التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

هذا الفيديو يوضح إعداد الثقافات العصبية الأولية من أجنة ذبابة الفاكهة midgastrula المرحلة. آراء الثقافات الحية تظهر الخلايا 1 بعد ساعة من الطلاء ، والخلايا العصبية متباينة بعد 2 أيام من النمو في وسط بيكربونات المستندة إلى المعرفة. والخلايا العصبية كهربائيا منفعل وشكل اتصالات متشابك.

اسمي ديانا دود ، وأنا أستاذة في قسم بيولوجيا النمو والخلية وعلم التشريح والبيولوجيا العصبية في جامعة كاليفورنيا في إيرفين. واليوم سأعرض تحضير الثقافات العصبية الأولية من ذبابة الفاكهة الأجنة. وما يستلزمه هذا هو في الواقع إزالة جميع الخلايا من مرحلة الجهاز الهضمي المتوسطة، ذبابة الفاكهة، ووضعها في مزرعة الخلايا.

وما نستخدم هذه الثقافات من أجله هو أن نفهم حقا ما هي الجينات والعوامل البيئية المهمة لتنظيم الاستثارة الكهربائية والانتقال المشبكي بين ذبابة الفاكهة العصبية. لبدء هذا الإجراء ، يتعين علينا جمع أجنة ذبابة الفاكهة. للقيام بذلك ، نأخذ أطباق جمع البيض ، وننشر عليها القليل من معجون الخميرة.

إنها ركيزة مواتية للذباب البالغ لوضع بيضها. نضع هذه اللوحات على زجاجات تحتوي على مجموعة من الذباب البالغ ، عادة ما يكون من مائة إلى 200 ذبابة. ثم تركنا الذباب ، الذباب البالغ يضع بيضه لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات.

ثم نزيل ألواح جمع البويضات ، وهذه هي الأجنة التي نستخدمها في إجراء الاستزراع. الخطوة التالية في الإجراء هي طلاء الأجنة ، وهذا يعني أننا في الواقع نزيل القنبلة. نقوم بذلك عن طريق غسل الأجنة في قمع Buechner الذي لدينا عليه قطعة من ورق الترشيح حتى تلتقط الأجنة.

نسمح لهم بالجلوس في قمع Buchner في محلول مبيض بنسبة 50٪. لا يعمل محلول التبييض بنسبة 50٪ هذا على إذابة الكنوبية فحسب ، بل يعمل أيضا كجزء من إجراء التعقيم لدينا. نحن نقوم بهذا الإجراء في الواقع ليس في الغطاء ، إنه خارج الغطاء ، لذا فإن الأجنة ، بمجرد إزالة الكلور ، نقوم بغسلها في طبق بتري.

هم في الواقع ، عندما يختفي الكوريان ، يكون الغشاء الخبيث لزجا تماما وسوف يلتصق بشكل جيد بطبق بتري. يمكنك بعد ذلك صب الماء المقطر فوقها وإزالة الماء المقطر مرتين أو ثلاث مرات وفي الواقع فقط تخلص من الماء وستلتصق الأجنة بطبق بتري. لا تستخدم طبق بلاستيكي لزراعة الأنسجة.

إنهم لا يلتزمون بذلك. نبدأ الجزء المعقم من الإجراء بأخذ أطباق بتري للأجنة وأخذها إلى غطاء تدفق رقائقي. هذه هي زلات غطاء بيلكو.

إنها غير مطلية ، لكنها كانت أوتوكلاف ولم يتم غسلها. نجد أنها لا تعمل بشكل جيد. عندما يتم غسلها ، نخرج أربع زلات غطاء عادة ونضعها في طبق بتري واحد.

لذلك سنقوم بعمل أربع مزارع أجنة في كل طبق بتري. حسنا ، هذا طبق بتري جاهز بشكل أساسي لنا لبدء الزراعة ، وعادة ما أقوم بعمل 12 ثقافة ، من 12 إلى 16 ثقافة في المرة الواحدة. حسنًا؟ وسائل الإعلام الثقافية التي نستخدمها هي وسيلة محددة بسيطة نسبيا.

إنها قاعدة A-D-M-E-M ، ونصنع هذا الوسط السائل مرة كل أسبوعين حتى يظل جيدا لمدة أسبوعين في الثلاجة. وقد تم تعقيم هذا. لقد تم وضعه من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرون ، ثم أضفنا خمسة مكملات غذائية إلى الوسائط.

