الآلي Sholl تحليل الصرف متعلق بالخلايا العصبية رقمية على مستويات متعددة

يوضح هذا الفيديو إجراءً لتحليل مورفولوجيا التغصنات والمحاور العصبية، المعروفة مجتمعة باسم النتوءات العصبية، باستخدام برنامج شبه مؤتمت من أجل رصد التغيرات الموضعية. أولاً، يتم استخدام برنامج neuron J لتتبع صور TIFF ذات 8 بت للخلايا العصبية لتحديد مواقع قطاعات النتوءات العصبية. بعد ذلك، يُستخدم برنامج Neuron studio لتحديد المعلومات الهيكلية حول الاتصال بين النتوءات العصبية.

أخيرًا، يتم تشغيل برنامج bonfire MATLAB لاستخراج البيانات المورفولوجية من الخلايا، بما في ذلك تحليل السرب (shoal analysis)، بالإضافة إلى عدد نقاط تفرع النوريتات وأطراف النوريتات. وتظهر النتائج تغيرات موضعية في مورفولوجيا النوريتات بناءً على أداء تحليل السرب في مناطق فرعية من التشجر العصبي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تحليل السرب يدويًا، في أن البرنامج شبه مؤتمت، مما يزيد بشكل كبير من كفاءة التحليل ويسمح بمراجعة البيانات للتحقق من دقة التحليل.

سوف تقوم الطالبة الجامعية في برنامج AWA، هيرش، والتي تعمل في مختبر فايرستاين خلال فصل الصيف، بشرح الإجراء. من أجل استخدام برنامج bonfire لتحليل الخصائص المورفولوجية لصور Neurites بصيغة tiff ذات 8 بت، يجب الحصول على صور للخلايا العصبية الفردية بعد تحميل برنامج bonfire. كما يجب ضبط إعدادات البرنامج بناءً على دقة الصور التي ترغب في تحليلها؛ ففي جزء معلمات bonfire من البرنامج، استبدل القيمة الحالية للمتغير picks conversion بقيمة دقة الصور الخاصة بك.

من أجل قيام bonfire بتحليل البيانات، يجب تنظيم الملفات وفق بنية محددة، تشمل مجلدًا رئيسيًا، ومجلد bonfire الذي يحتوي على ملفات bonfire MATLAB M، ومجلدات فرعية تحتوي على كل حالة من الحالات المختلفة، وتوضع ملفات صور الخلايا داخل مجلدات الحالات المختلفة؛ ابدأ بتجهيز الصورة لعملية التتبع. في هذه التجربة، سيتم تتبع التغصنات فقط لتحليل التغيرات في مورفولوجيا التغصنات. ابدأ بتجهيز الصورة لعملية التتبع.

افتح الصورة عن طريق تحديد زر الفتح (open) في شريط أدوات Neuron J، ثم اختر الصورة التي ترغب في تتبعها. الآن، قم بتغيير حجم الصورة من خلال تحديد زر التكبير (maximize) لضبط سطوع وتباين الصورة بحيث يمكنك رؤية جميع الزوائد الشجيرية (Neurites)؛ اختر "صورة" (image) من شريط أدوات Neuron J، ثم اختر "ضبط السطوع والتباين" (adjust brightness contrast). لبدء التتبع، حدد زر "إضافة مسارات" (add traces) في شريط أدوات Neuron J، ثم قم بالتتبع حول محيط جسم الخلية.

بعد ذلك، حدد زر "label tracings" في شريط أدوات NeuronJ، واختر "N one" من القائمة المنسدلة لـ "tracing ID"، ثم حدد النوع "zero six" في نافذة "neuron J attributes" واضغط على "Okay". لبدء تتبع الزوائد الشجيرية، حدد زر "add traces" في شريط أدوات NeuronJ وأضف تتبعاً على طول كل فرع من الزوائد الشجيرية المراد دراستها. ويُفضل أن تتوقف المقاطع التي ترسمها عند كل نقطة تفرع، بحيث يبدأ كل فرع ابني من تلك النقطة كتتبع جديد.

