الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

يستخدم الفيزيولوجيا الكهربية بشكل شائع لدراسة نشاط القنوات الأيونية ذات الجهد المؤتلف في خلايا الكلى الجنينية البشرية المستنبتة. يتطلب التسجيل الناجح أن تعبر الخلايا عن القنوات بمستويات كافية في غشاء الخلية للكشف عنها وأن تكون الخلايا مطلية بكثافة خلوية منخفضة بما يكفي لعزل الخلايا الفردية. غالبا ما يعيق إجراء تسجيلات الخلايا فترات الحضانة الطويلة عند 28 درجة مئوية اللازمة لمثل هذا التعبير حيث يكون هناك عادة فقدان التصاق الخلية واستقرار الغشاء.

هنا ، يتم عرض طريقة محسنة لزراعة الخلايا والتعداء التي تتحايل على هذه المشاكل. يتم نقل الخلايا بطلاقة معتدلة ، ثم يتم احتضانها عند 28 درجة مئوية حتى يتم تحقيق التعبير الكافي عن القناة الأيونية. ثم يتم طلاء الخلايا المنقولة على زلات غطاء زجاجي بكثافة منخفضة وتحضينها عند 37 درجة مئوية لعدة ساعات للسماح بربط الخلية وتثبيت الغشاء.

بمجرد أن يتم تحديد الخلايا المطلية بشكل مناسب بواسطة EGFP المعبر عنه المشترك ومشبك تصحيح الخلية بأكملها. يمكن إجراء التسجيل أو يمكن احتضان الخلايا مرة أخرى عند 28 درجة مئوية. لزيادة التعبير عن سطح القناة ، تشير نتائج تسجيل التجارب على الخلايا المنقولة بقنوات الكالسيوم ذات الجهد الكهربائي مثل L CAV واحد ، و L CAV اثنان ، أو L cav ثلاثة إلى أن القنوات قد تم نقلها بنجاح والتعبير عنها بواسطة الخلايا.

على الرغم من أن النتائج التمثيلية فقط ل L CAV ثلاثة معروضة في مختبرنا ، فقد طورنا طريقة لتعزيز التعبير عن جينات القناة الأيونية التي تعبر بشكل سيئ لتسجيل مشبك التصحيح في خطوط الخلايا البشرية. الآن النهج التقليدي هو تقسيم الخلايا أولا على زلات الغطاء وتعدادها باستخدام CDNAs البلازما التي تحتوي على جينات القناة الأيونية ، ثم احتضانها لعدة أيام عند 28 درجة مئوية من أجل تحقيق تعبير عالي الكفاءة للقناة الأيونية قبل التسجيل الفيزيولوجي الكهربي. يقلل نهجنا الجديد بشكل كبير من وقت الحضانة المطلوب عند 28 درجة مئوية قبل التسجيل.

الآن من خلال تقليل وقت الحضانة 28 درجة ، نجد أن أغشية الخلايا أكثر استقرارا وأن الخلايا المنقولة تلتصق أكثر بكثير بزلات الغطاء. هذا يزيد من عدد الخلايا القابلة للتسجيل ويجعل التجربة أكثر كفاءة بشكل كبير. قبل التعدي ، قم بتقسيم قارورة ملتصقة بالكامل من خلايا HEK 2 9 3 T ، واحدة إلى أربعة في قارورة جديدة 25 سم مربع ووضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.

اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة ثلاث إلى أربع ساعات بعد أربع ساعات ، وافحص الخلايا عن طريق تباين التداخل التفاضلي للتحقق من التعلق. لاحظ أن الخلايا لم تعد تبدو مستديرة وتتسقط. الامتدادات أو pseudopodia مرئية.

ستبدو خلايا التقاء أقل متشابهة ولكنها ستكون متباعدة أكثر. بمجرد أن تلتصق الخلايا ، اجمع بين الكواشف اللازمة لإجراء تعداء فوسفات الكالسيوم القياسي. قم بإعداد ما مجموعه 12 ميكروغراما من الحمض النووي في 600 ميكرولتر من محلول التعدي لكل قارورة.

