قياس الوصلات العصبية : حدث الفحص كيمياء سيتولوجية مناعية القائم على القياس الكمي للعدد سنبس

يُعد فهم الإشارات الجزيئية التي توجه المراحل المبكرة من تكوين التشابكات العصبية أحد أهم الأهداف في علم الأعصاب. وبناءً على ذلك، أصبح من الضروري تطوير مناهج موضوعية لقياس التغيرات في الاتصال التشابكي. ولتقدير عدد التشابكات العصبية في مجموعة متنوعة من التحضيرات التجريبية، يتم صبغ الخلايا العصبية المستنبتة أو تحضيرات مقاطع أنسجة الدماغ بالتجميد باستخدام علامات انتقائية قبل التشابكية وبعد التشابكية لتحديد نقاط الاتصال التشابكي بين الخلايا العصبية.

يتم بعد ذلك تصوير الخلايا أو الأنسجة باستخدام مجهر فلوري، مع الحصول على صور بدقة ثمانية بت لكل من القنوات المقابلة للمؤشرين الكيميائيين النسيجيين المناعيين. وتُحلل الصور باستخدام برنامج Image J 1.29 مع أداة puncta analyzer. ولتحديد مدى التوضع المشترك بين مؤشرات ما قبل التشابك وما بعد التشابك، يمكن استخدام نقاط التوضع المشترك لتحديد عدد المشابك العصبية الموجودة في العينة.

تتمثل الميزة الرئيسية للتقنية الموصوفة هنا مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر الإلكتروني، في أن مقايسة المشابك العصبية تسمح بتحليل وتقدير كمي لعدد المشابك العصبية بإنتاجية أعلى بكثير. وتمتد الآثار الرئيسية لهذه التقنية نحو تشخيص وعلاج الاضطرابات السريرية مثل مرض الزهايمر، أو الصرع، أو التوحد، والتي تم الربط فيها بين التشوهات والاتصال المشبكي كأساس للمرض الكامن. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد أشكال التدخل التي يمكن أن تقلل أو تحسن القصور الذي نلاحظه في قدرة العصبونات المصابة على تكوين مشابك عصبية مع بعضها البعض.

على الرغم من أن هذه الطريقة مفيدة لدراسة تطور الدماغ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات نموذجية أخرى أو أنظمة عضوية تهمك دراستها أو قياس عدد الاتصالات بين الخلايا فيها، شريطة توفر القدرة على وسم كل وجه متقابل من كل موقع اتصال بشكل انتقائي. قم بتحضير المزارع العصبية عن طريق زراعة خلايا العقدة الشبكية للجرذ المنقاة من شبكية الجرذ، والتي تم جمعها من حيوانات في اليوم الخامس إلى السابع بعد الولادة (P5-P7)، على شرائح غطاء زجاجية مطلية بمادة poly-D-lysine. في طبق يحتوي على 24 بئراً، تُترك الخلايا لتنمو عند 37 °C لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام قبل عملية عفن الخلية (transfection).

بعد عملية عفن الخلية (transfection)، يتم تحضين الخلايا لمدة تتراوح بين سبعة إلى ثمانية أيام إضافية للسماح بتطور المشابك العصبية عندما تصل الخلايا المزروعة إلى مرحلة النضج الكافي. يتم إزالة وسط الزرع من الآبار وإضافة 500 µL من الـ paraformaldehyde بتركيز 4% المُدفأ مسبقاً إلى كل بئر، وتُثبّت الخلايا لمدة سبع دقائق. بعد عملية التثبيت في درجة حرارة الغرفة، تُغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام phosphate buffered saline.

من المهم التأكد من عدم السماح للخلايا بالجفاف أبداً داخل الآبار. وبمجرد إزالة المنظم من البئر، يجب استبداله فوراً بالمنظم التالي. قم بتحضير منظم الحجب الذي يحتوي على 50% normal goat serum و0.2% Triton X 100.

