الآلي Sholl تحليل الصرف متعلق بالخلايا العصبية رقمية على مستويات متعددة

يوضح هذا الفيديو إجراءً لتحليل مورفولوجيا التغصنات والمحاور، والمعروفة مجتمعة باسم الزوائد الشجيرية، باستخدام برنامج شبه مؤتمت من أجل ملاحظة التغيرات الموضعية. أولاً، يُستخدم برنامج neuron J لتتبع صور TIFF ثمانية البتات للعصبونات لتحديد مواقع قطع الزوائد الشجيرية. بعد ذلك، يُستخدم برنامج Neuron studio لتحديد المعلومات البنيوية المتعلقة بالاتصال بين الزوائد الشجيرية.

أخيرًا، يتم تشغيل برنامج bonfire MATLAB لاستخراج البيانات المورفولوجية من الخلايا، بما في ذلك تحليل الـ shoal، بالإضافة إلى عدد نقاط تفرع النيوريتات وأطراف النيوريتات. وتظهر النتائج تغيرات موضعية في مورفولوجيا النيوريت بناءً على أداء تحليل الـ shoal في مناطق فرعية من الشجرة النيوريتية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليل الـ shoal يدويًا، في أن البرنامج شبه مؤتمت، مما يزيد بشكل كبير من كفاءة التحليل ويسمح بمراجعة البيانات للتحقق من دقة التحليل.

سيقوم بتوضيح الإجراء Hirsch AWA، وهو طالب في مرحلة البكالوريوس يعمل في مختبر Firestein خلال فترة الصيف. وبغرض استخدام برنامج bonfire لتحليل الخصائص المورفولوجية لصور Neurites بتنسيق tiff ذات الثمانية بت، يجب الحصول على صور للخلايا العصبية الفردية بعد تحميل برنامج bonfire. كما يجب ضبط إعدادات البرنامج بناءً على دقة الصور التي ترغب في تحليلها؛ ففي جزء معلمات bonfire من البرنامج، استبدل القيمة الحالية للمتغير picks conversion بقيمة دقة الصور الخاصة بك.

من أجل تمكين برنامج bonfire من تحليل البيانات، يجب تنظيم الملفات وفق هيكل محدد، يتضمن مجلداً رئيسياً، ومجلد bonfire الذي يحتوي على ملفات MATLAB M الخاصة ببرنامج bonfire، ومجلدات فرعية تحتوي على كل حالة من الحالات المختلفة، مع وضع ملفات صور الخلايا داخل مجلدات الحالات المختلفة؛ ابدأ بتجهيز الصورة للتتبع. في هذه التجربة، سيتم تتبع التغصنات فقط من أجل تحليل التغيرات في مورفولوجيا التغصنات. ابدأ بتجهيز الصورة للتتبع.

افتح الصورة عن طريق تحديد زر الفتح في شريط أدوات neuron J، ثم اختر الصورة التي ترغب في تتبعها. الآن، قم بتغيير حجم الصورة عن طريق تحديد زر التكبير لضبط السطوع والتباين في الصورة بحيث يمكنك رؤية جميع الزوائد الشجيرية؛ حدد "image" من شريط أدوات neuron J، ثم اختر "adjust brightness contrast". لبدء التتبع، حدد زر "add traces" في شريط أدوات neuron J، ثم قم بالتتبع حول محيط جسم الخلية.

بعد ذلك، اختر زر تتبع الملصقات (label tracings) في شريط أدوات neuron J، وحدد N one من القائمة المنسدلة لمعرّف التتبع (tracing ID)، ثم اختر النوع zero six في نافذة سمات neuron J واضغط على موافق. لبدء تتبع الزوائد الشجيرية، اختر زر إضافة التتبعات (add traces) في شريط أدوات neuron J وأضف تتبعاً على طول كل فرع من الزوائد الشجيرية المستهدفة. ويُفضل أن تتوقف المقاطع التي ترسمها عند كل نقطة تفرع، بحيث يبدأ كل فرع ابنيّ من تلك النقطة كتتبع جديد.

