في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene ₄ الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β

يُعد الليكوترين B4 جزيئاً محفزاً للالتهاب يتوسط تأثيراته عبر المستقبلات المقترنة بالبروتين G، وهي BLT1 وBLT2 الموجودة على مجموعة متنوعة من الخلايا الالتهابية. وقد ثبت أن مسار LTB4-BLT1 يلعب دوراً حاسماً في العديد من الأمراض الالتهابية، بما في ذلك الربو، والتهاب المفاصل، وتصلب الشرايين. وتعمل المستقبلات المقترنة بالبروتين G (أو GPCR) على نقل الإشارات خارج الخلية التي تؤدي إلى استجابات داخل خلوية مثل الانجذاب الكيميائي، وإطلاق الكالسيوم داخل الخلايا، وتنظيم الجينات.

يؤدي ارتباط اللجين خارج الخلية إلى سلسلة من التغيرات التشكيلية التي تؤدي إلى تنشيط بروتينات G غير المتجانسة الثلاثية. تقوم بروتينات G بعد ذلك بتعديل مستويات الرسل الثانية، مثل cyclic adenosine monophosphate و acetol tri phosphate و DYL glycerol لمراقبة هجرة الخلايا التي يتوسطها leukotriene B four في الوقت الحقيقي. يتم تصوير الخلايا التغصنية المشتقة من نخاع العظم أو B MDCs أثناء توصيل اللجين عبر تدفق محكوم من ماصة دقيقة. ويتم إجراء التصوير بفاصل زمني لتقييم الهجرة.

باستخدام تقنيات التصوير المباشر للخلايا في الوقت الحقيقي هذه، اكتشف مختبرنا أن مستقبل ليوكوترين B4، المعروف بـ BT1، يُعبر عنه وظيفياً على الخلايا التغصنية. كما حددنا آليات استدخال BT1 المعتمدة على الفسفرة والبيتا-أريستين. ستقوم الدكتورة جلا، الأستاذ المساعد في مختبرنا والتي طورت العديد من هذه التقنيات، بشرح كل من هجرة الخلايا الحية وكذلك استدخال المستقبلات. لتحضير الخلايا التغصنية المشتقة من نخاع العظم (B MDCs) لاختبارات هجرة الخلايا، يتم زرع 0.5 مليون خلية في وسط زرع RPMI 1640 يحتوي على FBS و recombinant G-M-C-S-F و recombinant FLT3 في طبق ذي قاعدة زجاجية بقطر 35 مليمتر.

بمجرد توزيع الخلايا في الأطباق، تُحضن لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. بعد مرور 16 ساعة، أضف 3 mL من PBS ثم قم بسحبه. كرر عملية الغسل هذه مرتين إضافيتين على الأقل، وبعد عملية السحب الأخيرة، أضف 2 mL من PBS إلى الطبق.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة للتجربة ويجب حفظها عند 37 درجة Celsius. وحتى ذلك الحين، يتكون نظام التصوير المستخدم في التجارب في هذا الفيديو من نظام A-T-E-F-M epi fluorescent متصل بمجهر Nikon eclipse TE 300 المقلوب، والمجهز بمنصة تسخين وكاميرا Digital black and white CCD من طراز cool SNAP hq.

يتم التحكم في أطوال موجات الإثارة والانبعاث باستخدام عجلات المرشحات وعبر وحدة تحكم في عجلات المرشحات من طراز Lambda 10-2. كما يتم التحكم في ضبط الأجهزة واكتساب الصور بواسطة برنامج metamorph. تم تثبيت جهازين للمناولة الدقيقة (micro manipulators) على منصة المجهر لتثبيت الماصات، والتي يمكن إما تصنيعها وفقاً للتعليمات الواردة في النص المرفق أو شراؤها.

