Name: مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: اكتشف تقنيات التلقيح العشوائي باستخدام EMS والأشعة فوق البنفسجية في الديدان Pristionchus pacificus. تُمكّن هذه الطرق الباحثين من تحديد الجينات المشاركة في العمليات البيولوجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة المعهد المصرفي # 0615996.

الجزء 1 : إعداد وسائط النمو الخيطية (NGM) لوحات بتري الديدان الخيطية التجريبية مثل ايليجانس جيم و P. عادة ما يتم تربيتها في المختبر pacificus في 6 لوحات تحتوي على نيماتودا بيتري الطول متوسطة النمو (NGM) 1. يتم الاحتفاظ الديدان في 20 درجة مئوية ، ولكن يمكن المحتضنة في مجموعة من درجات الحرارة (بين 4 درجات مئوية -- 25 درجة مئوية) ، تبعا للأنواع الديدان الخيطية والتصميم التجريبي. لإعداد لوحات مع NGM والتقنيات القياسية عقيمة لا بد من استخدامها لمنع التلوث الفطرية والبكتيرية. التالي هو بروتوكول لإعداد لوحات NGM : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن 15 ز آغار ، 2.4 غرام كلوريد الصوديوم ، 2 ز تريبتون ، و2،72 ز KH 2 PO 4 في دورق مخروطي L 2 ، وجعل حجم ما يصل إلى 1 لتر مع الأوتوكلاف ، والمياه ، والسماح لتبرد إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.8 مل من كل CaCl M 1 2 ، والكولسترول (5 ملغ / مل في الإيثانول) ، و 1 م MgSO 4. وسعها لمنع تلوث الفطرية والبكتيرية ، 1 مل ستربتوميسين (100 ملغ / مل) ، والنيستاتين 1ml (10 ملغ / مل) يمكن ان تضاف الى كل ليتر من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز Unispense والحفاظ على ظروف معقمة ، يصب في وسائل الاعلام على لوحات المطلوب. ينبغي أن تملأ لوحات لنحو 2 / 3 الثالث كامل. وهناك معيار قطرها 60 ملم لوحة يتطلب حوالي 10 مل من وسائل الإعلام. لا تتحرك لوحات حتى يتم gelified تماما آغار ، وإلا سيكون هناك تفاوت سطح آغار ، مما يجعل من الصعب التركيز على stereomicroscope الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة المجففة ، ويمكن لوحات المصنف مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية حتى مع بذر البكتيريا. </li></ol> الجزء 2 : إعداد OP50 البكتيريا وبذر NGM وحات بيتري هو مثقف P. pacificus في المختبر من خلال تغذيتها على سلالة OP50 القولونية. OP50 لديها نمو محدود على لوحات NGM ، وبالتالي تكوين حشيش رقيقة يسهل تصور من الديدان 1. أن تنمو ثقافة OP50 ، استخدم LB - مرق : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ز bactotryptone ، خلاصة الخميرة 2.5 و 2.5 ز ز كلوريد الصوديوم إلى 500 مل زجاجة كأب المسمار ، يشكلون وحدة التخزين إلى 500 مل بالماء المقطر والأوتوكلاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحصين مرق مع مستعمرة واحدة من OP50 من لوحة الثقافة تحت ظروف معقمة وتركها تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LB - OP50 مستعد لاستخدامها ، ويمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أشهر إذا استمر العقم. كلما لوحات تحتاج إلى المصنف ، صب كمية صغيرة من المرق في الدورق معقمة صغيرة ، وهذا سيساعد على منع التلوث من ثقافة الأسهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات البذور ، والاستغناء عن 100-120 ميكرولتر من OP50 على القطر 60 ملم لوحة بيتري NGM ودوامة لانتشاره. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه اللوحات المصنفة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة لالعشب ينمو. ويمكن الآن هذه اللوحات المصنفة يتم تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. تخزينها في وضع مقلوب يساعد على منع الجفاف السريع. </li></ol> الجزء 3 : جعل معول في هذا القسم ونحن تصف كيفية جعل لالتقاط الديدان. يستخدم لنقل التقاط الديدان من موقع إلى آخر. يتم اختيار من 30 سلك قياس 90 ٪ من البلاتين إيريديوم 10 ٪ ، رغم أن بعض الباحثين قد تفضل التراكيب المعدنية مختلفة قليلا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع حوالي 3-4 سم من الأسلاك ، ومكان منه 