بعد إزالة PBS من كل بئر، أضف 200 µL من محلول الحجب إلى كل بئر واتركه للحجب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم أزل محلول الحجب واشطف الآبار ثلاث مرات باستخدام PBS. حضّر تخفيف الأجسام المضادة الأولية في محلول مكون من 90% من محلول الأجسام المضادة و 10% من محلول NGS، بحيث يحتوي على زوج الأجسام المضادة المختار لما قبل وما بعد التشابك العصبي.

هنا يتم استخدام جسم مضاد للأرنب ضد synapsin، وهو علامة قبل مشبكية، وجسم مضاد للفأر ضد homer، وهو علامة بعد مشبكية. يتم طرد تخفيف الجسم المضاد الأولي مركزياً لمدة خمس دقائق بالسرعة القصوى في جهاز طرد مركزي مكتبي لإزالة أي أجسام مضادة مترسبة، ثم يُضاف 200 µL من محلول الجسم المضاد الأولي إلى كل بئر. توضع اللوحة في حاوية مرطبة لمنع جفاف المحلول الأولي.

يتم التحضين طوال الليل عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية بعد التحضين مع الجسم المضاد الأولي. تُشطف كل بئر ثلاث مرات. باستخدام PBS، أضف 200 µL من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، والمخففة بنسبة 1 إلى 1000 في محلول منظم للأجسام المضادة يحتوي على 10% NGS مُحضّر.

كما في السابق، ضع الطبق في الحجرة الرطبة واتركه يحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام بعد عملية التحضين مع الأجسام المضادة الثانوية. اشطف كل بئر من ثلاث إلى أربع مرات باستخدام PBS. ضع قطرة من وسط التثبيت vector shield مع DPI على شريحة زجاجية.

ثم اقلب شريحة التغطية التي تحتوي على الخلايا فوق القطرة لتثبيتها. وأخيراً، ضع طلاء أظافر شفافاً حول حواف شريحة التغطية. احرص على تجنب دفع أو تحريك شرائح التغطية أثناء التطبيق.

بما أن هذه العملية ستؤدي إلى تشتت الخلايا، اترك الشرائح لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل في مكان جاف ومظلم. هنا، يتم التصوير باستخدام مجهر فلوري من نوع zes axio imager مجهز بمجموعات مرشحات مناسبة وعدسة شيئية غمر زيتية بقوة تكبير 63 مرة. ضع شريحة تحتوي على خلايا غير منقولة على منصة المجهر.

باستخدام مجموعة مرشحات DPI لتصوير نوى الخلايا، اختر الخلايا التي تبعد مسافة قطرين خلويين على الأقل عن أقرب جيرانها. إن استخدام DPI في هذه الخطوة سيساعد في تجنب التحيز وضمان عشوائية اختيار الخلايا. لكل خلية مختارة، احصل على صور بدقة ثمانية بت باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة، وهي في هذه الحالة GFP وTexas Red.

يجب أن تُظهر الصورة ذات الألوان الزائفة والمتراكبة علامات ما قبل التشابك وما بعد التشابك باللونين الأحمر والأخضر على التوالي. بعد ذلك، ضع شريحة تحتوي على خلايا منقولة جينياً على منصة المجهر. في هذه الحالة، تم نقل ناقل تعبير TD tomato إلى الخلايا.

استخدم هذا الواسم لاختيار الخلايا كما سبق. بالنسبة لكل خلية مختارة، احصل على ثماني صور للنقرات باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة في هذه الحالة، وهي GFP وTexas Red وSci five. يجب أن تظهر الصورة المدمجة ذات الألوان الزائفة الواسمات بعد المشبكية باللون الأحمر والأخضر والأزرق.

هنا، يتم استخدام برنامج تحليل النقاط (puncture analyzer) لتقدير كمية النقاط التشابكية المشتركة في الموقع. تم تطوير إضافة محلل النقاط (Puncta analyzer) بواسطة Barry Walk وهي متاحة عند الطلب في إصدار image J 1.26. افتح إحدى الصور التي تم جمعها.