انقل 1.5 milliliters من مخزون بتركيز 100 nanomolar من الربيطة المحفزة للالتهاب leukotriene B four أو LTB four إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 milliliter. قم بملء الماصة الدقيقة مجدداً عن طريق وضع طرف الماصة في المحلول والسماح للمحلول بالدخول؛ حيث تمنع طريقة التحميل هذه تكون فقاعات الهواء في نهاية الماصة الدقيقة. بعد ذلك، قم بتعبئة سرنجة توبكولين سعة 1 cubic centimeter متصلة بإبرة microfill بـ 1 milliliter من LTB four.

بعد ذلك، استخدمه لملء ماصة دقيقة ببطء من الأعلى عبر توصيل أنبوب بالـ LTB. ثم قم بتوصيل الماصة الدقيقة والأنبوب بإبرة قياس 21 وبطول 1.5 بوصة متصلة بمحقنة سعة 1 مل مملوءة أيضاً بالرابط (ligand). الآن، قم بتثبيت الماصة الدقيقة المملوءة بالرابط بعناية على أحد أجهزة التلاعب الدقيق (micro manipulators) الموجودة على منصة المجهر لإجراء تصوير حي للخلايا التغصنية المشتقة من نخاع العظم.

استجابةً لإضافة ربيطة LTB four، قم بإخراج خلايا b MDCs غير الناضجة المزرعة من الحاضنة ووضعها على منصة المجهر المسخنة. قم بإظهار الخلايا في مجال الرؤية باستخدام عدسة غمر زيتية بقوة 60x. ابحث عن منطقة لا تكون فيها الخلايا مزدحمة للغاية، بحيث يمكن مراقبة الهجرة بشكل صحيح.

قم بإزالة الغطاء من طبق الفلورو. بعد ذلك، وباستخدام الموجه اليدوي الخشن، اخفض الماصة المحملة بالرابط بعناية وقم بتقريبها لتصبح على مسافة قريبة جداً من الخلايا باستخدام الموجه الدقيق الهيدروليكي.

قم بضبط بؤرة الماصة. اضغط ضغطاً خفيفاً على السرنجة لبدء الإطلاق البطيء لربيطة LTB four من الطرف، حيث يجب أن تنتشر الربيطة ببطء في الوسط عن طريق الانتشار. بعد ذلك، وباستخدام برنامج metamorph، اضبط معلمات الحصول على الصور لالتقاط صورة بالمجال المضيء كل 15 ثانية لمدة ساعتين.

استمر في المراقبة كل خمس دقائق لمتابعة تقدم الهجرة نحو الربيطة. استُخدمت الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول لتحديد هجرة الخلايا الشجرية نحو leukotriene B four. وهنا، تم قياس هجرة الخلايا الشجرية المشتقة من نخاع عظام الفأر نحو 100.

يظهر فيديو التصوير بالفاصل الزمني هذا هجرة الخلايا الحية من B MDCs نحو ltb. Four، ويمكن تطبيق طرق مماثلة لتحديد الاستجابة الكيميائية للعديد من أنواع الخلايا تجاه مجموعة متنوعة من الجاذبات الكيميائية. يمكن استخدام هذا النوع من التصوير، بالاقتران مع جزيئات وسم البروتين الفلورية، لتتبع حركات وتفاعلات الجزيئات في الوقت الفعلي داخل الخلايا الحية.

نوضح هنا تفاعلات مستقبل لوكوتريين B4 رقم 1 المسمى بفلوروسنت مع بيتا أرستين في الوقت الفعلي. RBL 2 H3 هو خط خلوي لسرطان الدم القاعدي لدى الجرذان تم عزله من جرذان Wister، ويمكن الحصول عليه من ATCC. لا تعبر هذه الخلايا عن العديد من مستقبلات الكيموكين، ولكنها تمتلك المكونات الخلوية اللازمة للتوسط في مسارات الإشارات المعتمدة على الكيموكين.

لتقييم عملية الإدخال الخلوي لـ BT one المستحثة بالربيطة في الوقت الفعلي، يتم ترانسفكشن خلايا RBL two H three بـ BT one RFP و beta arrest in GFP. وأثناء التصوير بالفاصل الزمني، تُضاف الربيطة إلى الطبق. ويمكن تقييم التغيرات في تموضع هذه البروتينات عن طريق تحليل الصور.

