، في شاشة مثبطات الجزيئات الصغيرة لأربعة brainin ، قد تكون الضربة مركبا يمنح فقدان الدماغ الأمامي.

يعد غياب العينين مؤشرا بصريا سهلا لفقدان الدماغ الأمامي ولا يتطلب أي تألق للفحص في الأوقات المرغوبة في النمو. قم بإزالة 96 لوحة بئر تحتوي على أجنة معالجة مركبة من الحاضنة وفحص كل بئر تحت مجهر استريو عند فحص مثبطات الجزيئات الصغيرة لأربعة أنواع من تطور الدماغ ، وفحص الألواح في 28 ساعة بحثا عن فقدان العين كعلامة على تثبيط نمو أربعة brainin. سجل هوية اللوحة وموقع البئر لأي بئر يظهر فيه ثلاثة على الأقل من كل خمسة أجنة النمط الظاهري الموصوف ، ضع لوحة البئر 96 مرة أخرى في الحاضنة.

أعد تأكيد فقدان العينين والدماغ الأمامي في 48 ساعة. على الرغم من أن الأجنة لن يكون لها دماغ أمامي ، إلا أنها ستعيش لمدة أربعة أيام على الأقل. إعادة تأكيد ضربة محتملة من خلال إعادة اختبار تأثيرات المركب بعدة جرعات لكل جرعة ، يتم اختبار 10 أجنة في 0.5 مل من E ثلاثة وسائط في شكل 48 لوحة بئر.

يجب أن يكون توقيت الإصدار المركب لإعادة الاختبار مطابقا لتوقيت الفحص الأصلي. يتم تأكيد HIIT عندما يتم استنساخ النمط الظاهري المستخرج بطريقة تعتمد على الجرعة عند إعادة اختبار المركب. أخيرا ، حدد مركب hi من قاعدة بيانات الجزيئات الصغيرة في المكتبة الكيميائية.

باستخدام الشاشة الكيميائية المرئية القائمة على أسماك الزرد ، اكتشفنا مثبطا لإشارة القنفذ جزيئا صغيرا بناء على تأثيره على محور الجسم. تظهر هذه الصورة أجنة معرضة لمثبط القنفذ تظهر انحناءا بطنيا ملحوظا للذيل. في 24 ساعة ، لا تزال نفس الأجنة التي تم فحصها في 48 ساعة تعرض النمط الظاهري المنحني البطني.

تعرض هذه الصورة الجنين المعالج المركب مقارنة بالجنين المتحور لمسار القنفذ. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن لشخص واحد فحص ما يقرب من 400 مركب أسبوعيا في غضون ساعتين فقط. مهدت هذه التقنية أيضا الطريق لعلماء الأحياء الكيميائية لدراسة أشياء مثل تطور الخلايا ومسارات إشارات الخلية والتطور الجنيني.

عند العمل مع جزيئات صغيرة غير مميزة ، من المهم أن يكون لديك سلامة مناسبة لاستخدام معاطف المختبر والقفازات لأن هذه الجزيئات غير المميزة قد تكون خطرة.