يعاير β اميلويد السمية باستخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس النموذجي

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص سمية ببتيد بيتا أميلويد في نظام نموذج InVivo. تسمح قابلية التكاثر والبساطة النسبية لهذا الاختبار بالاختبار السريع للأدوية أو الظروف البيئية أو التعديلات الجينية على سمية بيتا أميلويد. أحد العوامل الرئيسية في تطوير هذا الاختبار هو توليد ديدان cl egan المعدلة وراثيا مع التعبير المحفز لدرجة حرارة محددة للعضلات لببتيد بيتا أميلويد.

يتم تصميم هذا التعبير الحساس لدرجة الحرارة عن طريق بناء جين معدل يحتوي على منطقة طويلة غير طبيعية ثلاثية غير مترجمة مما يجعل mRNA المعدل وراثيا هدفا لمراقبة mRNA ، وبالتالي فإن تعبير mRNA لهذا الجين المعدل ضعيف في الديدان من النوع البري مع نظام مراقبة mRNA وظيفي بسبب تدهور mRNA المعدل وراثيا. إذا تم إدخال هذا الجين المعدل في خلفية وراثية تحتوي على طفرة في مكون أساسي لنظام مراقبة الرنا المرسال ، فسيكون التعبير الجيني المعدل أعلى بكثير. إذا كانت الخلفية الجينية تحتوي على طفرة حساسة لدرجة الحرارة في نظام مراقبة mRNA ، فإن انتشار هذه السلالة الخنادق عند درجة الحرارة غير المسموح بها سيمنع تدهور mRNA الجيني للخندق ويؤدي إلى تعبير جيني عالي الخندق للديدان الخنادق التي تستخدم هذا النظام لتنظيم التعبير عن عضلات جدار الجسم لارتفاع درجة حرارة ببتيد بيتا أميلويد من 16 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية ، ينتج عنه تراكم عال لخلل ببتيد بيتا أميلويد في خلايا العضلات وشلل قياس الديدان في ذلك الوقت.

يتطلب الأمر مجموعة من هذه الديدان الخنادق لتصاب بالشلل بعد درجة الحرارة. Upshift هو اختبار حساس لسمية بيتا أميلويد. يتم تحقيق ذلك عن طريق صنع ألواح وسائط نمو الديدان الخيطية الطازجة لمقايسة الشلل ، مما يساعد على تقليل المتغيرات البيئية التي يمكن أن تؤثر على معدلات الشلل.

كخطوة ثانية ، تزامن العمر مجموعات الديدان الخنادق أو بدأها ، وهذا يقلل من آثار مرحلة النمو على التعبير الجيني المعدل. بعد ذلك ، يتم رفع المرحلة اليرقية الثالثة المتزامنة من 16 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية ، مما يزيد من استقرار mRNA المعدل وراثيا ويؤدي إلى تراكم ببتيد بيتا أميلويد. إن قياس الوقت من التحول إلى الشلل لكل دودة يلتقط معدل الخلل الوظيفي في العضلات ، وبالتالي فحص التأثيرات السامة لتراكم ببتيد بيتا أميلويد يتم الحصول على نتائج التي تظهر تأثير علاجات محددة على سمية ببتيد بيتا أميلويد المعبر عنه داخليا.

لذا فإن الميزة الرئيسية لتقنيتنا ، على عكس استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا لفحص نشاط الدواء هي أنه يمكننا القيام بتقنيتنا بسرعة أكبر وأقل تكلفة. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. من الصعب جدا تعلم تسجيل L four ديدان في اختبار الشلل.

لذلك عندما تسجل دودة L four مشلولة ، فإن ما تريد أن تنظر إليه هو حركة الهالة المعزولة لمنطقة رأس الدودة. بمجرد أن يتحرك ويصاب جسم الدودة بالكامل بالشلل، سنسجل أن الدودة مشلولة. يتم إجراء مقالات الشلل على ألواح من وسائط نمو الديدان الخيطية القياسية أو NGM المستخدمة بشكل روتيني لانتشار CL egan وعلم الوراثة.

لتحضير ألواح الأوتوكلاف ، محلول NGM الذي يحتوي على كلوريد الصوديوم ، أجار ، والببتيد في قارورة إرلينماير ، ثم أضف الكميات المناسبة من المحاليل المعقمة التالية التي يمكن العثور عليها في البروتوكول المكتوب المصاحب. Aliquot 10 ملليلتر من NGM السائل في كل طبق بتري 60 ملم × 15 ملم. اسمح ل NGM بالتصلب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

إذا كنت تختبر آثار المركبات أو المستخلصات, aliquot استخراج على كل لوحة واستخدام موزعة لتوزيعها بالتساوي على سطح اللوحة. اترك الأطباق تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. تتطلب الأحجام التي تزيد عن مليلتر واحد مزيدا من الوقت حتى تجف.