لدراسة استبطان G PCR R في الوقت الفعلي، يتم ترانسفكشن B LT one RFP وbeta arrest وGFP في خلايا RBL two H three وفقاً للتعليمات الواردة في النص المرفق. بعد ذلك، يتم نقل 300 µL من خليط الخلايا المكهربة ووسط النمو العادي إلى أطباق فلورو بقطر 35 mm تحتوي على 2 mL من وسط النمو العادي. توضع الخلايا عند 37 °C في جو مرطب يتكون من 95% هواء و5% carbon dioxide للسماح لها بالالتصاق بقاع الطبق.

بعد مرور ساعة واحدة، استبدل وسط ترانسفكشن (transfection medium) بوسط نمو عادي وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة تتراوح بين 18 إلى 24 ساعة إضافية. بعد انتهاء فترة الحضن، اغسل الخلايا مرتين أو ثلاث مرات عن طريق إضافة 2 mL من وسط RPMI الدافئ الخالي من الفينيل الأحمر (phenyl red free) والمحتوي على 10 mM من HEPES مباشرة إلى الطبق ثم شفط الوسط. بعد ذلك، أضف 1.8 mL أخرى.

بعد ذلك، ضع طبق المزرعة على منصة المجهر المسخنة. التقط الصور بتكبير 600 x باستخدام عدسة غمر زيتية بقوة 60 x. ثم انتقل إلى مرشح الفلورة المناسب.

اختر خلية سليمة تعبر عن HBL BT one RFP على سطح الخلية والتقط الصورة هنا. باستخدام مرشح RFP، انتقل إلى مرشح GFP، وتأكد من تعبير beta arrest و GFP في السيتوبلازم ثم التقط الصورة. بعد ذلك، افحص الصور المدمجة ذات الألوان الزائفة للتأكد من عدم وجود تداخل فلوري قد يحدث نتيجة لخطأ في الضبط.

لا يحدث استهداف للمستقبلات بين RFP و GFP. بعد ذلك، أدخل معاملات التصوير بالفاصل الزمني هنا. يتم الحصول على صور بدقة 16 bit مع ضبط ثني الكاميرا على وضع واحد تلو الآخر.

يتم التقاط صور الفلورة الحمراء والخضراء بالتتابع باستخدام مرشحات الفلوروكروم RFP وGFP عبر موزّع حزمة R-F-P-G-F-P. وجّه البرنامج لالتقاط الصور على فترات زمنية مدتها 32 ثانية لمدة ساعة واحدة. اضبط أوقات تعريض الكاميرا بحيث يتم الحصول على نطاقات ديناميكية مماثلة.

لقياس شدة الفلورة لبروتيني RFP وGFP، يتم جمع الصور لمدة دقيقة واحدة، ثم عند الزمن t = 0، تُضاف 200 µL من اللجين مباشرة إلى الطبق دون تحريكه.

استمر في جمع صور الفلورة لمدة 60 دقيقة. بعد إضافة الربيطة، سيتم تخزين الصور التي يتم الحصول عليها تلقائيًا كصور بصيغة TIFF بأسماء ملفات متسلسلة. يمكن بعد ذلك عرض هذه الملفات كصور فردية أو مدمجة باستخدام البرنامج.

أخيراً، بعد الحصول على جميع صور الخلايا، يتم التقاط صور للوسط الغذائي فقط بدون خلايا باستخدام الإعدادات نفسها. احفظ هذه الملفات لاستخدامها كصور خلفية لتحليل الصور. استخدم وظيفة طرح الصور (image subtract) في برنامج Metamorph لطرح الخلفية من صور البيانات الفعلية التي تم الحصول عليها أعلاه.

