أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل تنشيط قناة BK تحت جهد كهربائي مضبوط، مع التحكم في المحلول داخل الخلوي في الوقت ذاته. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التعبير عن قنوات BK في خلايا Xenopus عن طريق حقنها بـ mRNA الخاص بقناة BK. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تحضير نظام التروية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تكوين ختم جيجا (giga seal) بين غشاء البويضة وماصة الرقعة (patch pipette). والخطوة النهائية من الإجراء هي استئصال رقعة الغشاء. وفي النهاية، تُظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) المقترنة بنظام تدفق مستمر أن قنوات BK يتم تنشيطها بواسطة التغيرات في الجهد وتركيز الكالسيوم.

مرحباً، أنا جين تشو يونغ من مختبر الدكتورة جيمي زوس في جامعة واشنطن. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلوم العصبية، بما في ذلك الأسئلة المتعلقة بالآلية الجزيئية لتنشيط القنوات الأيونية. لذا، دعونا نبدأ.

تبدأ الخطوة الأولى في الإجراء قبل يومين من عملية تثبيت الرقعة (patch clamping)، وتستخدم mRNA لقناة BK الذي تم نسخه في المختبر (in vitro). بعد حصاد خلايا Xenopus Lavu Cytes في المرحلة الخامسة إلى السادسة، يتم حقن من 0.05 إلى 50 نانوجرام من mRNA لقناة BK في خلية واحدة. يتم ذلك باستخدام جهاز حقن nano inject two auto nanoliter injector.

كرر عملية الحقن على اثنتي عشرة بويضة لكل mRNA بعد الحقن. اغسل البويضات مرتين باستخدام محلول ND 96. ثم ضع البويضات في طبق زراعة واحضنها عند 18 درجة مئوية لمدة يومين أو أكثر لإتاحة الوقت للبويضات للتعبير عن قناة BK.

بعد فترة حضانة تتراوح من يومين إلى خمسة أيام، يُفترض أن تعبر الخلايا البيضية عن قنوات BK، وبالتالي تصبح جاهزة لعملية تثبيت الرقعة (patch clamping). قبل التعامل مع الخلايا البيضية، قم بتجهيز كافة الأدوات الأخرى اللازمة لعملية تثبيت الرقعة، بدءاً بنظام الإرواء. النظام الموضح هنا هو automate valve link.

يقوم نظام التدفق (profusion system) بضخ النيتروجين المضغوط لدفع محاليل التدفق من خزانات المحاليل عبر أنابيب التدفق وصولاً إلى قلم ورأس التدفق. ويتم التحكم في تدفق كل تيار من محاليل التدفق بواسطة صمام خزان واحد وصمام إلكتروني واحد. في هذا البروتوكول، لا يتم ضغط أحد الخزانات حيث يعمل كجامع للنفايات، بالإضافة إلى كونه آلية لتنفيس الضغط.

يمكن تحضير محاليل التروية بتركيزات مختلفة من الكالسيوم أو المغنيسيوم قبل البدء بالتجارب. أضف محاليل التروية إلى الخزانات وضع ملصقاً على كل منها لتوضيح تركيز الكالسيوم أو المغنيسيوم. ولإعداد نظام التروية، قم أولاً بتوصيل الأنابيب بقلم التروية.

بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة التحكم في الصمام الإلكتروني وافتح الصمامات الإلكترونية للتأكد من خلو الأنابيب وقلم التدفق من الانسدادات وفقاعات الهواء. ادفع الماء منزوع الأيونات عبر كل أنبوب باستخدام حقنة مملوءة بالماء منزوع الأيونات. عند هذه النقطة، قم بتوصيل الأنابيب بخزانات المحلول وافتح صمام أسطوانة الغاز لتطبيق ضغط النيتروجين.

افتح صمام خزان واحد لملء الأنبوب بأحد محاليل الخزان. عند الحاجة، انقر على صمام الخزان لإزالة الفقاعات من المحلول. أغلق صمام الخزان بعد ملء الأنبوب بالمحلول، ثم املأ طرف التروية بالماء وقم بتثبيته لولبيًا في قلم التروية.

