أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل تنشيط قناة BK تحت الجهد المتحكم فيه ، مع التحكم أيضا في المحلول داخل الخلايا. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير أولا عن قنوات BK في Xenopus Cytes عن طريق حقنها بقناة BK mRNA. الخطوة الثانية من الإجراء هي إعداد نظام التروية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تشكيل ختم جيجا بين غشاء البويضة وماصة التصحيح. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي استئصال رقعة الغشاء. في النهاية ، تظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام تقنية مشبك التصحيح إلى جانب نظام الوفرة أن قنوات BK يتم تنشيطها عن طريق التغيرات في الجهد وتركيز الكالسيوم.

مرحبا ، أنا جين تشو يونغ من مختبر الدكتور جيمي زوس في جامعة واشنطن. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، بما في ذلك الأسئلة المتعلقة بالآلية الجزيئية لتنشيط القناة الأيونية. لذلك دعونا نبدأ.

تبدأ الخطوة الأولى في الإجراء قبل يومين من تثبيت الرقعة وتستخدم قناة BK mRNA التي تم نسخها في المختبر. بعد حصاد Xenopus Lavu Cytes المرحلة الخامسة إلى السادسة ، قم بحقن 0.05 إلى 50 نانوجرام من mRNA لقناة BK في السيل. باستخدام نانو حقن اثنين من حاقن نانولتر تلقائي.

كرر الحقن على عشرات البويضات لكل mRNA بعد الحقن. اشطف البويضات مرتين باستخدام محلول ND 96. ثم ضع البويضات في صفيحة استزراع واحتضانها عند 18 درجة مئوية لمدة يومين أو أكثر لإتاحة الوقت للبويضات للتعبير عن قناة BK.

بعد يومين إلى خمسة أيام من الحضانة ، يجب أن تعبر البويضات عن قنوات BK وكذلك هي بالفعل لقط التصحيح. قبل التعامل مع البويضات ، قم بإعداد كل شيء آخر ستحتاجه لتثبيت الرقعة ، بدءا من نظام التروية. النظام الموضح هنا هو رابط الصمام الآلي.

16 نظام الوفرة النيتروجين المضغوط يدفع محاليل الوفرة من خزانات المحلول من خلال أنابيب الوفرة إلى قلم الرصاص والطرف. يتم التحكم في تدفق كل تيار من محلول الوفرة بواسطة صمام خزان واحد وصمام إلكتروني واحد. في هذا البروتوكول ، لا يتم ضغط أحد الخزانات ويعمل كمجمع للنفايات ، بالإضافة إلى آلية إطلاق الضغط.

يمكن تحضير محاليل التروية بتركيزات مختلفة من الكالسيوم أو المغنيسيوم قبل التجارب. أضف محاليل التروية إلى الخزانات وقم بتسمية كل منها للإشارة إلى تركيز الكالسيوم أو المغنيسيوم. لإعداد نظام الوفرة أولا ، قم بتوصيل الأنابيب بقلم الرصاص الوفرة.

ثم قم بتشغيل وحدة التحكم الإلكترونية في الصمام وافتح الصمامات الإلكترونية للتأكد من خلو الأنابيب وقلم الرصاص الغزير من السدادات وفقاعات الهواء. ادفع الماء منزوع الأيونات عبر كل أنبوب باستخدام حقنة مملوءة بالماء منزوع الأيونات. في هذه المرحلة ، قم بتوصيل الأنابيب بخزانات المحلول وافتح صمام أسطوانة الغاز لتطبيق الضغط على النيتروجين.

افتح صمام خزان واحد لملء الأنبوب بأحد محاليل الخزان. إذا لزم الأمر ، انقر فوق صمام الخزان لإزالة الفقاعات الموجودة في المحلول. أغلق صمام الخزان بعد ملء الأنبوب بالمحلول ، واملأ طرف التروية بالماء وقم بلفه بقلم التروية.