حدد زر حفظ التتبعات (save tracings) في شريط أدوات neuron J، واحفظ التتبع الذي أنشأته للتو في المجلد نفسه الذي يحتوي على ملف الصورة الأصلي. بعد ذلك، قم بتصدير ملفات التتبع وملفات معرفات التتبع من neuron J. حدد زر تصدير التتبع (export trace) في شريط أدوات neuron J. الآن، حدد خيار "ملفات نصية محددة بعلامات تبويب - ملف منفصل لكل تتبع" (tab delimited text files separate file for each tracings) من مربع حوار التصدير في neuron J، ثم اختر موافق (okay) للسماح لبرنامج neuron J باختيار أسماء الملفات وموقع الحفظ.

حدد زر "measure tracings" في شريط أدوات neuron J، ثم اختر خيار "display tracings measurements" من نافذة قياسات neuron J واضغط على "run". حدد "Select file" في نافذة تتبع neuron J، ثم اختر "save as" واحفظ الملف. يجب أن يتطابق اسم الملف تماماً مع اسم ملف الصورة الأصلي، متبوعاً بـ "_info"، ويجب ألا يحتوي على امتداد ملف مكون من ثلاثة أحرف. تأكد من أن جهاز الكمبيوتر الخاص بك لا يضيف امتداد ملف XLS تلقائياً.

إذا حدث ذلك، يجب حذف امتداد الملف يدويًا. أولاً، قم بإعادة تنظيم المجلدات باستخدام bonfire load عن طريق فتح matlab، والنقر فوق زر النقاط الثلاث في الزاوية العلوية اليمنى من نافذة الأوامر. حدد مجلد bonfire في المجلد الرئيسي الخاص بك من نافذة استعراض المجلدات، ثم اكتب bonfire load في نافذة الأوامر واضغط على enter.

حدد مجلد الحالة الذي ترغب في تحليله من نافذة تصفح المجلد، ثم اختر "موافق". سيؤدي ذلك إلى إعادة تنظيم بنية المجلد عن طريق إنشاء مجلدات فرعية للخلايا تحتوي على جميع البيانات الخاصة بكل خلية على حدة. والآن، لإنشاء ملفات filename_premium.swc، اكتب bonfire_NDF2swc في نافذة الأوامر واضغط على Enter.

حدد مجلد الحالة نفسه الذي تمت إعادة تنظيمه للتو باستخدام bonfire load في نافذة تصفح المجلدات، ثم اختر موافق. سيؤدي ذلك إلى إنشاء ملف WC في كل مجلد خلية للحالة المختارة. وسيحتوي كل مجلد خلية على خمسة ملفات.

صورة TIF الأصلية، وملف NDF، ومعلومات الشرطة السفلية (underscore info)، وملف معرف التتبع، وملف TXT، وملف swc. قبل استخدام برنامج Neuron Studio، نوصي بأن تتعرف على ميزات البرنامج واختصاراته. يتوفر لديهم دليل مستخدم ممتاز عبر الإنترنت، كما أن معرفة اختصارات لوحة المفاتيح ستوفر عليك الكثير من الوقت.

للبدء، افتح برنامج neuron studio واختر file open من شريط أدوات neuron studio، ثم ابحث عن صورة TIF الخاصة بالعصبون المراد تحريره وقم بفتحها. اختر run settings وأدخل القيمة 1 في كل من المربعات الثلاثة.

في نافذة حجم الفوكسل (voxel size)، اختر استيراد ملف s wc. حدد ملف s WC المناسب الذي يتوافق مع الملف الذي تريد العمل عليه. سيتم الآن تراكب ملف الصورة مع صورة التتبع.

يجب تغطية جسم الخلية بدائرة حمراء لربط الزوائد الشجيرية. استخدم أداة الزوائد الشجيرية لربط العقد بحيث لا يمكن لكل نقطة تفرع ممثلة بعقد صفراء أن تنشئ سوى فرعين فقط. يجب أن تكون جميع التتبعات متصلة بجسم الخلية.

لتصدير البيانات من Neuron Studio، اختر file، ثم save neurites، واحفظ الملف بالاسم الافتراضي للتحقق من وجود أخطاء في ملفات swc عن طريق كتابة bonfire trace. تحقق من نافذة الأوامر واضغط enter. اختر مجلد الحالة الذي يحتوي على البيانات التي تمت معالجتها للتو من نافذة browse for folder، ثم اختر okay إذا كانت هناك أي أخطاء في أي من الصور الموجودة في المجلد.