كن حذرًا لتجنب حبس أي فقاعات. عند توصيل الطرف، قم بتثبيت قلم التروية على منصة الحوض باستخدام صلصال التشكيل، وتأكد من وجود طرف التروية داخل مساحة الحوض. وبذلك يكون نظام التروية قد تم إعداده.

في هذه المرحلة، أضف الماء منزوع الأيونات إلى الحمام. تأكد من غمر طرف التروية في الماء. اختبر تدفق كل محلول تروية من طرف التروية للتأكد من خروجه بشكل صحيح.

أغلق الصمام الإلكتروني المتصل بأنبوب مجمع النفايات وافتح صمام أحد محاليل التروية. تحت المجهر، راقب نفث سائل التروية الخارج من طرف التروية. أغلق صمام محلول التروية هذا وافتح صمام مجمع النفايات.

يجب أن يختفي نفاث التروية تقريبًا. كرر الاختبار نفسه لكل محلول من محاليل التروية. بمجرد التحقق من أن جميع محاليل التروية تتدفق بشكل صحيح، استبدل الماء منزوع الأيونات في الحمام بمحلول الحمام المطلوب.

حان الوقت الآن لتجهيز جهاز التسجيل. يجب عليك إعادة طلاء قطب التسجيل الفضي بكلوريد الفضة قبل كل جلسة تثبيت الرقعة (patch clamping). أولاً، قم بإزالة سلك القطب من حامل الماصة واغمر النصف الطرفي من سلك القطب في قارورة تحتوي على مبيض طازج لمدة 15 دقيقة على الأقل.

يؤدي ذلك إلى ترسيب طبقة من كلوريد الفضة على السلك. اشطف سلك القطب الكهربائي بالماء منزوع الأيونات ثم جففه بالتربيت. بعد ذلك، أعد تركيب قطب الفضة/كلوريد الفضة في حامل الماصة.

قم الآن بتشغيل جهاز الكمبيوتر الخاص بك. قم بتوصيل مفتاح الأجهزة بمنفذ الطابعة في جهاز الكمبيوتر. يجب أن يكون مفتاح الأجهزة متصلاً لتتمكن من استخدام برنامج الحصول على البيانات، وهو HEA pulse.

قم بتشغيل المضخم وبدء تشغيل برنامج الحصول على البيانات. نبضة HEA. قم بتحميل ملف البروتوكول وضبط إعدادات التكوين مثل مقياس التحفيز.

الهدف من ضبط إعدادات التكوين هو ضمان أن يكون جهد الاختبار مساوياً تماماً لجهد الأمر. الآن نحن مستعدون لتحضير البويضات. استخرج البويضات من الحاضنة.

اغمر البويضة في محلول نزع الغشاء لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق. يعمل محلول نزع الغشاء على فصل الغشاء المحي فيتيلين عن الغشاء البلازمي، مما يجعل من الممكن نزع الغشاء المحي. بعد مرور 5 إلى 10 دقائق، انزع الغشاء المحي برفق من البويضة.

باستخدام ملقطين. يكون موقع البويضة في حالة هشاشة شديدة، لذا يجب تحريكها بأقل قدر ممكن. مع الحرص على منع تعرض البويضة للهواء أو الفقاعات، استخدم ماصة زجاجية مملوءة بمحلول كافٍ لنقل البويضة إلى الحمام.

أصبحت القنوات الموجودة على غشاء الخلية البيضية الآن مكشوفة وجاهزة لسحب الماصة الرقعية. اسحب ماصة رقعية عن طريق إدخال أنبوب شعري زجاجي في جهاز سحب الماصات الدقيقة. افحص الماصات تحت المجهر لتحديد شكل الطرف وقطر الفتحة.

يجب أن يتراوح قطر الفتحة بين 2 و 4 ميكرومتر لتقليل التيار السعوي أثناء التسجيل، ولضمان الحصول على طرف أملس، قم بتغطية الطرف بالشمع ثم تعريضه للنار. قم بتلميعه تحت المجهر. املأ طرف الماصة عن طريق وضع طرفها داخل محلول الماصة ثم سحب المكبس.