احرص على عدم حبس أي فقاعات. عند توصيل الطرف ، قم بتثبيت قلم التروية على مرحلة الحمام باستخدام طين النمذجة ، وتأكد من وجود طرف الوفرة في مساحة الحمام. تم الآن إعداد نظام الوفرة.

في هذه المرحلة ، أضف الماء منزوع الأيونات إلى الحمام. تأكد من غمر طرف الوفرة في الماء. اختبر أن كل محلول تروية يخرج من طرف التروية بشكل صحيح.

أغلق الصمام الإلكتروني المتصل بأنبوب مجمع النفايات وافتح الصمام لأحد محاليل الوفرة. تحت المجهر ، لاحظ نفاثة سائل الوفرة الخارجة من طرف التروية. أغلق الصمام الخاص بمحلول الوفرة وافتح الصمام لمجمع النفايات.

يجب أن تختفي النفاثة الوفيرة تقريبا. كرر نفس الاختبار لكل من محاليل التروية. عندما تتحقق من أن جميع محاليل التروية تتدفق بشكل صحيح ، استبدل الماء منزوع الأيونات في الحمام بمحلول الاستحمام المطلوب.

حان الوقت الآن لإعداد جهاز التسجيل. يجب عليك إعادة طلاء قطب التسجيل الفضي بكلوريد الفضة قبل كل جلسة تثبيت رقعة. أولا ، قم بإزالة سلك القطب الكهربائي من حامل الماصة واغمر طرف نصف سلك القطب الكهربائي في قارورة تحتوي على مبيض طازج لمدة 15 دقيقة على الأقل.

هذا يترسب طبقة من كلوريد الفضة على السلك. اشطف سلك القطب بالماء منزوع الأيونات وجففه. ثم قم بتركيب قطب كلوريد الفضة مرة أخرى في حامل الماصة.

الآن قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر الخاص بك. قم بتوصيل مفتاح الجهاز بمنفذ الطابعة بالكمبيوتر. يجب توصيل مفتاح الجهاز حتى تتمكن من استخدام برنامج الحصول على البيانات ، وهو نبض HEA.

قم بتشغيل مكبر الصوت وابدأ تشغيل برنامج الحصول على البيانات. نبض HEA. قم بتحميل ملف البروتوكول واضبط إعدادات التكوين مثل مقياس التحفيز.

الهدف من ضبط إعدادات التكوين هو التأكد من أن إمكانات الاختبار تساوي تماما إمكانات الأمر. الآن نحن مستعدون لتحضير البويضات. استرجع البويضات من الحاضنة.

اغمر البويضة في محلول تجريد لمدة خمس إلى 10 دقائق. يفصل محلول التجريد الغشاء الفيدي عن غشاء البلازما ، مما يجعل من الممكن تجريد غشاء. بعد خمس إلى 10 دقائق ، قم بتجريد غشاء الفيتل برفق من البويضة.

باستخدام ملقطين. موقع divi OC هش للغاية وبالتالي يجب نقله بأقل قدر ممكن. مع الحرص على منع تعريض بويضة ديفي للهواء أو الفقاعات ، استخدم ماصة زجاجية مملوءة بمحلول كاف لنقل البويضة إلى الحمام.

القنوات الموجودة على غشاء البويضة مكشوفة الآن وجاهزة لماصة التصحيح. اسحب ماصة رقعة عن طريق إدخال أنبوب زجاجي شعري في مجتذب الماصة الصغيرة. راقب الماصات تحت المجهر لتحديد شكل الطرف وقطر الفتحة.

يجب أن يكون قطر الفتحة من اثنين إلى أربعة ميكرومترات لتقليل التيار السعوي أثناء التسجيل ، ولضمان طرف أملس ، قم بتغطية الطرف بالشمع ثم النار. تلميعها تحت المجهر. املأ طرف الماصة عن طريق وضع طرف الماصة داخل محلول الماصة وسحب المكبس.

هذا يبلل طرف الماصة. بعد ذلك، املأ الماصة بمحلول الماصة بمقدار الثلث باستخدام حقنة. ثم ضع الماصة في حامل الماصة مع وجود قطب كلوريد الفضة بالداخل.