0.5 سم داخل غيض من ماصة باستير (الذي تم كسره تلميح إلى أصغر والطول) ، ثم ختم ذلك في الزجاج فوق الموقد بنسن. طول السلك يبرز من الزجاج حوالي 3-3،5 سم ، ولكن يمكن أن تختلف وفقا لتفضيلات الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتسطح نهاية السلك الذي جاحظ باستخدام مطرقة أو كماشة. ينحني ثم صعودا جزء بالارض لتشكيل حلج القطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنعيم حواف حادة للاختيار مع ورقة الرمل لمنع تلف أو أغار على دودة. </li></ol> الجزء 4 : الديدان الإلتقاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالتقاط الديدان وتعقيم سلك البلاتين على اللهب وسحب الطرف المسطح لبيك على طول العشب البكتيرية إلى معطف غيض مع البكتيريا لزجة سميكة ، مع الحرص على عدم ثقب أو تلف سطح آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام stereomicroscope ، جدا الفرشاة بخفة غيض زجة ضد الديدان دودة / ويمكن الحصول حتى على دودة العصي على البكتيريا على الاختيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة على الدودة غيض من اختيار ونقل على الفور إلى لوحة جديدة عن طريق لمس أو انزلاق غيض من التقاط ضد العشب البكتيريا من لوحة جديدة ، والدودة ينبغي إيقاف الزحف. ويجب الحرص على عدم الاضرار سطح أغار على لوحة أخرى الديدان تزحف في ثقوب مما يجعل من الصعب استردادها. إذا الدودة يبقى على اختيار لفترة طويلة جدا ، فإنه قد يجفف. </li></ol> الجزء 5 : EMS الطفرات إيثيل سلفونات الميثان (EMS) يحرض طائفة واسعة من طفرات في الجينوم في 2. يمكن التعرف على المسوخ عن عيوب مثل وضع البيض ، وعيب العضلاتق ، وتحديد الجنس ، وتشكيل dauer ، والسلوك ، وتشكيل الغدد التناسلية. بروتوكول لالطفرات EMS مماثلة لتلك التي وصفها لجيم ايليجانس 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 500 مل (أو أكثر) من هيدروكسيد الصوديوم 1N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 4-5 ، 6 سم القطر بيتري لوحات كاملة من الديدان ، والتي تحتوي على بضع مئات من الديدان في الأحداث اليرقات الثالثة (J3) المرحلة ، ويغسل قبالة الديدان باستخدام 2-3 مل من M9 معقم لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل الديدان في ، القابل للتصرف العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5-7 دقائق أو حتى الديدان تشكيل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح السائل واستخدامها 2 مل من M9 لإعادة تعليق الديدان. إضافة إلى 20 ميكرولتر EMS أنبوب يحتوي 2ml من M9 ويهز حلها. ثم يضاف هذا الحل EMS إلى 2ml التعليق دودة ودوامة بلطف. وسوف تركز النهائي EMS يكون 47 مم. الحذر : EMS هو المغير قوي جدا ويجب التعامل معها في غطاء الدخان. ينبغي أن يعامل جميع المواد (قفازات ، ماصات ، نصائح) التي تأتي في اتصال مع هذا المغير مع هيدروكسيد الصوديوم 1N إلى EMS والخاملة. ارتداء قفازات مزدوج خلال الإجراء بأكمله الطفرات EMS. تخلص من النفايات الخطرة وفقا لمبادئ توجيهية مؤسستكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب الطرد المركزي وتغطية سقف مع parafilm ؛ ضعه أفقيا في غطاء الدخان والسماح للديدان احتضان مقابل 3.5 ساعة. ويمكن أيضا أن يوضع أنبوب على سرعة منخفضة الروك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الأنبوب وتغطية سقف مع parafilm ؛ ضعه في وضع عمودي واحتضان حتى تغرق الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطاف تخلص منه في كوب / قارورة تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم 1N. هذا سوف يعطل نظام الإدارة البيئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى 5 مل M9 الديدان ، عكس الأنبوب 25-30 مرات لغسل الديدان ، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة دقيقة أو حتى 5-7 الديدان تشكيل بيليه. نضح في وتجاهل طاف في الدورق 1N هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة غسل ما لا يقل عن 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي ، وإعادة تعليق بيليه دودة