استخدم أداة التحديد الدائري لتحديد منطقة بنصف قطر يعادل تقريبًا قطر خلية واحدة حول الـ SOR المطلوب. بعد تحديد المنطقة المستهدفة، انتقل إلى قائمة المكونات الإضافية (plugins) واختر محلل الثقوب (puncture analyzer)؛ في نافذة خيارات التحليل التي تظهر، حدد القناة الحمراء (Red Channel) والقناة الخضراء (Green Channel). ثم قم بطرح الخلفية أولاً وحدد ملف النتائج.

انقر على موافق. ثم حدد الموقع الذي تريد حفظ النتائج فيه. يمكن تصدير هذه النتائج إلى برنامج Excel لإجراء المزيد من التحليلات من خلال النافذة التي ستظهر.

بعد ذلك، تأكد من اختيار نصف قطر الكرة المتدحرجة (rolling ball radius) بقيمة 50، وإلغاء تحديد خيار الخلفية البيضاء. هذا التعديل ليس ضرورياً ولكن غالباً ما يفضله مستخدمو التطبيق. ولتسهيل عملية التصور، انقر موافق.

ستظهر نافذة جديدة بجانب قناع يتوافق مع صورة القناة الحمراء. اضبط العتبة حتى يتوافق القناع الأحمر قدر الإمكان مع أكبر عدد من الثقوب الفردية المنفصلة. انقر على "تم" دون إدخال قدر كبير من الضجيج.

اضبط الحد الأدنى لحجم النقاط على أربعة بكسل. لا تقم بتعديل أي شيء آخر. انقر موافق.

كرر الخطوة السابقة هذه المرة للقناة الخضراء. بعد تكرار ذلك مع القناة الخضراء، سيوفر الملحق البرمجي قياساً كمياً يتوافق مع النقاط في كل قناة على حدة، بالإضافة إلى النقاط المشتركة في التوضع بين القناتين. يمكن تطبيق مقايسة المشابك العصبية الموضحة هنا على المقاطع المجمدة من الدماغ وعلى أي نسيج آخر من الجهاز العصبي مثل النخاع الشوكي أو الشبكية.

بشرط توفر زوج مناسب من العلامات قبل التشابكية وبعد التشابكية. ابدأ بجمع أنسجة الدماغ من فأر تم قتله رحيمًا عن طريق استنزاف الدم والغسل بـ PBS. ضع الدماغ كاملاً في 4%paraldehyde في PBS عند درجة حرارة أربعة درجات Celsius طوال الليل حتى اليوم التالي.

اشطف الدماغ ثلاث مرات باستخدام PBS. قم بحماية الدماغ من التجمد عن طريق وضعه في محلول سكروز بتركيز 30% في PBS.

ستطفو الأنسجة في البداية مع الحفاظ عليها في درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى تغوص الأنسجة إلى القاع. عند هذه المرحلة، تكتمل عملية الحماية من التجميد. بعد ذلك، في محلول بنسبة اثنين إلى واحد من 20% sucrose إلى OCT و PBS، قم بتضمين الدماغ في الاتجاه المطلوب للتقطيع.

على سبيل المثال، المقطع السهمي أو الإكليلي. بعد ذلك، ضع سطحاً معدنياً مسطحاً فوق دلو من الثلج الجاف. ضع الدماغ المغمور فوقه ليتم تجميده، وبمجرد تجمده، انقل الدماغ إلى كيس تجميد وضعه في درجة حرارة -80 °C لمدة تصل إلى عام قبل البدء بعملية التقطيع.

باستخدام جهاز القطاع بالتجميد (cryostat)، قم بتقطيع النسيج إلى مقاطع يتراوح سمكها من 12 إلى 16 micron وثبتها على شرائح زجاجية. بعد ذلك، جفف الشرائح بوضعها في فرن عند درجة حرارة 37 °C. ثم اشطفها ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة بقايا مركب OCT.