تأكد من ملامسة القطب الكهربائي السلكي لمحلول الماصة. الخطوة التالية هي استئصال رقعة من الداخل إلى الخارج من البويضة المحضرة. أولا ، ابحث عن الحافة الواضحة للبويضة تحت المجهر.

باستخدام المعالج، حرك ماصة التصحيح بالقرب من البويضة، وتأكد من غمرها. في محلول الحمام ، سجل المقاومة المتسلسلة للماصة. تتراوح المقاومة المتسلسلة المثالية لماصة التصحيح بين واحد إلى 1.5 مللي أوم عند ملؤها بمحلول الماصة وغمرها في محلول الحمام.

الآن ادفع الماصة ببطء ضد البويضة حتى تتضاعف مقاومتها تقريبا. احصل على ختم جيجا أوم عن طريق تطبيق شفط لطيف عن طريق الفم من خلال أنبوب شفط متصل بحامل الماصة. بعد التأكد من تشكيل ختم جيجا ، قم بتثبيت الرقعة عن طريق الاحتفاظ بها عند 30 مللي فولت تحت الصفر لبضع دقائق.

للحصول على رقعة من الداخل إلى الخارج، قم باستئصال الرقعة عن طريق دفع الماصة بسرعة إلى موقع OO ثم سحبها برفق للخارج. التصحيح من الداخل إلى الخارج جاهز الآن لقط التصحيح. حرك الماصة التي تحمل الرقعة من الداخل إلى الخارج إلى حوالي 100 ميكرون بعيدا عن فتحة طرف التروية.

أغلق الصمام الإلكتروني لجمع النفايات وافتح صمام الخزان لمحلول الوفرة المطلوب. ابدأ في تسجيل التيارات عبر التصحيح. قم بتغيير حلول الجهد والوفرة حسب الرغبة.

عند الانتهاء من التسجيل ، قم بتنظيف قلم رصاص وطرف الأنابيب الوفيرة عن طريق دفع الماء منزوع الأيونات لتجنب الانسدادات. تظهر تسجيلات مشبك التصحيح التي تم الحصول عليها هنا أن قنوات BK من النوع البري على رقعة غشاء البويضة تستجيب لكل من الجهد والكالسيوم. يوضح هذا الشكل تسجيل رقعة مع صفر اسمي من الكالسيوم في محلول التروية.

تشير الموجات المربعة فوق آثار التيار إلى الجهد المطبق على الرقعة. تم تطبيق أربعة جهد تتراوح من 50 مللي فولت إلى 200 مللي فولت بزيادات قدرها 50 مللي فولت. تم الحصول على الحد الأقصى للتيار ، ما يقرب من اثنين من أمبير النانو بجهد أقصى يبلغ 200 مللي فولت.

تشير هذه الزيادة في سعة التيار مع زيادة الجهد إلى أن الاحتمال المفتوح لقنوات BK يزداد مع الجهد. يوضح هذا الشكل استجابة التصحيح من الداخل إلى الخارج للجهد الكهربائي المختلف. عندما كان هناك كالسيوم ميكرومولار واحد في محلول التروية ، تم تطبيق خطوات الجهد.

كما في الشكل اللاحق ، الاستجابة لخطوة جهد 200 مللي فولت ، زادت الاستجابة القصوى إلى ما يقرب من ثلاثة نانو أمبير عندما كان هناك كالسيوم في بيرفو ثمانية مقارنة باثنين من النانو أمبير بدون الكالسيوم. يشير هذا إلى أن الاحتمال المفتوح لقنوات BK زاد في وجود الكالسيوم. باختصار ، أظهر إجراء تثبيت التصحيح هذا أن قنوات BK كانت تعتمد على الجهد والكالسيوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل تنشيط القناة الحديدية باستخدام تقنية مشبك التصحيح إلى جانب نظام التزود بالوقود الاحترافي. الآن. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.