في الحد الأدنى (~ 500 ميكرولتر) من M9 وماصة بها على لوحات تحتوي على NGM حشيش OP50 البكتيريا. في هذه النقطة التي لم تعد بحاجة إلى العمل في هود الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا السائل الجاف لبضع دقائق ثم واختيار ونقل سليم يبحث J4 اليرقات لوحات المصنف الطازجة. تجاهل لوحة أصلية وفقا للمبادئ التوجيهية مؤسستكم النفايات الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك النفس الديدان mutagenized إخصاب. باستخدام stereomicroscope ، شاشة الظواهر جيل F2 للالمسوخ المتنحية من الفائدة. </li></ol> الجزء 6 : سورالين الطفرات في هذا القسم ونحن تصف إجراءات استخدام الطفرات TMP بالتزامن مع الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (UV). ويستخدم على نطاق واسع TMP / الأشعة فوق البنفسجية طريقة للحث على الطفرات طفرات الحذف داخل الجينوم 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الديدان 4-5 ، 6 سم القطر لوحات بتري في أنبوب الطرد المركزي 15 مل كما هو موضح في الإجراء السابق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل M9 ، عكس 20 مرة لغسل الديدان ، وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتكرار الغسيل لما مجموعه 3 مرات. نضح السائل وإعادة تعليق الديدان في 10 مرات عن حجمها من M9 يحتوي على 30 ميكروغرام / مل من TMP. 20 ماصة ميكرولتر من TMP (3 ملغ / مل) في 2 مل من M9. مثل EMS ، TMP هو مادة مسرطنة قوية ، ويجب التعامل مع اتخاذ تدابير السلامة المناسبة. وينبغي لمنع الخطر المحتمل من من العين السليمة للأشعة فوق البنفسجية ضوء ترتدي استخدامها. يجب تجاهل المستهلكات في أكياس واقية مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز سرعة منخفضة (40 UPM). تعيين أنبوب غطت عموديا لمدة 10 دقائق للسماح للجميع مصدر الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الديدان من الجزء السفلي من أنبوب مع ماصة باستير ونقلها على لوحة NGM غير المصنف. تجاهل المبادئ التوجيهية التالية طاف مؤسستكم الكيميائية الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على لوحة في الظلام حتى يتم امتصاص فائض TMP في لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقياس كثافة الأشعة فوق البنفسجية ، تعيين المسافة بين مصدر الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة وطبق مثل هذه الشدة على لوحة μW هو 500 / سم 2 4. إزالة الغطاء الألومنيوم والغطاء ، وتغطي وفضح لوحة تحتوي على الديدان TMP المعالجة لأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة لمدة 50 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية وترك الديدان في الظلام لمدة 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ونقل سليم يبحث J4 اليرقات لوحات المصنف الطازجة. تجاهل المبادئ التوجيهية التالية لوحة أصلية مؤسستكم الكيميائية الخطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام stereomicroscope ، شاشة الظواهر جيل F2 للطفرة من الاهتمام. </li></ol> الجزء 7 : النتائج الممثل بعض P. وترد الظواهر pacificus متحولة الناتجة عن الطفرات (إما عن طريق البريد الممتاز أو TMP / الأشعة فوق البنفسجية) في الشكل رقم 1. كل طافرة له النمط الظاهري هو السمة التي يمكن تمييزها بسهولة من نوع الحيوانات البرية. من الديدانالتي تم تناولها مع المغير ، 30 J3/J4 اليرقات من جيل الآباء (P0) تم وضعها في لوحات منفصلة ، وسمح لوضع البيض ، والتي هي جيل F1. من لوحات والتي أظهرت ذرية F1 صحية ، تم نقل ما مجموعه 1000 F1s على لوحات فردية وفرزهم على سلالة F2 عن الظواهر. تم العثور على الحيوانات مع بدين وقصير 5،6 و 6 غير المنسقة والظواهر محول 7. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. Pristionchus pacificus نوع البرية والحيوانات الطافرة. ألف باء بالوزن بالوزن خنثى ذكر جيم دال dpy متحولة UNC متحولة E. الهيئة متحولة. أعلى فريقين تبين البرية خنثى نوع (يسار) والذكور الحيوانات (يمين) مقارنة مع طفرات مختلفة في لوحات المتبقية.