يتم تحضيرها مرة كل شهرين ثم يتم تجميدها في حصص تضاف إلى 10 مل من الوسط السائل. لذلك نقوم فقط بإزالة المحتويات. أخيرا ، إذن هذا فقط ، نحن فقط نقلب هذه الوسائط برفق لخلطها ونحن على استعداد للذهاب. حسنًا.

كل شيء مجهز. لدي طبق ثقافة جاهز ، أو طبق بتري الخاص بي الذي يحتوي على أربع زلات غطاء جاهزة للذهاب. والآن سآخذ طبقي مع الأجنة وسأفعل ذلك ، إنهم الآن يجلسون في الماء المقطر.

سأقوم بإزالة الماء المقطر بمجرد التخلص منه. هذه هي الطريقة التي أفعل بها ذلك مباشرة في سلة المهملات. والآن سأسكب حوالي مطحنتين من الوسائط على هذه الأجنة ، والآن هم جاهزون لي لإدخال الإبرة الزجاجية في الأجنة الفردية وإزالة المحتويات.

يجب أن يكون لديك وسائل الإعلام في الخارج. من الواضح أنه إذا كان هناك ماء ، فستكون مصابا بصدمة تناضحية. الآن للاستعداد لإعداد الثقافات فعليا قبل إزالة محتويات الجنين مباشرة ، أضع بالفعل قطرة خمسة ميكرولتر على زلات الغطاء.

إذا تركتها لفترة طويلة ، فإن الرقم الهيدروجيني للوسائط يتغير. حسنا ، سأضع الآن قطرة خمسة ميكرولتر في وسط كل من زلات الغطاء الأربعة. من المهم حقا أن تقول هذه القطرات البقاء سليمة قدر الإمكان.

إذا انتشرت الوسائط في جميع أنحاء زلة الغطاء ، طلاء الخلايا في بعضها ، ويصعب وجود طبقة رقيقة جدا من السوائل. تريدهم أن يصفحوا الخلايا في قطرة مستديرة لطيفة من السوائل. كما ترون هناك ، لدينا أربع قطرات مستديرة لطيفة من السوائل جاهزة للذهاب.

والآن سآخذ إحدى الماصات التي سحبتها ثم أربطها بأنبوب ماصة الفم هذا. يمكنك استخدام أي أنبوب تريده ، ولكن الشيء الجيد في هذا الأنبوب ، أنه يأتي في الواقع مع أنبوب VWR معاير 100 ماصة ميكرولتر. وفي هذه المنتجات، هناك حشية مطاطية صغيرة هنا.

يمكنني إدخال ماصة الفم ، أعني الماصة الزجاجية في هذا الطرف من الماصة. وبعد ذلك عندما أمتص محتويات الجنين ، لن أصعد أكثر من ذلك ، المنطقة التي يبدأ فيها في الضيق. إذن هناك هذه المنطقة الضخمة التي تفصلني باستخدام شفط الفأر هنا والمكان الذي توجد فيه الخلايا.

لذلك لا يوجد ، لا توجد مشكلة في التلوث. إذا قمت بامتصاص المحتويات عن طريق الخطأ في هذه المنطقة ، فستواجه مشاكل كبيرة في التلوث. في أغطية التدفق الصفحي الخاصة بنا ، لدينا مجاهر تشريحية على أساس منظاري.

هذا يسمح للضوء بالدخول من أسفل الجنين، وهذا يسمح لنا برؤية الأخدود الرأسي والأمعاء الوسطى والخيال الذي ستراه عندما ننظر إلى الأجنة الفعلية. وهذه هي الطريقة التي نختار بها مرحلة الجنين المهمة للاستزراع لإزالة محتويات الجنين. نستخدم الماصات الزجاجية، ونسحب مجتذب قطب كهربائي صغير عادي نستخدمه لصنع ماصات تسجيل التصحيح.

نحن لا نهتم حقا بماهية الإعدادات. نسحب ماصات دقيقة جدا لأننا سنكسر الماصة في الطبق المجاور للجنين بالحجم الذي نريده حقا. ثم نأخذ هذه الماصات الزجاجية، وندخلها من خلال الغشاء الشرير للجنين، ونستخدم أنبوب شفط الفم المتصل بالجزء الخلفي من الجزء الخلفي من الماصة.

ثم نستخرج محتويات الجنين بأكمله. ثم نقوم بتحريكها ، ونخرج الماصة وننتقل إلى طبق آخر به زلة غطاء مع قطرة من الوسائط بسعة خمسة ميكرولتر. ونقوم بطرد محتويات الجنين في تلك القطرة التي يبلغ حجمها خمسة ميكرولتر.