يُستخدم قلم البارافين لإنشاء حاجز كاره للماء حول الشريحة، ثم يُضاف محلول الحجز (blocking buffer) إلى الشريحة بحيث يمنع حدوده البارافينية تدفقه خارجها. توضع الشرائح في مصل ماعز طبيعي بنسبة 20% في محلول PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لغرض الحجز، ثم تُوضع المقاطع في أجسام مضادة أولية مخففة في محلول PBS مع 0.3% triton و10% مصل ماعز طبيعي.

هنا، يُستخدم الجسم المضاد للأرنب ضد PSD 95 لوسم الحجرات ما بعد التشابكية الغلوتاماتيرجية، بينما يُستخدم الجسم المضاد لخنزير غينيا ضد v glu two لوسم النهايات قبل التشابكية الغلوتاماتيرجية. توضع الشرائح في درجة حرارة 4 °C وتُحضن لمدة تتراوح بين 36 إلى 60 ساعة. بعد انتهاء فترة التحضين، يُغسل الجسم المضاد الأولي عن طريق غمر الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 15 دقيقة في كل مرة.

بعد هذه الخطوة، تأكد من حماية الشرائح من الضوء المباشر. أضف الأجسام المضادة الثانوية المخففة بنسبة 1 إلى 200 في محلول PBS مع 0.3% triton و10% مصل ماعز طبيعي. استخدم هنا جسم مضاد من الماعز ضد خنزير غينيا (goat anti Guinea pig).

استخدم Alexa 4 8 8 وgoat anti rabbit وAlexa 5 9 4. يتم التحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.

اغسل الشرائح عن طريق غمرها أربع مرات في PBS لمدة 15 دقيقة في كل مرة تمهيداً للتثبيت. أضف قطرات صغيرة من وسط التثبيت vector shield باستخدام dappy وقم بتغطية الشرائح بأغطية زجاجية. ضع طلاء الأظافر لمنع تحرك الأغطية الزجاجية.

يجب إجراء تصوير لمقطع النسيج باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) مع ليزرات مناسبة، وباستخدام عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 63x لكل صورة مقطع، مع أخذ مقاطع بصرية متسلسلة بفاصل 0.33 micron عبر عمق إجمالي قدره five microns لإجمالي 15 مقطعاً بصرياً. يجب تصوير ثلاثة مقاطع على الأقل من كل حيوان، وإدراج ثلاثة حيوانات على الأقل من حالة تجريبية معينة. يتم إنشاء إسقاطات للشدة القصوى (maximum intensity projections) من مجموعات مكونة من ثلاثة مقاطع متتالية، مما ينتج عنه خمسة إسقاطات يمثل كل منها عمق one micron.

يتم قياس هذه الكميات باستخدام برنامج Image J كما هو موضح لخلايا RG Cs مع تعديل منطقة الاهتمام (ROI) لتحديد عدد المشابك العصبية المتكونة في غياب الخلايا النجمية. أُجري الفحص الكيميائي المناعي على خلايا rgc المفككة والمعالجة بوسط نمو أساسي، باستخدام أجسام مضادة ضد bassoon (باللون الأحمر) وhomer (باللون الأخضر) كما هو متوقع. لوحظ وجود نقاط قليلة جداً من التموضع المشترك للمشابك العصبية؛ ولتحديد تأثير الجزيئات التي تفرزها الخلايا النجمية على عدد المشابك المتكونة في المختبر، عولجت خلايا RG Cs المفككة بوسط مشروط من الخلايا النجمية للفئران كل ثلاثة أيام لمدة إجمالية بلغت 12 يوماً، ثم تلا ذلك عملية التلوين.

كانت العديد من المشابك العصبية واضحة في هذه العصبونة، ولكن يظهر soon باللون الأحمر. ويظهر Homer باللون الأخضر. عولجت خلايا RDCs المفككة والمنقولة جينياً بـ cytoplasmic Lee الذي يعبر عن TD tomato باستخدام وسط نمو أساسي فقط. لا تظهر المشابك العصبية.