<ol><li>Brenner, S. Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li>
<li>Anderson, P. Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li>
<li>Pires-daSilva, A. WormBook. , 1-1 (2005).</li>
<li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li>
<li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li>
<li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. Genes & development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li>
<li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li>
<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطفرات هي تقنية تستخدم على نطاق واسع للدراسات الجينية في مختلف الكائنات النموذج التجريبي. وغالبا ما تستخدم لتحديد الطفرات التجارب وظيفة الجين 2. ويمكن استخدام الإجراءات الطفرات وصفها هنا ليس فقط لP. pacificus ، ولكن أيضا لجيم ايليجانس الخيطية وغيرها من الأنواع ذات الصلة. نحن هنا تصف طريقتين ، EMS والطفرات TMP / الأشعة فوق البنفسجية. EMS هو مادة كيميائية الذي يسبب طفرات أو الحذف نقطة ...

مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

يصف هذا البروتوكول الإجراءات للحفاظ على الديدان الخيطية في المختبر وكيفية mutagenize عليها باستخدام طريقتين البديل : إيثيل سلفونات الميثان (EMS) و 4 &quot;5 ، 8 trimethylpsoralen مقرونة الأشعة فوق البنفسجية (TMP / الأشعة فوق البنفسجية). الديدان الخيطية هي النظم البيولوجية قوية لدراسات علم الوراثة بسبب خطتهم بسيطة الجسم ونظام التزاوج ، والذي يتكون من المخنثين المصير التسميد والذكور التي يمكن أن تولد المئات من النسل للحيوان الواحد. تتم المحافظة على الديدان الخيطية في لوحات تحتوي على الحشيش. آغار من البكتيريا ويمكن نقلها بسهولة من لوحة إلى أخرى باستخدام الاختيار. EMS هو وكيل مؤلكل تستخدم عادة للحث على الطفرات والحذف نقطة صغيرة ، في حين TMP / الأشعة فوق البنفسجية يؤدي الى الحذف أساسا. اعتمادا على نوع من الديدان الخيطية المستخدمة ، وتركيزات EMS و TMP يجب أن تكون الأمثل. لعزل الطفرات المتنحية من الديدان الخيطية Pristionchus pacificus ، تم فحص الحيوانات بصريا للجيل F2 عن الظواهر. لتوضيح هذه الأساليب ، نحن mutagenized الديدان وبحثت عن غير منسقة (UNC) ، المسوخ (الهيئة) بدين وقصير (Dpy) والمحولات.

الكشف عن العيوب المظهرية مع المسوخ هو طريقة مباشرة لتحديد الجينات التي تعمل في عملية بيولوجية معينة. في هذه المادة ونحن تصف كيفية الديدان الثقافة الحية الحرة (على سبيل المثال ،<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) في المختبر وتظهر طريقتين الطفرات المختلفة ، EMS و TMP الأشعة فوق البنفسجية /.