هنا يتم استنساخ CDNAs من قنوات أيونية مختلفة في P-I-R-E-S اثنين من EGFP transfection لناقل التعبير هذا إلى خط خلية الثدييات. ينتج عن إنتاج بروتين فلوري أخضر محسن من نفس الحمض النووي الريبوزي المرسال مثل الإدخال المستنسخ من خلال الترجمة التي تبدأ في موقع دخول الريبوسوم الداخلي في اتجاه مجرى تسلسل طلاء القناة الأيونية وأعلى تسلسل طلاء EGFP. يسمح ذلك بتحديد الخلايا المنقولة بشكل إيجابي دون تدخل محتمل في وظيفة البروتين التي قد تكون ناجمة عن دمج بروتين EGFP مباشرة مع البروتين محل الاهتمام.

قم بتمرير محلول التعدي فوق الخلايا بالتنقيط ، ثم قم بتدوير القارورة برفق وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل في اليوم التالي. تحقق من كفاءة التعداء من خلال عرض الخلايا تحت المجهر الفلوري. يجب أن تظهر الخلايا المنقولة بشكل إيجابي باللون الأخضر في جميع أنحاء الخلية بأكملها.

بمجرد التحقق من التعداء ، قم بإدخال الماصة بعناية من أربعة إلى خمسة ملليلتر من الوسط الدافئ في القارورة المقلوبة. اغسل الخلايا عن طريق قلب القارورة ببطء بحيث يكون سطح الخلية لأسفل وهز القارورة حتى يتحرك محلول الغسيل برفق فوقها. قم بإزالة الوسيط وكرر هذا الغسيل.

الخطوة مرتين أخريين. ثم أضف ستة ملليلتر من الوسط إلى القارورة واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. يمثل التعبير عن القنوات الأيونية اللافقارية بعض التحديات.

أولا ، غالبا ما تكون كبيرة الحجم وبالتالي قد تستغرق وقتا طويلا لترجمتها في الشبكة الإندوبلازمية. أيضا ، قد لا يتم استهدافها بكفاءة لغشاء الخلية في خط خلايا الثدييات. أخيرا ، نظرا لأن الأنواع المختلفة تظهر ترددات استخدام مختلفة للكودون ، فقد تحتوي CDNAs غير المتجانسة على ترددات عالية من الكودونات غير الشائعة في خلايا الثدييات مثل HEK 2 9 3 T للتغلب على بعض هذه الصعوبات.

بعد حضانة ساعتين عند 37 درجة مئوية بعد غسل المقلاة ، انقل القوارير إلى حاضنة 28 درجة مئوية لمدة يومين إلى ستة أيام لتمديد فترة التعبير. يجب تحديد وقت الحضانة تجريبيا لكل نوع من أنواع القنوات الأيونية التي يتم التعبير عنها. نظرا لأن الحضانة عند 28 درجة مئوية لفترات زمنية طويلة تؤدي إلى انفصال الخلية وضعف استقرار الغشاء.

هناك حاجة إلى مزيد من تحضير الخلايا قبل إجراء الدراسات الفيزيولوجية الكهربية. أولا ، قم بإزالة الوسائط من الخلايا المنقولة عن طريق ماصة الشفط مليلتر واحد من محلول التربسين 37 درجة مئوية في قارورة مقلوبة. ثم أعد القارورة برفق إلى سطح الخلية لأسفل للسماح للتربسين بالجري برفق فوق الخلايا.

اقلب القارورة مرة أخرى وقم بإزالة التربسين. ثم أضف 250 ميكرولترا من التربسين الدافئ مباشرة فوق الخلايا واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى تنفصل الخلايا. في غضون ذلك ، ضع ثلاثة إلى ثمانية غطاء مطلي بولي L يسين في طبق ثقافة 60 ملم وأضف خمسة ملليلتر من وسط الثقافة الدافئ.

