المستحثة بيئيا توريثه التغييرات في كتان

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح طريقة لزراعة صنف من الكتان القابل للاستحثاث تحت ظروف تؤدي إلى حدوث تغاير جينومي موروث. علاوة على ذلك، يتم رصد التغيرات الجينومية ومراقبة نمو النباتات المستحثة في الأجيال اللاحقة تحت بيئات متنوعة. ولتحقيق ذلك، يُزرع الكتان تحت مجموعة متنوعة من ظروف الاستحثاث.

يتم بعد ذلك جمع أنسجة الأوراق وسيقان Maris في أوقات مختلفة أثناء نمو النباتات تحت الظروف البيئية المتنوعة. بعد ذلك، يتم عزل DNA و RNA من عينات الأنسجة. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في إجراء PCR باستخدام عينات DNA و Q-R-T-P-C-R باستخدام RNA المعزول لتحديد التغيرات الجينومية وتغيرات التعبير الجيني الناتجة عن النمو تحت ظروف بيئية مختلفة.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح الاستجابة الجينومية لظروف النمو من خلال ظهور عنصر الإقحام المنفرد LIS في نقطة محددة من الجينوم، واختلافات التعبير المرتبطة بوجود هذا العنصر كما يتم تصورها بواسطة PCR و R-T-P-C-R التي تُجرى باستخدام الأحماض النووية المعزولة من أنسجة النباتات المعالجة. مرحباً، أنا كريس كال من قسم الأحياء في جامعة كيس ويسترن ريزرف. وأنا كوري جونسون من مختبر كال.

وأنا تيفاني موس، من مختبر Cull أيضاً. وأنا مارشال لوكاس، طالب جامعي في البرنامج الصيفي للبحوث الجامعية في مختبر Cull.

نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التغيرات في الجينوم والتعبير الجيني الناتجة عن الاختلافات في بيئة النمو. لذا، لنبدأ العمل. لزراعة الكتان تحت ظروف تحفيزية، ابدأ بملء أواني بحجم خمس بوصات بالتربة وضغطها.

ازرع النبات التالي، ثلاث بذور كتان في كل أصيص، على عمق ربع بوصة. ثم غطِّ البذور بالتربة في ظروف التحكم غير المحفزة. اسقِ النباتات بـ 100 milliliters من محلول miracle grow بتركيز 1/10.

عالج النباتات في ظروف التغذية العالية باستخدام 100 milliliters من محلول Miracle grow بتركيزه الكامل. وأخيرًا قم بالتطبيق.

يُسقى النباتات منخفضة المغذيات بمياه الصنبور فقط. تُزرع النباتات تحت الضوء الطبيعي خلال فصل الصيف مع نموها. تُسقى جميع النباتات بواسطة نظام رش آلي مرتين يومياً لمدة خمس دقائق.

طبق ظروف النمو على النباتات مرة واحدة في الأسبوع. اجمع الأوراق والسيقان في فواصل زمنية أسبوعية. يتم جمع ست أوراق لاستخراج DNA، وثلاث سيقان لاستخراج RNA. بعد الجمع، ضع المادة النباتية في أنبوب تبريد (cryo vial)، وجمدها بسرعة في نيتروجين سائل، ثم خزن العينات عند درجة حرارة -80 °C حتى يتم الاستخراج.

تنمو الأنماط الجينية الثلاثة بمعدلات نسبية مختلفة اعتماداً على الظروف. في ظل ظروف التحكم، ينمو صنف الكتان النقي storm أو السلالة PL بشكل أفضل. وقد اشتق عدد من السلالات من هذا الأب، حيث كان الصنف الكبير أو L أكثر حيوية من الصنف الصغير أو S.

ومع ذلك، في ظل الظروف منخفضة المغذيات، ينمو S بشكل أفضل من كل من L أو pl. وفي ظل الظروف عالية المغذيات، ينمو L بشكل أفضل من pl، الذي ينمو بشكل أفضل قليلاً فقط من S. وتكشف المقارنة بين كل سلالة من السلالات التي نمت تحت المعاملات الثلاث المختلفة أن PL ينمو بشكل أفضل في ظل ظروف التحكم. وينمو L بشكل أفضل في ظل الظروف عالية المغذيات، بينما ينمو S بشكل مماثل في كل من الظروف عالية المغذيات وظروف التحكم.

تظهر هذه البيانات أنه يمكن التمييز بين الخطوط الثلاثة بناءً على نموها في البيئات الثلاث. وبينما ينمو PL و L بشكل أفضل في بيئات محددة، فإن S ينمو بمعدل متقارب تقريباً في جميع الظروف الثلاثة. ولا يستطيع S الاستفادة من تحسن ظروف المغذيات، ولكنه أكثر قدرة على النمو في ظروف المغذيات المنخفضة جداً.