يصف هذا البروتوكول إجراءات تربية النيماتودا (الديدان الخيطية) في المختبر وكيفية إجراء الطفرات لها باستخدام طريقتين بديلتين: إيثيل ميثان...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تنفيذ بروتوكولي طفرات مختلفين يُستخدمان عادةً لتوليد طفرات في الديدان الخيطية، مثل ceno و hepatitis elegance و prisca. تعد عملية التطفير في Pacificus أداة قوية للكشف عن وظائف الجينات. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير مزارع تحتوي على أعداد كبيرة من الديدان في المرحلة اليرقية الأخيرة قبل البلوغ، والتي سيتم إجراء عملية التطفير عليها.تتمثل الخطوة التالية في إحداث طفرات في الديدان باستخدام إجرائين بديلين، إما المعالجة بـ ethyl methane sulfonate، أو استخدام sore and mutagenesis بالتزامن مع الأشعة فوق البنفسجية. أما الخطوة الثالثة من الإجراء فهي نقل الديدان التي تبدو سليمة إلى أطباق agri، المزروعة حديثاً بالبكتيريا التي تمثل مصدر الغذاء. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في فحص الأنماط الظاهرية الطافرة المطلوبة في الجيل الأول أو الثاني أو الثالث.مرحباً، أنا جوري من مختبر الدكتور أندريه بيريز، سيلفا في قسم الأحياء بجامعة تكساس في أرلينجتون. تساعد إجراءات T-M-P-U-V والطفرات الناتجة عن EMS في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الأبحاث الجينية، مثل تحديد الجينات المشاركة في العمليات البيولوجية التي تؤدي دوراً هاماً أثناء النمو. مرحباً، اسمي مانيش فار، ورغم أن طرق إحداث الطفرات الموضحة ستكون لـ *Pristi Onca S Pacificus*، إلا أنه يمكن استخدامها بشكل شائع لنماذج تجريبية أخرى مثل الديدان الخيطية *sea elegance*، وحتى الفقاريات مثل zebrafish.لنبدأ الآن. تتكون أداة الالتقاط التي نستخدمها لنقل الديدان من موقع إلى آخر من سلك عيار 30، يتكون من 90% بلاتين و10% إريديوم. وبالرغم من أن بعض الباحثين قد يفضلون تركيبات معدنية مختلفة قليلاً لصنع أداة الالتقاط، إلا أنه يتم استخدام ماصة رعوية أيضاً لتثبيت أداة الالتقاط هذه.ابدأ بكسر الطرف الممتد لماصة باستور للوصول إلى الطول المطلوب. قص سلكاً بطول ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات تقريباً، ثم ضع 0.5 سنتيمتر منه داخل طرف ماصة باستور، وقم بتثبيت السلك داخل الزجاج باستخدام موقد بنزن.يبلغ طول السلك البارز من الزجاج حوالي ثلاثة إلى ثلاثة ونصف سنتيمتر، ولكن يمكن أن يختلف ذلك حسب التفضيلات الشخصية. قم بتسطيح طرف السلك البارز باستخدام كماشة، ثم اثنِ الجزء المسطح للأعلى لتشكيل مغرفة.أخيراً، قم بتنعيم الحواف الحادة للملقط باستخدام ورق صنفرة لمنع إتلاف الديدان أو الآجار. لالتقاط الديدان، قم بتعقيم سلك الملقط على لهب، ثم اسحب الطرف المسطح على مستعمرة بكتيرية في طبق NGMP الشجري لتغطية الطرف ببكتيريا لزجة وكثيفة. توخَّ الحذر لعدم ثقب أو إتلاف سطح الآجار باستخدام مجهر ستيريو برفق شديد.مرر طرف الملقط اللاصق مقابل الدودة المراد نقلها حتى تلتصق الدودة بالبكتيريا الموجودة على الملقط. وبمجرد استقرار الدودة على طرف الملقط، انقلها فوراً إلى الطبق الجديد عن طريق ملامسة أو تمرير طرف الملقط مقابل المستعمرة البكتيرية في الطبق الجديد. يجب توخي الحذر لعدم إتلاف سطح الآجار في الطبق، حيث قد تتسلل الديدان إلى الثقوب ويصعب استعادتها.