في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene ₄ الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β

وتصف هذه الورقة منهجية لتحديد استجابة الكيميائي من الكريات البيض ليغاندس محددة وتحديد التفاعلات بين مستقبلات سطح الخلية والبروتينات عصاري خلوي باستخدام تقنيات التصوير الخلية الحية.

Leukotriene B four هو جزيء مؤيد للالتهابات يتوسط في أفعاله عبر المستقبلات المقترنة ببروتين G ، BT one و BT two على مجموعة متنوعة من الخلايا الالتهابية. ثبت أن مسار LTB four B LT one مهم في العديد من الأمراض الالتهابية بما في ذلك الربو والتهاب المفاصل وتصلب الشرايين. تتوسط المستقبلات المقترنة ببروتين G أو gpcr في نقل الإشارات خارج الخلية التي تؤدي إلى استجابات داخل الخلايا مثل الانجذاب الكيميائي وإطلاق الكالسيوم داخل الخلايا وتنظيم الجينات.

ارتباط الترابط خارج الخلية إلى سلسلة من التغييرات التأكيدية التي تؤدي إلى تنشيط بروتينات G غير المتجانسة. يقوم بروتين G بعد ذلك بتعديل مستويات الرسول الثاني ، مثل الأدينوزين أحادي الفوسفات الدوري ، وثلاثي الفوسفات الأسيتول ، والجلسرين DYL لمراقبة هجرة الخلايا الرباعية بوساطة leukotriene B في الوقت الفعلي يتم تصوير الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام أو B MDCs أثناء تشبيهها عن طريق التدفق المتحكم فيه من ماصة دقيقة. يتم إجراء التصوير بفاصل زمني لتقييم الهجرة.

باستخدام تقنيات التصوير في الوقت الفعلي للخلايا الحية ، اكتشف مختبرنا أن مستقبلات الليوكو ب الأربعة BT واحد يتم التعبير عنها وظيفيا على الخلايا المتغصنة. حددنا أيضا الفسفرة وتوقف بيتا والآليات المعتمدة لاستيعاب BT واحد. سيوضح الدكتور جلا والأستاذ المساعد في مختبرنا الذي طور العديد من هذه التقنيات كلا من هجرة الخلايا الحية وكذلك استيعاب المستقبلات لتحضير الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم أو B MDCs للوحة فحوصات هجرة الخلايا 0.5 مليون خلية في وسط استزراع RPMI 1640 الذي يحتوي على FPS المؤتلف G-M-C-S-F و FLT المؤتلف ثلاثة على طبق زجاجي قاع مقاس 35 ملم.

بمجرد طلاءها ، احتضن الخلايا لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد 16 ساعة. أضف ثلاثة ملليلتر من PBS ثم استنشق. كرر هذا الغسيل مرتين أخريين على الأقل بعد الشفط الأخير ، أضف ملليلترين من PBS إلى اللوحة.

الخلايا جاهزة الآن للتجربة ويجب الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية. حتى ذلك الحين ، يتكون نظام التصوير المستخدم في التجارب في هذا الفيديو من نظام فلورسنت EPI A-T-E-F-M متصل بمجهر مقلوب نيكون eclipse TE 300 ، ومجهز بمرحلة تسخين ومقر SNAP بارد. كاميرا CCD رقمية بالأبيض والأسود.

يتم التحكم في الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث باستخدام عجلات الترشيح وبواسطة وحدة تحكم Lambda 10 اندفاعة ثنائية عجلة الفلتر. يتم التحكم في صور التحكم في الأجهزة والاستحواذ عليها بواسطة برنامج التحويل. يتم توصيل اثنين من المتلاعبين الدقيقين بمرحلة المجهر لتثبيت الماصات ، والتي يمكن تصنيعها وفقا للتعليمات الواردة في النص المصاحب أو شراؤها.

انقل 1.5 مل من مخزون 100 نانومولار من ليكوترين ليكوترين المؤيد للالتهابات أربعة أو LTB أربعة إلى أنبوب فوج سعة 1.5 ملليلتر. ردم الماصة الدقيقة عن طريق وضع طرف الماصة الدقيقة في المحلول والسماح للمحلول بالدخول إلى طريقة التحميل هذه سيمنع فقاعات الهواء من التكون في نهاية الماصة الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتحميل حقنة توبركولين سنتيمتر مكعب واحد متصلة بإبرة microfill مع مليلتر واحد من LTB أربعة.

ثم استخدمه لملء ماصة صغيرة ببطء من أعلى أنبوب التوصيل بالماصة الدقيقة المملوءة بأربعة LTB. ثم قم بتوصيل الماصة الدقيقة والأنبوب بإبرة قياس 21 بوصة ونصف متصلة بحقنة سعة ملليلتر واحد مملوءة أيضا بالرابط. الآن قم بتثبيت الماصة الدقيقة المملوءة بالترابط بعناية على أحد المتلاعبين الدقيقين في مرحلة المجهر لإجراء تصوير الخلايا الحية للخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام.