تظهر طماطم TD باللون الأزرق والمشبك العصبي باللون الأحمر. ويظهر إشارة ضئيلة جداً للمؤشر ما بعد المشبكي homer الموضح باللون الأخضر. وعندما يتم معالجة الخلايا نفسها بشكل مزمن بوسط مشروط من الخلايا النجمية للفئران، تظهر العديد من المشابك العصبية.

يظهر طماطم TD باللون الأزرق، والسيناپسين باللون الأحمر، والهومر باللون الأخضر هنا. وتظهر خلية عصبية شبكية (RGC) منقاة عولجت بوسط مشروط من الخلايا النجمية وتم صبغها بعلامات ما قبل التشابك باللون الأحمر وعلامات الهومر ما بعد التشابكية باللون الأخضر؛ وتتوافق أقنعة العتبة التي تم إنشاؤها باستخدام محلل النقاط (puncture analyzer) مع القناتين الموجودتين. وعند تحديد نقاط التوضع المشترك، يقوم محلل النقاط بإخراج تمثيل رسومي لهذه النقاط.

يوفر محلل النقاط (puncta analyzer) مخرجاً عددياً يشير إلى عدد النقاط المنفصلة التي تم تحديدها في كلتا القناتين ونقاط التوضع المشترك. وتوضح البيانات الناتجة عن تحليل هذه العصبونة قدرة الجزيئات التي تفرزها الخلايا النجمية على تعزيز تكوين المشابك العصبية، والتي تظهر هنا كاختبار للمشابك العصبية، حيث تم قياس التوضع المشترك للوسم الكيميائي النسيجي المناعي قبل المشبكي وبعد المشبكي لإثبات تعزيز تكوين المشابك العصبية المحفز بالخلايا النجمية من خلال الإفراط في التعبير عن المستقبل العصبي للجزيء المولد للمشابك المهم الذي تفرزه الخلايا النجمية وهو thrombospondin. يوضح هذا الشكل متوسط عدد المشابك العصبية لكل عصبونة عولجت لفترة طويلة بوسط نمو أساسي (gm)، أو بوسط مكيف من الخلايا النجمية.

يعمل A-C-M-A-C-M على تحفيز تكوين المشابك العصبية في خلايا العقد الشبكية التي تفرط في التعبير عن مستقبل thrombo spon بشكل أقوى مقارنة بالخلايا التي تفرط في التعبير عن ناقل فارغ. ولتقدير كثافة المشابك العصبية في الأكيمة العلوية للفأر، تم تمييز الحجرات قبل المشبكية وبعد المشبكية بشكل منفصل باستخدام واسمات كيميائية نسيجية مناعية خاصة بكل حجرة. وكما هو موضح هنا، حدثت زيادة في عدد المشابك العصبية من اليوم السابع بعد الولادة إلى P 14.

يوضح هذا الزيادة في عدد المشابك العصبية في العضلة العلوية خلال هذه النافذة الزمنية التنموية. وبمجرد إتقانه، يمكن إكمال هذا البروتوكول في غضون يومين تقريبًا للمزارع العصبية المفككة، وفي غضون خمسة أيام تقريبًا للمقاطع الدماغية التي يتم جمعها من الحيوان باتباع هذا الإجراء. وتُستخدم طرق أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربائية والمجهر الإلكتروني للتحقق من أن التغيرات في عدد المشابك تعكس تغيرات في كل من المشابك الوظيفية والمشابك الطبيعية من الناحية البنيوية الدقيقة على التوالي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تطبيق الكيمياء النسيجية المناعية على تحضيراتك التجريبية لتقدير عدد المشابك العصبية. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية استخدام أجسام مضادة متخصصة في مقصورات معينة لوسم المقصورات قبل المشبكية وبعد المشبكية بشكل انتقائي. وفي هذا السياق، نُعرف المشابك العصبية بأنها نقاط التموضع المشترك بين الإشارات التي يتم الحصول عليها من كل علامة من هذه العلامات.