يجب أن تنزلق الدودة عن الملقط عند ملامسة طرف الملقط أو تمريره فوق المستعمرة البكتيرية. لا ينبغي أن تبقى الدودة على الملقط لفترة طويلة لتجنب تعرضها للجفاف. سنقوم بتوضيح عملية الطفرات الموجهة باستخدام EMS على أربعة إلى خمسة أطباق بتري بقطر 6 cm تحتوي على ديدان *Prisca pacificus* في المرحلة اليرقية الثالثة.اغسل الديدان من كل طبق باستخدام مليليترين إلى ثلاثة مليليترات من محلول M nine المعقم لكل طبق. يجب أن يكون هناك بضع مئات من الديدان. اجمع الديدان في أنبوب طرد مركزي معقم مخصص للاستخدام مرة واحدة سعة 15 مليليتر.قم بالطرد المركزي بسرعة 1500 Gs لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق أو حتى تتكون كريّة من الديدان. اشفط السائل واستخدم 2 mL من M nine لإعادة تعليق الديدان مع ارتداء قفازات مزدوجة والعمل داخل غطاء fume hood، ثم أضف 20 µL من EMS إلى أنبوب يحتوي على 2 mL من M nine ورجّه للإذابة. بعد ذلك، أضف هذا المزيج إلى 2 mL من معلق الديدان وقم بتدويره بلطف.سيكون التركيز النهائي لـ EMS هو 47 millimolar. ضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على paraform على هزاز منخفض السرعة داخل خزانة استخلاص الغازات واترك الديدان تحضن لمدة ثلاث ساعات ونصف. في نهاية فترة الحضن التي استمرت ثلاث ساعات ونصف، ضع الأنبوب في وضع عمودي واحضنه حتى تغوص الديدان، بعد ذلك، اسحب السائل الطافي وتخلص منه في بيكر يحتوي على هيدروكسيد الصوديوم العادي لتعطيل مادة EMS الموجودة في السائل الطافي.في كل مرة وقبل إزالة يديك من خزانة طرد الغازات، تأكد من شطفهما أيضاً في محلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 normal. ولتعطيل مادة EMS، أضف خمسة مليلترات من M nine إلى الديدان. اقلب الأنبوبة من 25 إلى 30 مرة لغسل الديدان، ثم قم بالطرد المركزي عند 1500 Gs لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق أو حتى تشكل الديدان راسباً بعد عملية الطرد المركزي، ثم اسحب السائل الطافي وتخلص منه في بيكر يحتوي على محلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 normal.كرر خطوة الغسيل هذه بإضافة M9 والقيام بالطرد المركزي ثم إزالة السائل ثلاث مرات على الأقل. بعد الغسلة النهائية، أعد تعليق راسب الديدان في كمية قليلة من M9، ثم انقل معلق الديدان باستخدام الماصة إلى أطباق NGM تحتوي على طبقة من بكتيريا OP 50. بعد ترك السائل ليجف لبضع دقائق، اختر يرقات J4 التي تبدو سليمة وانقلها إلى أطباق جديدة مزروعة بالبكتيريا.اترك الديدان التي تعرضت للمطفر لتلقح نفسها ذاتياً بعد حوالي ثمانية إلى 10 أيام، ثم استخدم مجهراً ستيريوسياً لفحص أنماط المظهر الظاهري لجيل F two بحثاً عن طفرات مفرطة ذات أهمية. سيتم توضيح إجراء التطفير هذا على ديدان ppac pacificus من أطباق بتري بقطر أربعة إلى خمسة أو ستة سنتيمتر، تُجمع في أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter. أضف 10 milliliters من M nine إلى كتلة الديدان المترسبة.