استجابة لتطبيق LTB أربعة روابط ، قم بإزالة MDCs غير الناضجة المطلية من الحاضنة وضعها على المرحلة الساخنة من المجهر. اعرض الخلايا باستخدام عدسة غمر بالزيت 60 ×. ابحث عن منطقة لا تكون فيها الخلايا مزدحمة بشكل مفرط ، بحيث يمكن مراقبة الهجرة بشكل صحيح.

قم بإزالة الغطاء من طبق الفلورو. ثم باستخدام المعالج اليدوي الخشن، اخفض الماصة المحملة بالترابط بعناية وأدخلها. يغلق القرب من الخلايا باستخدام مناور دقيق هيدروليكي.

اجعل الماصة في بؤرة التركيز. ضع قدرا صغيرا من الضغط من المحقنة لبدء الإطلاق البطيء ل LTB أربعة ترابط من الترابط الطرفي يجب أن ينتشر ببطء في الوسائط عن طريق الانتشار. بعد ذلك ، باستخدام برنامج التحويل ، قم بتعيين معلمات الحصول على الصورة للحصول على صورة المجال الساطع كل 15 ثانية لمدة ساعتين.

استمر في المراقبة كل خمس دقائق لتقدم الهجرة نحو الترابط. تم استخدام الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول لتحديد هجرة الخلايا المتغصنة نحو الليكوترين ب أربعة. هنا ، اشتق نخاع عظم الفأر هجرة الخلايا المتغصنة نحو 100.

يظهر Nan Animal أو LTB four هذا الفيديو التصويري بفاصل زمني هجرة الخلايا الحية ل B MDCs نحو ltb. يمكن تطبيق أربع طرق مماثلة لتحديد الاستجابة الكيميائية للعديد من أنواع الخلايا لمجموعة متنوعة من الجاذبات الكيميائية. يمكن استخدام هذا النوع من التصوير مع جزيئات علامة البروتين الفلوري لتتبع حركات وتفاعلات الجزيئات في الوقت الفعلي في الخلايا الحية.

نوضح هنا تفاعلات العلامة الفلورية leukotriene B أربعة مستقبلات واحد مع بيتا arrestin في الوقت الفعلي. RBL two H three عبارة عن خط خلية سرطان الدم القاعدي للفئران معزولة من فئران Wister ، والتي يمكن الحصول عليها من A TCC. لا تعبر هذه الخلايا عن العديد من مستقبلات الكيموكينات ولكن لديها المكونات الخلوية للتوسط في مسارات الإشارات المعتمدة على الكيموكين.

لتقييم الاستيعاب الناجم عن الترابط ل BT واحد في الوقت الفعلي RBL ، يتم نقل خليتين H وثلاث خلايا باستخدام BT و RFP واحد وتوقف بيتا في GFP. أثناء التصوير بفاصل زمني ، يضاف الترابط إلى اللوحة. يمكن تقييم التغييرات في توطين هذه البروتينات عن طريق تحليل الصور.

لدراسة استيعاب G PCR R في الوقت الحقيقي ، ونقل B LT واحد RFP وإيقاف بيتا و GFP في RBL واثنين H ثلاث خلايا وفقا للتعليمات الواردة في النص المصاحب. ثم انقل 300 ميكرولتر من الخلايا الكهربائية وخليط وسائط النمو المنتظم إلى أطباق فلورو 35 ملم تحتوي على ملليلترين من وسائط النمو العادية. ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح لها بالالتصاق بقاع الطبق.

بعد ساعة واحدة ، استبدل وسط التعداء بوسط نمو منتظم وضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 18 إلى 24 ساعة إضافية. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين أو ثلاث مرات عن طريق إضافة ملليلترين من RPMI الدافئ الخالي من الفينيل الأحمر الذي يحتوي على 10 ملليمولار هيبيز مباشرة إلى اللوحة وشفط الوسائط. ثم أضف 1.8 مل أخرى.

بعد ذلك ، ضع طبق الثقافة على مرحلة المجهر الساخن. اجمع الصور بتكبير 600 × باستخدام عدسة غمر بالزيت 60 ×. ثم قم بالتبديل إلى مرشح التألق المناسب.

اختر خلية سليمة تعبر عن HBL BT one RFP على سطح الخلية والتقط هنا التقاط الصورة. باستخدام مفتاح مرشح RFP إلى مرشح GFP ، تأكد من التعبير عن توقف بيتا و GFP في السيتوبلازم والتقاط الصورة. ثم افحص الصور الملونة الزائفة المدمجة للتأكد من أن النزيف من خلال التألق الذي قد يحدث نتيجة الضباب.

لا يحدث استهداف المستقبلات بين RFP و GFP. بعد ذلك ، أدخل معلمات التصوير بفاصل زمني هنا. يتم الحصول على صور 16 بت مع ضبط ثني الكاميرا على واحدة تلو الأخرى.

يتم التقاط الصور الفلورية باللونين الأحمر والأخضر بالتتابع باستخدام مرشحات RFP و GFP fluorochrome عبر تناثر شعاع R-F-P-G-F-P. قم بتوجيه البرنامج لالتقاط الصور على فترات زمنية 32 لمدة ساعة واحدة. اضبط أوقات تعرض الكاميرا بحيث يتم الحصول على نطاقات ديناميكية مماثلة.

