96 ألف لوحة حسنا Microtiter القائم على أسلوب تشكيل لمراقبة واختبار قابلية مضاد المبيضات البيض الأغشية الحيوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تكوين أغشية حيوية المبيضات البيضاء ، وفحص قابليتها للتأثر بالعوامل المضادة للفطريات. يتم تحقيق ذلك عن طريق تكوين هذه الأغشية الحيوية الفطرية أولا على آبار 96. حسنا ، تضاف ألواح ميكروتيتر ثم مضادات الفطريات إلى الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل وتحضنها لمدة 24 إلى 48 ساعة بعد هذه الحضانة.

يتم استخدام طريقة مترية للكول تقيس النشاط الأيضي للخلايا داخل الأغشية الحيوية لقياس نشاط هذه مضادات الفطريات من أجل تحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط لمضادات الفطريات ضد الأغشية الحيوية. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر القدرة على تكوين أغشية حيوية واختبار الحساسية المضادة للفطريات من خلال طريقة بسيطة وسهلة تعتمد على لوحة 96 جيدا إلى جانب قراءة مترية اللون. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة وغير مكلفة نسبيا وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة وتسمح بتكوين أغشية حيوية متعددة مكافئة.

بالإضافة إلى ذلك ، فهو متوافق مع تقنية منصة 96 جيدا المتوفرة بشكل شائع في معظم المختبرات البحثية والسريرية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج. منذ ذلك الحين ، ترتبط هذه الالتهابات في كثير من الأحيان بتكوين الأغشية الحيوية.

باستخدام تقنيات المناولة الميكروبيولوجية المناسبة ، استرجع حلقة مليئة بالخلايا من ثقافة فرعية جديدة من البيكان على صفيحة نحاسية من سكر العنب SAU Alan وتلقيحها في قارورة إرلينماير سعة 125 مليلتر تحتوي على 25 مل من مرق سكر العنب الخميرة بيبان ، ووضعت المزرعة في شاكر مداري عند 180 RRP M و 30 درجة مئوية ، وتحتضنها طوال الليل بعد الحضانة الليلية. صب مزارع الخميرة في أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 3000 RBM لمدة خمس إلى 10 دقائق. تخلص من الدوامة الطافية.

الحبيبات بقوة لإلغاء الفصل العنصري في الخلايا. ثم أضف PBS معقما لغسله قبل الطرد المركزي للثقافات مرة أخرى. كرر خطوة الغسيل هذه مرة أخرى بدلا من إعادة ثني الخلايا.

في حوالي 20 مل من RPMI 1640 ، تم تخزين متوسط إلى درجة الحموضة 7.0. باستخدام محلول من 165 ممسحة مللي مولار وتسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية من هذا التعليق ، قم بإعداد تخفيف من واحد إلى 100 باستخدام مقياس خلوي دموي قياسي ومجهر مجال ساطع. عد الخلايا.

ثم قم بإعداد تعليق نهائي للخلايا في مرة واحدة 10 من ستة لكل مليلتر في استخدام RPMI 1640 الدافئ. استخدام ماصة متعددة القنوات عند 100 ميكرولتر من معلق البحر البيكان في آبار مختارة من صفيحة ميكروتيتر معقمة ذات قاع مسطح 96 جيدا. اترك الآبار في العمود 12 فارغة لأنها ستكون بمثابة عناصر تحكم سلبية.

بعد تغطية اللوحة وإغلاقها بالشكل، احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة للسماح للأغشية الحيوية بالتكون. بعد الحضانة ، قم بالشفق برفق والتخلص من الوسائط من كل بئر. مع الحرص على عدم تعطيل الأغشية الحيوية المتكونة في الأسفل.

لغسل 200 ميكرولتر من PBS لكل بئر وتصريفها عن طريق قلب اللوحة بعناية ونشاف اللوحة على كومة من المناشف الورقية. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. في هذه المرحلة ، يمكن اكتشاف الأغشية الحيوية بالعين ويمكن تصورها باستخدام مجهر مقلوب باستخدام SEM.