اختر زر حفظ التتبعات (save tracings) في شريط أدوات neuron J، ثم احفظ التتبع الذي أنشأته للتو في المجلد نفسه الذي يحتوي على ملف الصورة الأصلي. بعد ذلك، قم بتصدير ملفات التتبع وملفات معرفات التتبع من neuron J. اختر زر تصدير التتبع (export trace) في شريط أدوات neuron J. الآن، اختر خيار ملفات نصية مفصولة بعلامات جدولة (tab delimited text files) مع ملف منفصل لكل تتبع (separate file for each tracings) من مربع حوار التصدير في neuron J، ثم اختر موافق (okay) للسماح لبرنامج neuron J باختيار أسماء الملفات وموقع الحفظ.

انقر على زر قياسات التتبع (measure tracings) في شريط أدوات neuron J، ثم اختر خيار عرض قياسات التتبع (display tracings measurements) في نافذة قياسات neuron J، وانقر على تشغيل (run). اختر الملف في نافذة تتبعات neuron J، ثم اختر "حفظ باسم" (save as) واحفظ الملف. يجب أن يتطابق اسم الملف تماماً مع اسم ملف الصورة الأصلي، متبوعاً بـ _info، ويجب ألا يحتوي على امتداد ملف مكون من ثلاثة أحرف. تأكد من أن جهاز الكمبيوتر الخاص بك لا يضيف امتداد ملف XLS تلقائياً.

إذا حدث ذلك، يجب حذف امتداد الملف يدويًا. أولاً، قم بإعادة تنظيم المجلدات باستخدام bonfire load عن طريق فتح matlab، والنقر على زر النقاط الثلاث في الزاوية العلوية اليمنى من نافذة الأوامر. حدد مجلد bonfire في المجلد الرئيسي من نافذة تصفح المجلدات، ثم اكتب bonfire load في نافذة الأوامر واضغط على enter.

اختر مجلد الحالة الذي ترغب في تحليله من نافذة "استعراض المجلد" (browse for folder)، ثم حدد "موافق" (Okay). سيؤدي ذلك إلى إعادة تنظيم بنية المجلد عن طريق إنشاء مجلدات فرعية للخلايا تحتوي على جميع البيانات الخاصة بكل خلية على حدة. الآن، ولإنشاء ملفات filename_premium swc، اكتب bonfire_NDF2sWC في نافذة الأوامر واضغط على مفتاح Enter.

حدد مجلد الحالة نفسه الذي تمت إعادة تنظيمه للتو باستخدام bonfire load من نافذة تصفح المجلدات، ثم اختر "موافق". سيؤدي ذلك إلى إنشاء ملف WC في كل مجلد خلية للحالة المختارة. وسيتضمن كل مجلد خلية خمسة ملفات.

صورة TIF الأصلية، وملف NDF، ومعلومات الشرطة السفلية، وملف معرف التتبع، وملف TXT، وملف swc. قبل استخدام Neuron Studio، نوصيك بالتعرف على ميزات البرنامج واختصاراته؛ حيث يتوفر لديهم دليل مستخدم ممتاز عبر الإنترنت، كما أن معرفة اختصارات لوحة المفاتيح ستوفر عليك الكثير من الوقت.

للبدء، افتح برنامج neuron studio واختر "file open" من شريط أدوات neuron studio، ثم ابحث عن صورة TIF الخاصة بالعصبون التي ترغب في تحريرها وقم بفتحها. اختر "run settings" وأدخل القيمة 1 في كل من المربعات الثلاثة.

في نافذة حجم الفوكسل، حدد استيراد ملف s wc. اختر ملف s WC المناسب الذي يطابق الملف الذي ترغب في العمل عليه. سيتم الآن تراكب ملف الصورة مع صورة التتبع.

يجب تغطية جسم الخلية بدائرة حمراء لربط الزوائد الشجرية. استخدم أداة الزوائد الشجرية لربط العقد بحيث لا يمكن لكل نقطة تفرع ممثلة بعقد صفراء أن تنشئ سوى فرعين فقط. يجب أن تكون جميع المسارات مستمرة ومتصلة بجسم الخلية.

لتصدير البيانات من برنامج Neuron Studio، اختر file، ثم save neurites، واحفظ الملف بالاسم الافتراضي للتحقق من وجود أخطاء في ملفات swc؛ اكتب bonfire trace في نافذة الأوامر (command window) ثم اضغط enter. اختر مجلد الحالة الذي يحتوي على البيانات التي تمت معالجتها للتو من نافذة البحث عن المجلد (browse for folder)، ثم اختر okay للتحقق من وجود أي أخطاء في أي من الصور الموجودة في المجلد.