بعد ذلك ، ضع كل صفيحة تحتوي على 250 ميكرولتر من سلالة الإشريكية القولونية OP 50 المزروعة في وسائط LB بين عشية وضحاها بكثافة بصرية تتراوح من 0.4 إلى 0.6 ، مما يسمح للبكتيريا بالجفاف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. عمر اللوحة له تأثير كبير على معدل الشلل ، وعلى هذا النحو تميل الألواح القديمة إلى الجفاف. يجب سكب الأطباق في غضون أسبوع واحد من فحص الشلل.

من الناحية المثالية ، تريد استخدام الأطباق التي تم سكبها قبل ثلاثة إلى أربعة أيام من وضع البيض المتزامن ، يجب أن تأتي جميعها من نفس الدفعة التي تغير حجم العشب ، أو أن البكتيريا ستغير أيضا سلوك الديدان ، ويمكن إجراء فحوصات الشلل باستخدام سلالات القولونية الإلكترونية البديلة. على سبيل المثال ، يتم استخدام HT one 15 في تجارب RNAi. ومع ذلك ، قد يغير هذا حركية مقايسة الشلل.

لذلك ، يجب عليك استخدام عناصر تحكم داخلية مناسبة Strain. يستخدم CL 476 بشكل شائع لفحص الشلل الناجم عن بيتا. هذه السلالة وغيرها من النماذج المعدلة وراثيا متاحة للباحثين الأكاديميين مقابل رسوم رمزية من مركز القديس أحادي الوراثي.

لتعظيم التزامن العمري لمجموعة الاختبار ، يفضل. ابدأ بجيل أبوي متزامن. قبل أسبوع من بدء فحص الشلل لمجموعة الاختبار ، استخدم منتقي دودة البلاتين لنقل 20 إلى 30 بالغا خطيرا إلى عدة ألواح NGM بطول 10 سم.

يوزع مع OP 50 لمدة ساعتين ، توضع البيض عند 16 درجة مئوية ، وهي درجة الحرارة المسموح بها ل CL 4 1 76. قم بإزالة البالغين الوراثيين واسمح للنسل بالنمو لمدة سبعة أيام وفي ذلك الوقت سيكونون بالغين في اليوم الثاني. الجاذبية في اليوم الثاني.

يتم استخدام البالغين لإعداد مجموعات الاختبار المتزامنة للعمر لكل حالة تجريبية. الهدف هو إنشاء صفائح ثلاثية تحتوي على 50 إلى 75 ديدان متزامنة من العمر باستخدام منتقي دودة البلاتين نقل 10 إلى 12 من اليوم ، اثنان من البالغين الأكثر خطورة على ألواح NGM 60 ملم مرقطة باستخدام OP 50. اسمح للديدان بوضع البيض عند 16 درجة مئوية لمدة ساعتين ، ثم التقط البالغين واترك البيض يفقس وينمو بدرجة حرارة 16 درجة مئوية.

في هذه المرحلة ، من الأفضل أن يكون لديك شخص لن يسجل اللوحات لترميزها حتى تكون النتيجة عمياء عن الظروف التجريبية. مرحلة التطور الجنيني عند وضع البيض ، والتي هي تقريبا مرحلة 26 خلية للديدان البرية في ظل الظروف المثلى ، هي دالة على عمر البلوغ والتغذية. إذا كانت الجاذبية البالغة المستخدمة في وضع البيض أكبر سنا أو جائعة ، وضع البيض المرحلي لاحقا ولن يتم تحقيق السكان المتزامنين ، مما يؤثر على حركية فحص الشلل.

من الضروري استخدام الثقافات البكتيرية أحادية الجين مثل الإشريكية القولونية ، OP 50 لأن التلوث البكتيري من أي نوع يمكن أن يؤثر بشدة على هذا الفحص. تكون قابلية التكاثر أعلى إذا كانت الألواح الثلاثية تحتوي على عدد مماثل من الديدان لتحفيز الجين المعدل وإجراء فحص الشلل. لوحات رفع السرعة إلى 25 درجة مئوية.

بعد 48 ساعة من نهاية البيض المتزامن ، يجب أن تكون الدودة في مرحلة اليرقات الثالثة. يجب ترتيب الألواح دون تكديس في حاضنة 25 درجة مئوية للسماح للألواح بالوصول إلى درجة الحرارة هذه. في الوقت نفسه ، ابدأ في تسجيل شلل الديدان في غضون 18 إلى 20 ساعة بعد بدء التصاعد.

في هذه المرحلة ، يجب أن تصل جميع الديدان في السكان إلى مرحلة اليرقات الرابعة ، واستمرت في التسجيل بزيادات ساعتين حتى تصاب جميع الديدان الموجودة على كل لوحة بالشلل. لأسباب غير معروفة ، لا يكون الشلل حتى عبر طول الجسم. منطقة الرأس هي الجزء الأخير من الدودة التي تتوقف عن الحركة.

وبالتالي ، فإن الديدان التي بدأت مؤخرا في الشلل لا يمكن أن تترجم عبر الصفيحة ، ولكن يمكنها تحريك رؤوسها ، وبالتالي إزالة البكتيريا حول الأمام وترك هالة من البكتيريا التي تم تطهيرها. ستصبح هذه الديدان مشلولة تماما دائما ، وبالتالي تتميز الديدان ذات الهالات بأنها مشلولة. لن تحتوي بعض الديدان على هالات ، ولكنها لن تظهر أيضا حركة تلقائية.