اقلب الأنبوب 20 مرة لغسل الديدان، ثم قم بالطرد المركزي عند 1500 Gs لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي بعد عملية الطرد المركزي. كرر غسل الديدان باستخدام M nine لثلاث مرات إجمالاً، وبعد الغسلة الأخيرة، قم بشفط السائل وأعد تعليق الديدان في حجم من M nine يعادل 10 أضعاف حجمها تقريباً.أضف بعد ذلك 4 5 8 trimethyl SOREIN أو TMP من محلول مخزون بتركيز 3 mg/mL للحصول على تركيز نهائي قدره 30 µg/mL. قم بتحضين الأنبوب في الظلام في درجة حرارة الغرفة على هزاز منخفض السرعة لمدة 15 دقيقة. بعد التحضين، ضع الأنبوب بشكل رأسي لمدة 10 دقائق للسماح لجميع الديدان بالترسب؛ تظهر الأنبوبة في هذا الفيديو بدون غطاء، ولكن يجب عدم تعريض محلول TMP للضوء.نظرًا لأن هذه المادة الكيميائية حساسة للضوء، استخدم ماصة لنقل الديدان من قاع الأنبوب ووضعها على طبق NGM غير مزروع. احتفظ بالطبق في الظلام حتى يتم امتصاص فائض TMP في الطبق. وبمجرد امتصاص TMP في الطبق، يمكن معالجة الديدان بالأشعة فوق البنفسجية.تعد مسافة الفصل بين مصدر الأشعة فوق البنفسجية (UV) طويلة الموجة والطبق إحدى أهم الخطوات في إجراء تكوين العصبونات باستخدام الأشعة فوق البنفسجية في أغشية TMP. لذا، يتعين علينا ضبط هذه المسافة عدة مرات للحصول على شدة الضوء فوق البنفسجي المناسبة الساقطة على الطبق. يجب تسجيل الشدة بواسطة مقياس الشدة، ويجب أن تكون 500 µW/cm².يجب استخدام واقيات العين المناسبة خلال هذه الخطوة بسبب المخاطر المحتملة للأشعة فوق البنفسجية. باستخدام مقياس شدة الأشعة فوق البنفسجية، حدد المسافة من مصدر الأشعة فوق البنفسجية ذات الموجة الطويلة التي تؤدي إلى شدة تبلغ 500 micro watts per centimeter squared.بعد ذلك، قم بإزالة ورق الألمنيوم والغطاء، وضع الطبق الذي يحتوي على الديدان المعالجة بـ TMP على مسافة من المصباح بحيث تكون الشدة على الطبق 500 micro watts per centimeter squared. عرّض الطبق للأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة لمدة 50 ثانية، ثم غطِّ الطبق واترك الديدان في الظلام لمدة خمس ساعات في درجة حرارة الغرفة. وبعد مرور خمس ساعات، اختر يرقات J four التي تبدو سليمة وانقلها إلى أطباق جديدة مزروعة.أخيرًا، افحص جيل F1 أو F2 أو F3 بحثًا عن الأنماط الظاهرية ذات الأهمية باستخدام مجهر ستيريو. يظهر هنا بعض الأنماط الظاهرية الطافرة لـ ppac pacificus التي تم تحديدها في جيل F2 بعد إجراء الطفرات باستخدام EMS أو T-M-P-U-V. اللوحتان العلويتان في هذه الصور هما مثالان لخلنجي من النوع البري وذكر من النوع البري.يمتلك كل طفرة نمطاً ظاهرياً مميزاً يسهل تمييزه عن الحيوان البري. يمثل اللوح C مثالاً على طفرة القصر (dumpy). ويظهر اللوح D طفرة فقدان التنسيق (uncoordinated)، بينما يمثل اللوح E طفرة التحول (transformer). وبمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء طفرات EMS في غضون أربع ساعات ونصف، كما يمكن إجراء طفرات TMP uuv في غضون خمس ساعات ونصف إذا نُفذت بشكل صحيح.تشمل هذه الفترة الزمنية أيضاً وقت الحضانة. لا تنسَ أن مادتي EMS وTMP خطيرتان للغاية، وأثناء العمل بهما، يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة دائماً، مثل ارتداء معطف المختبر واستخدام قفازات مزدوجة، والعمل داخل خزانة استخلاص الأبخرة وارتداء نظارات السلامة. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