سيقوم البرنامج بإخراج صور توضح مكان وجود الخطأ لاستخراج البيانات المورفولوجية من ملفات dot S WC. اكتب bonfire في نافذة الأوامر واضغط enter. حدد مجلد الحالة الذي تريد تحليله من نافذة تصفح المجلدات (browse for folder)، ثم اختر موافق (okay) لكل عصبون من الأعصاب المراد دراستها.

سيعمل تحليل bonfire على إنشاء رسم بياني لمورفولوجيا العصبونات جنباً إلى جنب مع حلقات الكتف (shoulder rings) المستخدمة في التحليل. بالإضافة إلى ذلك، سيقوم أمر bonfire بإنشاء ملف MAT يحتوي على جميع المعلومات المورفولوجية التي تم استخراجها من التحليل. لعرض الرسوم البيانية الأولية لنوع البيانات، اكتب bonfire في نافذة أوامر MATLAB، ثم اختر مجلد الحالة المراد عرضها من نافذة تصفح المجلدات (browse for folder) واضغط على Okay.

ستغلق نافذة استعراض المجلد مؤقتاً ثم تعاد فتحها للسماح باختيار شروط إضافية. وبمجرد اختيار الشروط، اختر "إلغاء" للخروج من عملية الاختيار. ستعرض نتائج برنامج Bonfire مخططات ملخصة تتضمن البيانات من مجلدات الشروط التي اخترتها؛ ولتصدير البيانات المورفولوجية إلى برنامج Excel، اكتب bonfire Export في نافذة أوامر MATLAB.

حدد مجلد الحالة الذي يحتوي على البيانات التي ترغب في تصديرها من نافذة تصفح المجلدات ثم اختر "موافق". سيقوم برنامج bonfire export بإنشاء ملفات Excel للبيانات المورفولوجية ووضعها في مجلد الحالة الذي تم اختياره. سنعرض لكم الآن مثالاً للبيانات التي أنشأها برنامج bonfire على مجموعة بيانات تحتوي على حالتين.

هذه صور معكوسة نموذجية لكلا الحالتين. ويمكن ملاحظة أن الحالة الأولى تحتوي على عدد أكبر من التغصنات مقارنة بالحالة الثانية من خلال هذه الصور. كما يمكن ملاحظة هذه الظاهرة في مجموعة متنوعة من الرسوم البيانية التي يتم إنشاؤها بواسطة برنامج bonfire.

نظراً لأن برنامج bonfire يجري تحليله على مناطق فرعية من التغصنات، فمن السهل تحديد الزيادة في التغصنات في الحالة الأولى؛ حيث يظهر رسم منحنى شول (sholl curve) للمجموع الكلي للشجرة التغصنية وجود المزيد من التغصنات البعيدة عن جسم الخلية في عصبونات الحالة الأولى. كما يظهر رسم متوسط عدد نقاط التفرع والنقاط الطرفية لكل خلية أن الحالة الأولى تحتوي على عدد أكبر من نقاط التفرع والنقاط الطرفية مقارنة بالحالة الثانية. ويوضح متوسط عدد الزوائد لكل خلية بالنسبة للتغصنات الأولية أو الثانوية أو الثالثية أو ذات الرتب الأعلى؛ حيث توجد تغصنات من الرتبة الثالثة أو رتب أعلى بشكل أكبر في الحالة الأولى. كما يظهر رسم متوسط عدد الزوائد لكل خلية بالنسبة للتغصنات الجذرية والوسطية والطرفية أن الحالة الأولى تمتلك زوائد وسطية أو طرفية أكثر من الحالة الثانية.

تظهر هنا منحنيات تحليل الـ shoal المحددة لهوية القطع، حيث تم تجميع القطع كقطع أولية، أو ثانوية، أو ثالثية أو أكثر. وتحدث الزيادة في التشجرات الثالثية في المناطق البعيدة عن جسم الخلية بالنسبة للعصبونات في الحالة الأولى. كما تظهر منحنيات تحليل الـ shoal المحددة لهوية القطع حيث تم تجميع القطع كقطع جذرية، أو قطع وسيطة، أو قطع طرفية.

تحدث الزيادة في كل من التغصنات البينية والطرفية في الحالة الأولى في المنطقة البعيدة عن جسم الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل sholl باستخدام برنامج bonfire من أجل ملاحظة التغيرات الموضعية في المورفولوجيا العصبية.