تسليم الجينات إلى الدماغ الجرذ بعد الولادة من غير البطين حقن البلازميد وElectroporation

أهلاً بكم، أنا RI Ov. وأنا أليكسيا ينغ. نحن طلاب دراسات عليا في جامعة Cent. في هذا الفيديو، سنعرض طريقة التثقيب الكهربائي في الجسم الحي (in vivo electroporation) لإيصال جين مستهدف إلى منطقة معينة من أنسجة الدماغ الرائدة.

إذًا، لنلقِ نظرة. إن طريقة التثقيب الكهربائي في الجسم الحي توفر وسيلة سريعة وفعالة لإيصال الجينات المستهدفة أو الحمض الريبوزي النووي الصغير المتداخل إلى أنسجة الدماغ الحية.

توفر هذه الطريقة بديلاً منخفض التكلفة لإنتاج الحيوانات المعدلة وراثياً ومنهجية نقل الجينات الفيروسية. سنقوم في هذا الفيديو باستعراض إجراء تفصيلي لنقل الجينات بعد الولادة إلى القشرة المخية لحديثي الولادة من الجرذان. وسنستخدم البلازميد المشفر للبروتين الفلوري الأخضر المعزز (enhanced green fluorescent protein) ومحفز beta actin للدجاج مع معزز CMV.

نقوم بإجراء جميع المناورات الجراحية داخل كابينة التدفق الصفائحي للحفاظ على التعقيم وتقليل مخاطر التلوث البكتيري أو الفطري للحيوان. ولتوصيل البلازميد إلى القشرة المخية، نستخدم محقنًا دقيقًا من نوع WPI مزودًا بوحدة تحكم إلكترونية ومحقنة هاميلتون سعة 10 µL متصلة بمناور مجسمي. يتم تخدير الجرو الأحمر باستخدام وحدة تخدير تتكون من صندوق وقناع.

يتم بعد ذلك تثبيت الجرو باستخدام قضبان الأذن على طاولة التسخين المتصلة بالمُناول التوجيهِي (stereotactic manipulator). ولإجراء المعالجة الجراحية ومراقبة الحقن المجهري، نستخدم مجهراً ثنائياً. أما بالنسبة لعملية التثقيب الكهربائي، فنستخدم جهاز التشغيل الكهربائي CYV 21 in vivo مع أقطاب كهربائية على شكل ملقط.

من أجل استعادة الجراء من التخدير، تُستخدم غرفة تسخين. نقوم عادةً بتحضير 10 µL من محلول حقن البلازميد في أنبوب ذو جدار رقيق سعة 200 µL، حيث يكون هذا المحلول كافياً لإجراء عدة تجارب.

نخلط ثمانية µL من محلول البلازميد مع واحد µL من 10 XPBS وواحد µL من محلول fast green بتركيز 0.1% في الماء. يجب أن يتراوح التركيز النهائي للبلازميد في محلول الحقن بين 1 و3 µg/µL. إن استخدام تركيزات أقل من DNA البلازميد سيقلل من كفاءة عفن التحول (transfection)، بينما سيكون التركيز الأعلى لـ DNA شديد اللزوجة بحيث يصعب حقنه عبر الطرف الرفيع للشعيرة الزجاجية.

لتحضير الماصة الزجاجية، نستخدم أنبوباً شعرياً من زجاج البوروسيليكات مع فتيلة وجهاز سحب الزجاج (glass pooler) ذا القطب الرأسي، مع ضبط معايير السحب والتسخين على الحد الأقصى. بعد ذلك، نقوم بكسر طرف الماصة باستخدام قطعة من الورق للحصول على طرف يتراوح قطره بين 10 إلى 20 µm. ثم نتحقق من قطر الطرف وشكله باستخدام عدسة المجهر الشيئية.

باستخدام شعيرة بوليمرية رفيعة، نملأ ما يقرب من ثلث حجم محقنة هاميلتون سعة 10 microliter. وباستخدام الزيت المعدني، نحرص على تجنب فقاعات الهواء. ثم نملأ الماصة الزجاجية بالزيت المعدني وندخل الماصة في محقنة هاميلتون.