لشدة مضان RFP و GFP. اجمع الصور لمدة دقيقة واحدة ، ثم عند t يساوي صفرا. أضف 200 ميكرولتر من الترابط مباشرة إلى اللوحة دون إزعاجها.

استمر في جمع الصور الفلورية لمدة 60 دقيقة. بعد إضافة الترابط ، عند الحصول على الصور ، سيتم تخزينها تلقائيا كصور TIFF بأسماء ملفات متسلسلة. يمكن بعد ذلك عرض الملفات كصور فردية أو مدمجة باستخدام البرنامج.

أخيرا ، بعد الحصول على جميع صور الخلايا ، احصل على صور بوسائط عادية بدون خلايا باستخدام نفس الإعدادات. احفظ الملفات لاستخدامها كصور خلفية لتحليل الصور. استخدم وظيفة طرح الصورة في التحول لطرح الخلفية من صور البيانات الفعلية التي تم الحصول عليها أعلاه.

سيأخذ هذا في الحسبان أي خلفية أو تألق ذاتي من الوسط. بعد ذلك ، ضمن قائمة الملفات ، افتح خيار ملف المكدس النهائي الذي تم إنشاؤه وافتح مجموعات الصور الفردية. بعد ذلك ، تحت قياسات المنطقة ، حدد منطقة تتبع منطقة الكسوف وارسم مناطق الاهتمام ، وحدد المناطق السطحية والعصارة الخلوية لقياس شدة التألق ل RFP و GFP المقابلة لنقل BLT one و beta arrestin.

باستخدام خيار بيانات السجل ، الذي يرتبط تلقائيا ب Excel ، قم بإسقاط مقدار شدة التألق كدالة للوقت. سيوفر هذا الرسم البياني معلومات حول حركية انتقال جزيء معين. في تحليل الصورة يمكن أن يكشف عن توطين G PCR R والبروتينات العصارية الخلوية والنواة.

هنا ينظر إلى التعبير عن BT واحد RFP على سطح RBL اثنان H ثلاث خلية. تظهر هذه الصورة راحة بيتا وتوطين GFP في العصارة الخلوية لنفس الخلية وهنا يظهر p nuke CFP في النواة. تشير الصورة المجمعة بالألوان الموضحة هنا إلى التوطين الخلوي المميز لكل تفاعل ناجم عن ترابط فلوروكروم ل GPCRs السطحية مع البروتين العصاري الخلوي يمكن تقييمه هنا.

الترابط الناجم عن نقل مستقبلات BLT واحد وبيتا أليستين. يظهر هذا الفيديو تصويرا مباشرا لخلية تعبر عن B LT و RFP واحد و beta arrestin GFP. عند إضافة أربعة ميكرومولار LTB ، يمكن مراقبة القياس الكمي لأنماط الإزاحة باستخدام برنامج التحويل.

يظهر المسح الخطي لشدة التألق في خلية تمثيلية عند T يساوي صفرا. يظهر BT one RFP في الغشاء وينظر إلى توقف بيتا في GFP في العصارة الخلوية. عند إضافة تداخل الترابط لخطوط RFP و GFP ، لوحظ مما يشير إلى تحديد موقع المستقبل وستاتين بيتا.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد حركية حركة البروتين هنا. حركية استيعاب المستقبلات ونقل بيتا إيستاكين. عند إضافة ميكرومولار واحد LTB تم فحصه أربعة.

تم قياس شدة التألق كدالة للوقت في مواقع الغشاء والعزول الخلوي للخلية ، وإضافة LTB أربعة روابط إلى B LT ، وواحد RFP ، وتوقف بيتا في واحد GFP ، ونقل RRB ، واثنين من خلايا H ، وثلاث خلايا يؤدي إلى انتقال سيتاس بيتا ، في GFP واحد ، من العصارة الخلوية إلى الغشاء ، يمكن ملاحظتها على أنها تشكيل حلقة صفراء في غضون دقيقة واحدة. عند التفاعل مع [بيتا] [إيستين] واحدة [غفب], ال [بت] واحد [رفرب] يشكل مستقبلات [بيتا] اعتقالفي واحدة [غف] مركب وينتقل من خلال العصارة خلوية في شكل جسيمات داخلية كما يتضح من ظهور [بوكتا] صفراء في غضون خمس دقائق. باستخدام هذه الطرق ، يمكن تحديد حالة تنشيط المستقبلات المعتمدة على الترابط والأشكال أو العمليات الحرجة المشاركة في تنشيط المستقبل.

أهم شيء في التجربة هو مراقبة المخزن المؤقت في اللوحة أثناء تشغيله. حيث تتجاوز التجربة ساعة واحدة بعد تطورها. ظهرت هذه التقنية للباحثين في مجال الكيموكينات والمستقبلات لاستكشاف هجرة الأوكات وتفاعلات ترابط المستقبلات في أنواع مختلفة من خلايا الثدييات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تجارب التصوير في الوقت الفعلي التي تتضمن الكيموكينات ومستقبلاتها وتفاعلاتها مع بروتينات العصارة الخلوية مثل قيود بيتا.