سيقوم البرنامج بإخراج صور توضح موقع الخطأ لاستخراج البيانات المورفولوجية من ملفات dot S WC. اكتب bonfire في نافذة الأوامر ثم اضغط enter. اختر مجلد الحالة الذي ترغب في تحليله من نافذة تصفح المجلدات، ثم اختر okay لكل خلية عصبية مستهدفة.

سيعمل تحليل bonfire على إنشاء رسم بياني لمورفولوجيا العصبونات جنباً إلى جنب مع حلقات الكتف المستخدمة في التحليل. بالإضافة إلى ذلك، سيقوم أمر bonfire بإنشاء ملف MAT يحتوي على جميع المعلومات المورفولوجية التي تم استخلاصها من التحليل. لعرض الرسوم البيانية الأولية لنوع البيانات، أدخل نتائج bonfire في نافذة أوامر MATLAB، ثم حدد مجلد الحالة المراد عرضها في نافذة تصفح المجلدات واضغط على موافق.

ستغلق نافذة تصفح المجلدات مؤقتاً ثم تعيد الفتح للسماح باختيار ظروف إضافية. وبمجرد اختيار الظروف، اختر "إلغاء" (cancel) للخروج من عملية الاختيار. ستعيد نتائج برنامج Bonfire عرض مخططات ملخصة تتضمن البيانات من مجلدات الظروف التي اخترتها؛ ولتصدير البيانات المورفولوجية إلى برنامج Excel، اكتب bonfire Export في نافذة أوامر MATLAB.

حدد مجلد الحالة الذي يحتوي على البيانات التي ترغب في تصديرها من نافذة تصفح المجلدات، ثم اختر "موافق". سيقوم برنامج Bonfire Export بإنشاء ملفات Excel للبيانات المورفولوجية ووضعها في مجلد الحالة الذي تم تحديده. سنعرض لك الآن مثالاً للبيانات التي أنشأها برنامج Bonfire على مجموعة بيانات تحتوي على حالتين.

هذه صور مقلوبة نموذجية لكلتا الحالتين. ويمكن ملاحظة أن الحالة الأولى تحتوي على عدد أكبر من التغصنات مقارنة بالحالة الثانية من خلال هذه الصور. كما يمكن ملاحظة هذه الظاهرة في مجموعة متنوعة من الرسوم البيانية التي يتم إنشاؤها بواسطة برنامج bonfire.

نظراً لأن برنامج bonfire يجري تحليله على مناطق فرعية من الزوائد الشجرية، فإنه يمكن تحديد الزيادة في الزوائد الشجرية في الحالة الأولى بسهولة؛ حيث يُظهر رسم منحنى Sholl لإجمالي الشجرة التغصنية وجود المزيد من الزوائد الشجرية البعيدة عن جسم الخلية في عصبونات الحالة الأولى. كما يُظهر رسم متوسط عدد نقاط التفرع والنقاط النهائية لكل خلية أن الحالة الأولى تحتوي على عدد أكبر من نقاط التفرع والنقاط النهائية مقارنة بالحالة الثانية. ويظهر متوسط عدد الاستطالات لكل خلية للزوائد الشجرية الأولية، والثانوية، والثالثية، أو ذات الرتب الأعلى. هناك المزيد من الزوائد الشجرية الثالثية وذات الرتب الأعلى في الحالة الأولى؛ ويُظهر رسم متوسط عدد الاستطالات لكل خلية للزوائد الشجرية الجذرية، والمتوسطة، والنهائية أن الحالة الأولى تحتوي على استطالات متوسطة أو نهائية أكثر من الحالة الثانية.

تظهر هنا منحنيات تحليل الـ shoal الخاصة بهوية القطع، حيث تم تجميع القطع كقطع أولية أو ثانوية أو ثالثية أو أكثر. وتحدث الزيادة في التشجرات الثالثية في المنطقة البعيدة عن جسم الخلية بالنسبة لعصبونات الحالة الأولى. كما تظهر منحنيات تحليل الـ shoal الخاصة بهوية القطع حيث تم تجميع القطع كقطع جذرية، أو قطع متوسطة، أو قطع طرفية.

تحدث الزيادة في كل من التغصنات البينية والطرفية في الحالة الأولى بعيداً عن جسم الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل shoal باستخدام برنامج bonfire من أجل ملاحظة التغيرات الموضعية في المورفولوجيا العصبية.