يمكننا أن نقدر أن الأغشية الحيوية تتكون من خليط متشابك من الخيوط وخلايا الخميرة. بمجرد التحقق من تكوين الأغشية الحيوية ، يمكن أن يبدأ اختبار العوامل المضادة للفطريات باستخدام وسط RPMI 1640 المخزن لإعداد محاليل عمل عالية التركيز للعوامل المضادة للفطريات المراد اختبارها. التركيزات العالية النموذجية هي 1024 ميكروغرام لكل مليلتر للفلوكونازول و 16 ميكروغرام لكل مليلتر للأمفوتريسين B و CASPO الفطريات بيري.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من المحاليل المضادة للفطريات إلى الآبار في العمود الأول و 100 ميكرولتر من RPMI 1640 المخزن. متوسطة إلى آبار في الأعمدة من اثنين إلى 11. قم بإجراء سلسلة من التخفيفات المضاعفة التسلسلية عن طريق نقل 100 ميكرولتر من المحاليل المضادة للفطريات عالية التركيز من آبار العمود الأول إلى آبار العمود الثاني.

بعد سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل لخلط الماصة 100 ميكرولتر من آبار العمود الثاني إلى آبار العمود الثالث وهكذا دواليك حتى العمود 10. لا تضيف أي محلول مضاد للفطريات إلى العمود 11 ، لأنه سيكون بمثابة تحكم إيجابي وتخلص من آخر 100 ميكرولتر من آبار العمود 10. جميع الآبار ، باستثناء تلك الموجودة في العمود 12.

يجب أن يكون لها الآن حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. قم بتغطية الطبق وأغلقه بالعطر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة للسماح لمضادات الفطريات بالعمل بعد الحضانة. وبعد غسل اللوحة ثلاث مرات في PBS كما هو موضح سابقا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول XTT medion لكل بئر إلى جميع الآبار ، بما في ذلك آبار التحكم السلبية.

في العمود 12. غطي الطبق ولفيه بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. للسماح بتطوير اللون بعد الحضانة ، قم بفك اللوحة.

سيتحول محلول XTT الواضح في البداية إلى اللون البرتقالي بعد معالجته بواسطة الخلايا النشطة الأيضية. انقل 80 ميكرولترا من المواد الطافية الملونة إلى صفيحة ميكروتيتر جديدة ومسطحة القاع. استخدم قارئ لوحة ميكروتيتر ملون مضبوطة بطول موجي يبلغ 490 نانومتر لقراءة اللوحة كما هو موضح هنا في حالة عدم وجود مضادات الفطريات ، لم يتم علاج قراءات القياس اللوني.

الأغشية الحيوية لمقدم الطلب في SEA في صفوف مختلفة متكافئة. من أجل تقييم تأثير المركبات المضادة للفطريات التي تم اختبارها أولا ، اطرح متوسط قيمة الخلفية التي تم الحصول عليها من آبار التحكم السلبية في العمود 12 من جميع القيم الأخرى. بعد ذلك ، احسب النسبة المئوية للتثبيط باستخدام عناصر التحكم الإيجابية في الصف 11.

كقيم قصوى ، تعرف التركيزات المضادة للفطريات التي يتم عندها اكتشاف انخفاض بنسبة 50٪ أو 80٪ في قراءات قياس الألوان باسم الحد الأدنى من تركيزات سيسيل المثبطة. وعادة ما تستخدم هذه القيم كمقياس مرجعي لفاعلية المركب. باستخدام هذه الطريقة البسيطة عالية الإنتاجية ، يمكن تكوين الأغشية الحيوية الفطرية في المختبر في غضون 24 ساعة ، ويمكن فحص المركبات المختارة بحثا عن نشاط مضاد للفطريات بعد تطويرها الأولي.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الفطريات الطبية لاستكشاف تكوين الأغشية الحيوية وفحص نشاط العوامل المضادة للفطريات. مرة أخرى ، الخلايا في الأغشية الحيوية.