لاستخلاص DNA، أضف المحلول المنظم، AP one من مجموعة Qiagen, DNEZ plant, DNA prep إلى ست أوراق مع رمل معقم في أنبوب طرد مركزي صغير، ثم اطحن النسيج باستخدام مدقة صغيرة حتى تختفي جميع التكتلات. تابع عملية الاستخلاص باتباع تعليمات المجموعة كما هو موضح. لبدء استخلاص RNA، انقل ثلاث سيقان من نبات maris مع بعض الأوراق المحيطة بها من أنبوب تخزين بالتجميد إلى أنبوب طرد مركزي صغير. أضف الرمل المعقم إلى الأنبوب واطحن النسيج باستخدام مدقة صغيرة حتى يتم طحنه ناعماً.

قم برج sample باستخدام جهاز vortex لمدة 15 ثانية للمساعدة في عملية التحلل، ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بسرعة 13,000 RPM لتجميع الرمل وأي شوائب. أضف SNAT إلى عمود الطرد المركزي وتابع تحضير RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بمجرد استخلاص RNA من النسيج، انقل 10 XDNA buffer بكمية تعادل 1/10 من حجم عينة RNA إلى التفاعل.

وباستخدام 30 وحدة من DNase، يتم تحضين التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، يليه تحضين عند 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. يتم إجراء النسخ العكسي باستخدام طقم Applied Biosystems RNA to cDNA. ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، يتم تحضين التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

أخيرًا، قم بتشغيل 5 µL من الـ CDNA على هلام agarose بتركيز 1.5% لتحديد الحصيلة. وبمجرد تحضير الـ CD NA الخاص بـ flax، يتم استخدامه في الـ QPCR. قم بإجراء الـ QPCR باستخدام نظام ABI Step one.

أجرِ جميع المقاييس في ثلاث مكررات لكل تشغيلة، واستخدم الجين المرجعي Acton كضابط لعدد النسخ لتحضير تفاعلات QPCR. أضف 1 µL من زوج البادئات المناسب إلى كل أنبوب. خفف CD NA إلى التركيز المناسب وأضف 9 µL إلى كل أنبوب.

أخيرًا، أضف 10 µL من مزيج PCR master mix بتركيز 2x cyberg green إلى كل أنبوب. بعد ذلك، قم بإعداد برنامج التضخيم باتباع خطوات التضخيم. احسب مستويات التعبير النسبي من رقم الدورة عند العتبة، والتي يتم تحديدها بواسطة المعلمات الافتراضية في برنامج step one ويتم التأكد منها من خلال فحص منحنيات التضخيم.

يوضح تضخيم PCR للحمض النووي DNA، والمعزول من أوراق في مواضع مختلفة على طول الساق، ظهور نسخة واحدة من قطعة DNA بحجم 5.7 kilobase، تسمى تسلسل إدخال السلالة، أو LIS one، عندما تُزرع النباتات تحت ظروف تحفيزية. يظهر LIS one عندما يُزرع PL تحت ظروف تحفيزية ذات مغذيات منخفضة ويصبح في النهاية متماثل الزيجوت. هنا، عُزلت عينات الأوراق من واحد إلى ستة على فترات أسبوعية، حيث كانت العينة واحد هي الأبكر بعد البذر، ثم استُخلص DNA من العينات.

يكشف تضخيم PCR عن وجود كلا الطرفين لـ LAS one في جميع العينات باستثناء العينة الأولى. وهذا يتوافق مع اختفاء الموقع المُدرج غير المُدمج وعدم وجود دليل عليه بحلول QPCR للورقة الخامسة. وتظهر النتائج أن وجود LAS one أو التغيرات الجينومية الأخرى المرتبطة بالحث يؤثر على تعبير الجينات الموجودة في الجوار المباشر لـ S one.

إن الجينات الستة الموضحة هنا جميعها تعبر عن نفسها بشكل متفاوت في PL وS؛ حيث أربعة من هذه الجينات ذات تعبير أعلى في pl، التي لا تمتلك LIS one. وعلى العكس من ذلك، فإن جينين يتمتعان بتعبير أعلى في S، التي تمتلك LIS one. لقد عرضنا لكم للتو كيفية زراعة سلالات الكتان القابلة للتحفيز. وبذلك تتغير الجينومات استجابةً لبيئة النمو وخصائص النمو للأجيال اللاحقة.

عند القيام بهذا الإجراء، من المهم تذكر أن ظروف النمو يجب أن تُكرر لضمان تحفيز التغييرات بشكل قابل للتكرار. هذا كل شيء. أعلم أن الكثيرين منكم يشككون في هذه الظاهرة، ولكن يمكنكم الآن إعادة إنتاج هذه الملاحظات بأنفسكم.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.