سيعمل هذا على حساب أي خلفية أو تألق ذاتي ناتج عن الوسط. بعد ذلك، من قائمة الملف (file menu)، افتح خيار ملف المكدس النهائي المُنشأ (final generated stack file) وافتح مكدسات الصور الفردية. بعد ذلك، ضمن قياسات المنطقة (region measurements)، اختر تتبع منطقة الكسوف (eclipse region trace region) وارسم المناطق ذات الأهمية، ثم حدد المناطق السطحية والسيتوسولية لقياس شدة تألق RFP و GFP المقابلة لانتقال BLT one و beta arrestin.

باستخدام خيار بيانات السجل (log data)، الذي يرتبط تلقائياً ببرنامج Excel، قم بتمثيل قيم شدة الفلورسنت كدالة في الزمن. سيوفر هذا الرسم البياني معلومات حول حركية انتقال جزيء معين. ويمكن أن يكشف تحليل الصور عن تموضع بروتينات G PCR R والبروتينات السيتوبلازمية والنواة.

يظهر هنا تعبير BT one RFP على سطح خلية RBL two H three. وتوضح هذه الصورة تموضع beta rest وGFP في السيتوسول لنفس الخلية، بينما يظهر p nuke CFP هنا في النواة. وتشير الصورة المدمجة بالألوان المعروضة هنا إلى التموضع الخلوي المتميز لكل فلوروكروم، كما يمكن هنا تقييم التفاعل المستحث باللجين بين مستقبلات GPCRs السطحية والبروتين السيتوسولي.

انتقال مستقبل BLT1 والبروتين بيتا أريستين (beta arrestin) المحفز بالرابط. يوضح هذا الفيديو تصويراً حياً لخلية تعبر عن BLT1 RFP وبيتا أريستين GFP. عند إضافة 1 µM من LTB4، يمكن مراقبة التكميم لأنماط الانتقال باستخدام برنامج metamorph.

يظهر مسح خطي لكثافات الفلورة في خلية نموذجية عند الزمن T يساوي صفر. يظهر BT1 RFP عند الغشاء، بينما يظهر beta arrestin GFP في العصارة الخلوية. وعند إضافة الربيطة، يُلاحظ تداخل في خطوط RFP وGFP، مما يشير إلى التموضع المشترك للمستقبل وbeta arrestin.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن هنا تحديد حركية حركة البروتين. حيث تم فحص حركية استيعاب المستقبلات وانتقال beta arrestin عند إضافة 1 µM من LTB4.

تم قياس شدة الفلورة كدالة في الزمن عند مواقع الغشاء والسيتوسول في الخلية. تؤدي إضافة ربيطة LTB4 إلى خلايا RRB2 H3 المنقولة جينياً بـ BLT1 RFP وbeta arrestin 1 GFP إلى انتقال beta arrestin 1 GFP من السيتوسول إلى الغشاء، وهو ما يظهر على شكل تكون حلقة صفراء في غضون دقيقة واحدة. وعند التفاعل مع beta arrestin 1 GFP، يشكل BLT1 RFP معقداً من المستقبل وbeta arrestin 1 GFP وينتقل عبر السيتوسول على شكل أجسام داخلية (endosomes)، وهو ما يتضح من ظهور نقاط صفراء في غضون خمس دقائق. وباستخدام هذه الطرق، يمكن تحديد حالة تنشيط المستقبل المعتمدة على الربيطة، وكذلك الزخارف أو العمليات الحرجة المشاركة في تنشيط المستقبل.

أهم أمر في التجربة هو مراقبة المحلول المنظم في الطبق أثناء التشغيل، خاصة وأن التجربة تستمر لأكثر من ساعة بعد بدئها. ظهرت هذه التقنية للباحثين في مجال الكيموكينات والمستقبلات لاستكشاف هجرة الخلايا والتفاعلات بين المستقبلات والروابط في أنواع مختلفة من الخلايا الثديية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تجارب التصوير في الوقت الحقيقي التي تتضمن الكيموكينات ومستقبلاتها وتفاعلاتها مع البروتينات السيتوزولية مثل beta restraints.