يتم اختبارها عن طريق حثها بمنتقي الديدان. إذا لم تتمكن الدودة المحفزة من الخضوع لانتشار موجة الجسم بالكامل عند الحث ، تسجيلها أيضا على أنها مشلولة من أجل التسجيل بكفاءة. من الأسهل نقل الديدان المشلولة إلى قطاع غير مرقط من اللوحة حتى لا يتم إعادة تسجيلها عن غير قصد في فترة التسجيل التالية.

يسمح هذا أيضا للديدان المصنفة بشكل خاطئ بإظهار الحركة ، مما يسمح لتصحيح التسجيل بتوليد منحنى الشلل. في كل نقطة زمنية ، يتم تحويل جزء الديدان الموجودة على كل لوحة التي لم تتعرض للشلل إلى نسبة مئوية ، ويتم رسم متوسط النسبة المئوية التي لا مثيل لها مقابل الوقت من وقت بدء النقل. المنحنى الناتج مشابه رسميا لمنحنى البقاء على قيد الحياة وبالتالي يمكن تحليله باستخدام إحصائيات البقاء على قيد الحياة القياسية غير المعلمية.

يجب إجراء رفع الديدان العضلية المعدلة وراثيا ثلاثة ديدان بيتا A بحلول منتصف المرحلة الرابعة L من أجل بدء الشلل. يتم تنظيم مروج Myo الثلاثة من الناحية التنموية. بمجرد أن تصل الديدان إلى أواخر L الرابعة أو مرحلة البلوغ ، انخفض مستوى التعبير بشكل كبير.

يتم حظر التعبير عن الجين المعدل إذا كانت الديدان جائعة ، لذلك من الضروري جدا أن يتم تغذية الديدان جيدا طوال التجربة. لم نلاحظ أبدا دودة مشلولة تتعافى تحت أي ظرف من الظروف. بعد 12 إلى 16 ساعة من Upshift ، سيصاب CL 41 76 بالشلل ، بغض النظر عما إذا قمت بخفض إزاحته إلى 16 درجة في الإجهاد ، يمكن أن يحدث تنظيم CL 41 76 للتعبير الجيني المعدل الذي يسبب الشلل في درجات حرارة منخفضة.

ومع ذلك ، يرجى ملاحظة أن معدل الشلل سيتأثر في توقيته. يعتمد معدل الشلل على السلالة المعدلة وراثيا المحددة المستخدمة. لقد أنشأنا ثلاث سلالات بيتا من ميو A لها معدل شلل أسرع وأبطأ من CL 41 76 ، وعلى هذا النحو ، تحتاج إلى ضبط نافذة التسجيل الخاصة بك لمقايسة الشلل وفقا لذلك.

يظهر هنا مخطط منحنى الشلل ل CL 4 1 76 ، غير معالج ومعرض ل 6.27 مللي مولار من الكافيين. ينتج عن هذا العلاج تأخير معتد به إحصائيا للغاية في الشلل لمدة أربع ساعات تقريبا ، وهو ما نفسره على أنه مؤشر على قمع سمية بيتا. في هذا النموذج ، قامت هذه التجربة بفحص تأثيرات مركب آخر موجود في القهوة.

المؤامرة نموذجية للعلاجات التي لا تؤثر على سمية بيتا. لاحظ أنه في كلتا التجربتين ، يصاب حوالي نصف مجموعات CL 4 1 76 غير المعالجة بالشلل في غضون 24 ساعة ويكتمل الشلل بمقدار 28 ساعة. هذه هي الأطر الزمنية النموذجية لشلل السيطرة.

CL 4 1 7 6 تشير الانحرافات الكبيرة عن هذا التوقيت إلى تغير الظروف البيئية أو الحذف التلقائي للنسخ المعدلة وراثيا. انظر البروتوكول المصاحب للحصول على معلومات إضافية حول السلالة CL 4 1 76. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك عمر الصفائح ، ومرحلة تجمعات الديدان ، والقدرة على تسجيل معدل شلل الديدان.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية استخدام نظام elgan البحري هذا لفحص سمية بيتا أميلويد بعناية. يجب أن تكون قادرا على اكتشاف التأثيرات الدقيقة جدا على هذه السمية لمجموعة متنوعة من العلاجات البيئية أو الدوائية. من المهم الانتباه إلى المتغيرات التي تحدثنا عنها لأن هذا سيمكنك من إجراء الفحص بشكل متكرر للغاية وبحركية شلل ثابتة.

هذا في الواقع مهم جدا إذا كنت ترغب في مقارنة نتائجك التي تم إجراؤها في مختبرك في أوقات مختلفة من قبل أشخاص مختلفين ، أو مقارنة نتائجك بباحثين آخرين باستخدام هذا النظام النموذجي.