مرة أخرى، يجب تجنب تكون فقاعات الهواء. بعد ذلك، يتم تثبيت المحقنة المزودة بالماصة الزجاجية على حاقن دقيق متصل بجهاز تحكم. ويسمح لنا إعداد الحقن الدقيق المثبت على جهاز التوجيه التجسيمي بغمر طرف الماصة الزجاجية بأمان في الأنبوب الذي يحتوي على محلول حقن البلازميد.

عندما يلامس الطرف سطح المحلول، نقوم بغمسه لمسافة تتراوح بين واحد إلى اثنين مليمتر إضافيين. ثم نستخدم وحدة التحكم في المحقن الدقيق لملء الماصة بحوالي 1 µL من مزيج الحقن. وقد أُجريت جميع التجارب المعروضة هنا وفقاً للوائح جامعة هلسنكي الخاصة بالتجارب على الحيوانات.

لكل تجربة، نملأ حقنة محكمة الغلق بمادة isof fluorine. نثبت الحقنة في وحدة التخدير المتصلة بمصدر تدفق الهواء، بينما يسير الحيوان ويكون القناع مثبتاً على جهاز التوجيه المجسم (stereotactic setup). وفي وحدة التخدير، نضبط تدفق الهواء ليكون 250 milliliters minute تقريباً ومستوى isof fluorine بنسبة 4%. نضع الغطاء الأحمر في صندوق الحيوان لمدة تتراوح من دقيقتين إلى خمس دقائق.

عندما يتوقف P عن الحركة، نضعه على وسادة التسخين المتصلة بجهاز التوجيه المجسم. ونضع الجزء المنقاري من رأس P في القناع. ويستغرق الجرو عادةً من خمس إلى 10 دقائق للدخول في حالة التخدير العميق.

عند تحقيق ذلك، نقوم بخفض تدفق الإيزوفلوران إلى ما يقرب من 1.5 إلى 2%. نقوم بتطهير الجلد على رأس الجرو باستخدام ethanol 70% باستخدام قطنات صغيرة وملقط رفيع. نقوم بقص الجلد من قفا الجرو وصولاً إلى جبهته، وثني قطع الجلد جانبياً، وسحب قضبان الأذن قليلاً نحو الفتحات الفموية للجمجمة لتثبيت الرأس والجلد. وباستخدام مجهر ثنائي العينين، يتم تحديد نقطة المرجع (bregma) على الجمجمة لتعيين المنطقة المستهدفة باستخدام الإحداثيات المجسمة، ثم يتم وضع ماصة الحقن فوق هذه المنطقة وتحديدها عن طريق إسقاط 25 إلى 50 nanoliters من محلول الحقن على سطح الجمجمة.

نقوم بثقب الجمجمة برفق وعناية عند النقطة المحددة باستخدام مثقاب جراحي عالي السرعة تحت المجهر حتى يظهر السائل في منطقة الثقب. ثم نقوم بتثبيت ملقط التثقيب الكهربائي، والأقطاب الكهربائية على جانبي الجمجمة. ونضع هلاماً موصلاً لتحقيق توصيلية أفضل.

نقوم بإزالة القطرة السائلة من المنطقة المثقوبة باستخدام قطعة قطن صغيرة، ثم نغمس الإبرة الزجاجية في الثقب. وبناءً على إحداثيات موقع الحقن، نقوم بحقن من 25 إلى 100 nanoliter من محلول الحقن بمعدل يتراوح بين 5 إلى 20 nanoliter في الثانية. ثم نزيل الماصة بسرعة ونشرع في عملية التثقيب الكهربائي على الفور.

يتم إجراء التثقيب الكهربائي عن طريق تطبيق خمس نبضات بمدة 50 milliseconds وسعة نبضة قدرها 99 volts وتردد قدره one hertz. ثم نقوم بإزالة الأقطاب الكهربائية وقضبان تثبيت الأذنين. بعد ذلك، نقوم بخياطة الجلد المقطوع باستخدام مزيج من الملاقط الكليلة والحادة والخيوط الجراحية.

وضعنا الجرو في غرفة دافئة لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة للمساعدة في تعافيه بعد التخدير، ثم أعدنا الجرو إلى قفص أمه. سيظهر تعبير الجين المنقول في الخلايا التي تم نقلها بنجاح بعد حوالي 10 ساعات من التثقيب الكهربائي، وسيبقى مستقراً لعدة أسابيع.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم. وداعاً.