قمنا بسحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفريق الخلايا ، ثم تركنا هذا الغطاء ينزلق في الطبق لمدة 10 دقائق تقريبا قبل أن نغمر الطبق بطحنتين من الوسائط. يتم وضع أطباق الخلايا بعد طلائها في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. هذا مهم جدا لأن الوسائط التي نستخدمها عبارة عن وسائط مخزنة من البيكربونات.

لدينا بعض HEPs هناك ، لكن هذا لا يكفي للتخزين المؤقت في بيئة الهواء. ولذا عليك استخدام حاضنة 5٪ CO2. ومع ذلك ، يجب أن تكون عند درجة حرارة منخفضة نسبيا حوالي 22 إلى 23 درجة مثالية.

لذلك نأخذ حاضنة ثاني أكسيد الكربون القياسية التي يمكن استخدامها من مزارع الثدييات وتسخينها إلى 37 درجة. ما نفعله هو إطفاء السخان ، ووضعه في مختبرنا ، ويمكننا وضع الثلج في قاع الحاضنة ، وهذا يحافظ على درجة الحرارة حوالي 21 إلى 25 درجة. التقنية الأخرى التي نستخدمها هي أننا نأخذ، مرة أخرى، واحدة من حاضنات ثاني أكسيد الكربون القياسية هذه ونضع الحاضنة في غرفة باردة.

ثم يمكنك في الواقع تسخين الحاضنة بشكل فعال إلى 23 درجة إذا كانت درجة الحرارة المحيطة هي درجة حرارة الغرفة الباردة. وهذه هي الطريقتان اللتان نستخدمهما للحصول على ختم قياسي ، ختم الثدييات إلى الحاضنة للسماح لأنفسنا بالبقاء على قيد الحياة. حسنا ، هذه ثقافة تم طلاؤها قبل ساعة واحدة بنفس التكبير الذي رأيناه مباشرة بعد الطلاء بعد ساعة واحدة من الطلاء.

هنا نرى الخلايا العصبية التي تمايزت لمدة يومين تقريبا. في الثقافة ، انقسم الخلايا العصبية مرة واحدة أو أكثر ثم أدى إلى ظهور الخلايا العصبية ، والتي تمتد العمليات التي تشكل شبكات عصبية متداخلة واسعة النطاق. هنا لدينا جسمان خلويتان وجها لوجه.

الجزء العلوي هو تمديد العملية عند موضع الساعة 11 ، والجزء السفلي يمتد العملية عند موضع الساعة الخامسة. هذه هي امتداداتهم الرئيسية. وبعد ذلك يمكنك أن ترى أنها تشكل فروعا أدق.

هذه تلتصق بشكل وثيق بالركيزة الزجاجية ، وهناك عمليات يمكنك رؤيتها تأتي من خلايا أخرى أيضا تتداخل مع هذه الخلايا. وهذه مواقع اتصال متشابك محتملة. سنقوم بتصحيح إحدى هذه الخلايا ، وبشكل عام ، مع هذا المستوى من تفصيل العملية ، سيكون لديهم تيارات متشابكة وظيفية متشابكة.

الآن تنمو خلايانا في الثقافة بعد 12 ساعة من الطلاء. سيكون لديهم عمليات لطيفة جدا. فسيولوجيتنا القياسية ، نبدأ في القيام بحوالي واحد إلى اثنين بعد الزراعة.

ويمكنك أن ترى أنهم في الواقع يستمرون في نمو العمليات خلال الأيام الأربعة أو الخمسة القادمة. وقد سجلنا من الخلايا لمدة تصل إلى أسبوعين في المزرعة ، لكن معظم تسجيلاتنا تتراوح بين يومين وستة أيام في الثقافة مع هذه الثقافات ثم أعددنا للتو من أجنة ذبابة الفاكهة في منتصف المرحلة المعدية ، لدينا شبكات من الخلايا العصبية التي تتواصل في الثقافة. نحن قادرون على النظر في خصائص إطلاق هذه الخلايا.

لديهم خصائص إطلاق متنوعة. لديهم ، يطلقون النار بشكل متكرر ، وبعض الخلايا تطلق النار بشكل متكرر ، وخلايا أخرى تطلق النار عند الولادة ، وهذه الخلايا هي في المقام الأول اتروبين أو GABAergic. ويمكننا أن ننظر إلى التيارات المشبكية التي تتوسط فيها هذه المصادر ، بواسطة مستقبلات النيكوتين و Aach و H و GABA.