يؤدي ذلك إلى ترطيب طرف الماصة. بعد ذلك، املأ ثلث الماصة بمحلول الماصة باستخدام حقنة. ثم ضع الماصة في حامل الماصة مع وجود قطب الفضة/كلوريد الفضة بالداخل.

تأكد من ملامسة القطب الكهربائي السلكي لمحلول الماصة. الخطوة التالية هي استئصال رقعة مقلوبة (inside out patch) من البويضة المُحضرة. أولاً، حدد الحافة الشفافة للبويضة تحت المجهر.

باستخدام الملاعب، حرك ماصة الرقعة (patch pipette) لتصبح قريبة من البويضة، مع التأكد من أنها مغمورة. قم بتسجيل المقاومة التسلسلية للماصة في محلول الحمام. تكون المقاومة التسلسلية المثالية لماصة الرقعة بين 1 إلى 1.5 milli ohms عندما تكون مملوءة بمحلول الماصة ومغمورة في محلول الحمام.

الآن، ادفع الماصة ببطء مقابل البويضة حتى تتضاعف مقاومتها تقريبًا. قم بتكوين سدادة جيجا أوم (giga ohm seal) عن طريق تطبيق شفط خفيف بالفم من خلال أنبوب شفط متصل بحامل الماصة. بعد التأكد من تكوّن سدادة الجيجا، قم بتثبيت الرقعة عن طريق تثبيتها عند -30 millivolts لبضع دقائق.

للحصول على رقعة مقلوبة (inside out patch)، استأصل الرقعة عن طريق دفع الماصة بسرعة إلى داخل موقع الرقعة المقلوبة ثم سحبها برفق. أصبحت الرقعة المقلوبة الآن جاهزة لعملية تثبيت الرقعة (patch clamping). حرك الماصة التي تحمل الرقعة المقلوبة لتكون على بعد حوالي 100 microns من فتحة طرف التروية.

أغلق الصمام الإلكتروني الخاص بجمع النفايات وافتح صمام الخزان لمحلول الإرواء المطلوب. ابدأ بتسجيل التيارات عبر الرقعة. قم بتغيير الجهد ومحاليل الإرواء حسب الرغبة.

عند الانتهاء من التسجيل، قم بتنظيف أنابيب التروية والطرف عن طريق دفع الماء منزوع الأيونات من خلالها لتجنب الانسدادات. وتُظهر تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) التي تم الحصول عليها هنا أن قنوات BK من النوع البري على رقعة غشاء الخلية البيضية تستجيب لكل من الجهد والكالسيوم. يوضح هذا الشكل تسجيلاً للرقعة بتركيز كالسيوم صفري اسمي في محلول التروية.

تشير الموجات المربعة الموجودة فوق آثار التيار إلى الجهد المطبق على الرقعة. تم تطبيق أربعة جهود تتراوح من 50 millivolts إلى 200 millivolts بزيادات قدرها 50 millivolts. تم الحصول على أقصى تيار، والذي يبلغ حوالي 2 nano amps، عند أقصى جهد وهو 200 millivolts.

أشارت هذه الزيادة في سعة التيار مع زيادة الجهد إلى أن احتمالية الفتح لقنوات BK تزداد مع الجهد. يوضح هذا الشكل استجابة الرقعة من الداخل إلى الخارج لجهود كهربائية مختلفة. حيث تم تطبيق خطوات جهدية عند وجود تركيز واحد ميكرومولار من الكالسيوم في محلول التروية.

كما في الشكل السابق، فإن الاستجابة لخطوة الجهد البالغة 200 millivolt، زادت الاستجابة العلوية إلى حوالي three nano amps عند وجود الكالسيوم في Perfu eight مقارنة بـ two nano amps في غياب الكالسيوم. يشير هذا إلى أن احتمالية فتح قنوات BK قد زادت في وجود الكالسيوم. وباختصار، أظهر إجراء تثبيت الرقعة (patch clamping) هذا أن قنوات BK تعتمد على الجهد والكالسيوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل تنشيط قناة الحديد باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) المقترنة بنظام تغذية احترافي. الآن، نشكركم على المشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.