بمجرد أن تنفصل الخلايا عن الريسوس، قم بتعليقها في أربعة ملليلتر من الوسط الدافئ عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل حوالي ست مرات بعد ذلك، باستخدام طرف الماصة الدقيقة، اضغط لأسفل على زلات الغطاء للتأكد من أنها في قاع الطبق. ثم أضف 250 إلى 500 ميكرولتر من الخلايا المعلقة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات للسماح لها بالالتصاق بزلات الغطاء.

سيؤدي ترك الخلايا لفترة طويلة عند 37 درجة إلى انقسام الخلايا وتخفيف البلازميدات المنقولة. يجب طلاء الخلايا المنقولة بكثافة منخفضة بما يكفي بحيث يتم عزلها عن بعضها البعض كما هو موضح هنا. سيسهل ذلك التسجيل الفيزيولوجي الكهربي.

بالنسبة للخلايا التي تتطلب وحدات فرعية ملحقة ، غالبا ما يكون من الضروري نقل الخلايا إلى 28 درجة مئوية واحتضانها لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام إضافية قبل الفيزيولوجيا الكهربية. يتم التسجيل للخلايا التي لا تتطلب وحدات فرعية ملحقة. يمكن إجراء التسجيل مباشرة بعد هذه الحضانة.

تشتمل منصة الفيزيولوجيا الكهربية المستخدمة هنا على مكبر للصوت ، ومعالجات ماصة آلية ومزدوجة ، ومجهر مضان epi ، وأنظمة التروية. تم تركيب الجهاز على طاولة عزل الاهتزاز والضالة. الضوضاء الكهربائية محدودة بأنظمة تحكم إلكترونية من النوع الثاني من القفص النمس بطول 40 بوصة بما في ذلك جهاز كمبيوتر مزود ببيانات رقمية 1440 ، وواجهة محول تناظرية إلى رقمية جنبا إلى جنب مع برنامج P clamp 10.1.

تركيب مضخم شاشة الكمبيوتر ، ومناور المحرك ، ونظام التحكم في وفرة وصلة الصمام خارج قفص فاراداي. على رف كهربائي معدني قائم بذاته مقاس 19 بوصة ، يتم تأريض جميع المعدات الكهربائية بموزع نحاسي وتوصيلها بمحول عزل طبي ، والذي يوفر عزل الخط ، وأرضية ثابتة وقمع زيادة التيار. استعد للتجارب عن طريق تركيب ماصات صغيرة مصقولة بالحريق بمقاومة من اثنين إلى خمسة ميجا أوم على حامل الماصة الدقيقة على مرحلة الرأس.

تمتلئ ماصات التصحيح بنقرة محلول داخلية لإزالة فقاعات الهواء ويتم تركيبها أخيرا على مرحلة الرأس. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قم بنقل زلة غطاء واحدة مع خلايا مطلية إلى طبق بتري بلاستيكي مقاس 35 ملم يحتوي على ثلاثة ملليلتر من محلول التسجيل الخارجي في درجة حرارة الغرفة. يجب قياس حجم محلول التسجيل بدقة عند إجراء تجارب دوائية يتم خلالها إضافة كميات معروفة من الدواء إلى الطبق باستخدام ماصة دقيقة ، ضع الطبق على مرحلة المجهر.

ثم املأ نصف خلية حامل قطب كهربائي صغير بثلاثة كلوريد سيزيوم مولاري. ثم أدخل القطب المرجعي في نصف الخلية وضع القطب الأرضي في الحمام باستخدام مناور الميكروم، وقم بخفض ماصة التصحيح في محلول الحمام. تصور الخلايا في وضع التألق وتوسيط خلية خضراء ملتصقة معزولة بشكل إيجابي في منتصف مجال الرؤية.