إجراءات لبناء زراعة السائل...

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

يصف هذا الفيديو تقنية لفحص الديدان الخيطية الواحدة بسرعة بحثا عن علامة وراثية عن طريق فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في مثال البروتوكول ، نقوم بفحص تحرير الجينوم المستند إلى كريسبر.

دودة واحدة PCR: طريقة لاستخراج وتضخيم الحمض النووي الجيني

عادة ما يزرع C. ايليجانس على لوحات أجار الصلبة أو السائلة في الثقافات المصنف مع E. القولونية. لمنع المنتجات الثانوية البكتيرية من التباس الدراسات السمية والغذائية، ونحن تستخدم وسيلة السائل ممحوضة، CeHR، لتنمو ومزامنة عدد كبير من الديدان لمجموعة من التطبيقات المصب.

زراعة انواع معينة ايليجانس في ممحوضة السائل وسائل الإعلام وإنشاء المعدلة وراثيا الديدان عن طريق قصف Microparticle

نقدم هنا، ديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس كنموذج مضيف تنوعاً لدراسة التفاعل الميكروبية.

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

دودة محاذاة / Worm_CP هو سير عمل فيجي / CellProfiler بسيطة التي يمكن استخدامها لتصويب ومواءمة Caenorhabditis elegans عينات وتسجيل كامل دودة تستند إلى صورة المقايسات دون الحاجة إلى خطوات التدريب المسبق. لقد طبقنا دودة محاذاة / Worm_CP إلى الكم من الحرارة الناجمة عن التعبير في الحيوانات الحية أو قطرات الدهون في عينات ثابتة.

دودة الانحياز Worm_CP، خطين أنابيب مفتوحة المصدر لتقويم و كمية بيانات صورة الفلوريسنس التي تم الحصول عليها من Elegans Caenorhabditis

يمكن استخدام النيماتودا Caenorhabditis elegans القابلة للسحب وراثيا كنموذج بسيط وغير مكلف لاكتشاف الأدوية. وصف هنا هو بروتوكول لتحديد العلاجات المضادة للانسان التي تمنع الإشارات المصب من RAS وEGFR البروتينات.

تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis

يصف هذا البروتوكول اضطرابا في 96 بئرا من Caenorhabditis elegans المستعمر بكتيريا فرديا بعد الشلل البارد وتبييض السطح لإزالة البكتيريا الخارجية. يتم طلاء التعليق الناتج على ألواح أجار للسماح بتحديد كمي دقيق ومتوسط الإنتاجية للحمل البكتيري في أعداد كبيرة من الديدان الفردية.

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

تجلب العوالم المصغرة للسماد التنوع الميكروبي الموجود في الطبيعة إلى المختبر لتسهيل أبحاث الميكروبيوم في Caenorhabditis elegans. فيما يلي بروتوكولات لإعداد تجارب العالم المصغر ، حيث تظهر التجارب القدرة على تعديل التنوع الميكروبي البيئي لاستكشاف العلاقات بين التنوع الميكروبي البيئي وتكوين ميكروبيوم الأمعاء الدودية.

عوالم مصغرة للسماد كبيئات متنوعة ميكروبيا تشبه الطبيعة لأبحاث الميكروبيوم في Caenorhabditis elegans

يظهر هنا بروتوكول محسن لزراعة الديدان الخيطية الفردية المعزولة على وسائط صلبة في أجهزة متعددة الآبار دقيقة الصنع. يسمح هذا النهج بمراقبة الحيوانات الفردية طوال حياتها لمجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية المتعلقة بالشيخوخة والصحة ، بما في ذلك النشاط وحجم الجسم وشكله وهندسة الحركة والبقاء على قيد الحياة.

ثقافة طويلة الأجل ومراقبة Caenorhabditis elegans المعزولة على الوسائط الصلبة في الأجهزة متعددة الآبار

موقع الطفرات الموجهة من البلازميدات كله هو وسيلة بسيطة لخلق أشكال مختلفة قليلا من البلازميد الأصلي. هنا علينا أن نظهر وسيلة سهلة وفعالة من حيث التكلفة لتقديم بدائل في قاعدة البلازميد قياسي باستخدام الكواشف.

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

اكتشف تقنيات التلقيح العشوائي باستخدام EMS والأشعة فوق البنفسجية في الديدان Pristionchus pacificus. تُمكّن هذه الطرق الباحثين من تحديد الجينات المشاركة في العمليات البيولوجية.

مقدمة لمختبر دودة : من الديدان إلى التثقيف الطفرات

استكشف المزيد من الفيديوهات