أثناء وجودك في وضع الاستحمام، اجعل ماصة التصحيح على مقربة من الخلية. صفر تتبع الموجة المربعة التي لوحظت على شاشة الكمبيوتر. اضبط موضع ماصة التصحيح بحيث تلامس الخلية فقط ويبدأ تتبع التيار المربع على الشاشة في التذبذب.

ضع شفطا لطيفا باستخدام حقنة متصلة حتى يتم تشكيل ختم جيجا أوم. بمجرد تحقيق ختم جيجا أوم ، قم بتبديل البرنامج إلى وضع التصحيح. ضع نبضة شفط سريعة بالحقنة لاختراق غشاء الخلية.

ثم قم بالتبديل إلى وضع الخلية واستخدم معلمات الخلية بأكملها على مكبر الصوت. للتعويض عن العابر السعوي ، من الضروري موازنة التصحيح بحيث يتم تحليل محلول التسجيل داخل الخلايا في الخلية المصححة. أدخل بروتوكولات مشبك الجهد المكتوبة لهذه التجربة هنا.

صمم المجرب بروتوكولا لقياس التيارات الأيونية من خلال القنوات الأيونية ذات الجهد المسور التي تنتج عند تعديل الجهد عبر غشاء الخلية. في هذه الحالة ، نحن ننظر إلى بروتوكول IV الذي يحدد أن البرنامج يحمل الخلية عند 110 مللي فولت تحت الصفر ثم SEP إلى 70 مللي فولت تحت الصفر لمدة 250 مللي ثانية. ثم عد إلى سالب 110 مللي فولت مع الاحتفاظ بالإمكان في كل مرة تزداد فيها الخطوة بمقدار 10 مللي فولت بحيث تكون الخطوات سالب 70 مللي فولت ، سالب 60 مللي فولت ، وما إلى ذلك ، حتى تكون الخطوة الأخيرة هي جمع 20 مللي فولت.

قم بتصفية التيارات المسجلة عند 10 كيلو هرتز باستخدام مرشح Lowpass Bessel على مكبر الصوت ورقمنتها بتردد أخذ عينات يبلغ كيلوهرتز باستخدام برنامج المشبك X 10.1 يستخدم فقط التسجيلات ذات الحد الأدنى من التسرب أقل من 10٪ للتحليل ، تمت زراعة خلايا HEK 2 93 T ونقلها باستخدام L Cav. ثلاث قنوات كالسيوم كما هو موضح هنا. تمت الإشارة إلى التعدي الناجح للقنوات الأيونية غير المتجانسة CDNAs من خلال التألق الناتج عن متجه P-I-R-E-S ثنائي EEG FP.

نعرض هنا تعبيرا ناجحا عن قناة الكالسيوم اللافقارية ذات الجهد. عندما لا يتم نقل الخلايا ، لا يمكن استنباط تيارات الكالسيوم. في حين أن الخلايا المنقولة تولد تيارات كبيرة عند تطبيق بروتوكولات مشبك جهد الخلية بالكامل على الخلايا.

يمكن للمجربين استخدام العديد من الظروف الفيزيولوجية الكهربية وأنظمة تحليل البيانات حسب متطلباتهم. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام حكمك الخاص فيما يتعلق بتوقيت التجارب. نظرا لأن القنوات المختلفة يتم التعبير عنها بكفاءات مختلفة في غشاء الخلية ، فإن الأمر متروك لك لتحديد الإستراتيجية المثلى لاستخدامها لزيادة صلاحية الخلايا بالإضافة إلى تعظيم التعبير السطحي للقنوات التي تهتم بها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن تكون قد اكتسبت فهما جيدا لكيفية زراعة خط الخلايا البشرية والحفاظ عليه ، بالإضافة إلى كيفية نقل القنوات الأيونية غير المتجانسة CDNAs ووحدات CDNA الفرعية إلى هذه الخلايا. للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي.