الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار سهولة أداء اللطخة الغربية عند استخدام المنتجات المناسبة. بعد تحضير العينة ، يتم فصل البروتينات بناء على الحجم ثم نقلها إلى مرحلة صلبة. ثم يتم فحص البروتينات بالأجسام المضادة والكشف عن استخدام البروتوكولات المناسبة والكواشف عالية الجودة والفعالة من حيث التكلفة تنتج نتائج نشاف غربية محسنة.

مرحبا ، أنا جيسي لوهان ، عالم البحث والتطوير في EMD Chemicals في سان دييغو ، كاليفورنيا. EMD هي شركة تابعة لشركة Merck ، KGAA في دارم ستاتي ألمانيا. سنعرض لك اليوم إجراء النشاف الغربي.

لذلك دعونا نبدأ. الخطوة الأولى في النشاف الغربي هي تحضير العينة. ابدأ في تحضير العينة عن طريق تكوير الخلايا باستخدام الطرد المركزي منخفض السرعة مثل خمس دقائق عند 2 ، 500 مرة من الجاذبية.

بعد الطرد المركزي ، قم بتصريف كريات الخلية. حسنا ، قم بإعادة تعليق الخلايا في كاشف استخراج البروتين cyto buster باستخدام 150 ميكرولتر لكل 10 إلى الخلايا الست. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتدوير العينة لمدة خمس دقائق عند 16،000 مرة من الجاذبية عند أربع درجات مئوية بعد الطرد المركزي. انقل SNA الذي تم تطهيره إلى أنبوب جديد وتابع التحليل. بعد تقييم تركيز البروتين في العينة ، قم بإعداد العينة لتحميل الجل لتغيير طبيعة البروتين.

استخدم عينة عازلة تحتوي على منظف تغيير طبيعة الأونيك مثل كبريتات زيت الصوديوم أو SDS. اغلي الخليط على حرارة 95 إلى 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام بروتينات هلام مسبقة الصب متوفرة تجاريا يمكن فصلها بسرعة بناء على الوزن الجزيئي.

املأ وحدة الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت قيد التشغيل ، والذي يمكن تصنيعه من الكواشف المقدمة من خلال الخط الكيميائي Omni PU. قم بتحميل الممر الأول من البئر بعلامة بروتين خلط. تحتوي هذه العلامة على ثلاثة نطاقات مرجعية تسمح بالمراقبة أثناء الرحلان الكهربائي.

بمجرد تلطيخ الجل ، تظهر 10 أشرطة ، تتراوح من 10 إلى 225 كيلو دالتون. قم بتحميل العينة المشوهة في الآبار المتبقية. قم بتشغيل الجل بجهد 220 فولت لمدة ساعة واحدة.

بمجرد انفصال البروتينات ، قم بتلطيخ الجل باللون الأزرق كوماسي للتأكد من أن البروتينات قد هاجرت بشكل متساو وموحد باستخدام صبغة سريعة وبقع فائقة الحساسية ، وهي جاهزة للاستخدام بدون DS. التلوين مطلوب تماما كما يمكن تحفيز البروتينات ذات الشحنة الكهربائية على الانتقال عبر هلام في مجال كهربائي ، لذلك يمكن نقل البروتينات في مجال كهربائي من الجل إلى غشاء مثل النيتروسليلوز أو PVDF. عند استخدام أغشية PVDF ، انقع الغشاء في الميثانول لبضع دقائق ، متبوعا بالتوازن في مخزن مؤقت لنقل البرودة المثلجة لمدة خمس دقائق. نقع الجل أيضا لبضع دقائق في المخزن المؤقت لنقل المثلج البارد E يمنع التوازن انكماش الجل أثناء النقل.

للنقل الرطب ، قم بتجميع شطيرة من الجل والغشاء بين الإسفنج والورق. ثم قم بتثبيت التجميع معا بإحكام بعد التأكد من عدم تشكل فقاعات هواء بين الجل والغشاء. اغمر الساندويتش في عازلة النقل وقم بتطبيق مجال كهربائي.

ستنتقل البروتينات سالبة الشحنة نحو القطب الموجب الشحنة. ثم يوقفهم الغشاء ويربطهم ويمنعهم من الاستمرار. بمجرد اكتمال النقل ، تصور البروتينات لضمان النقل المتساوي بدون جيوب هوائية.

يمكن القيام بذلك بسهولة باستخدام بقعة لطخة غربية من التنبيه الأحمر. هذه البقعة جاهزة للاستخدام ويمكن إزالة التلطيخ بسهولة بالماء. هذا هو الجل بمجرد احتجازه عن طريق غسله بالماء قبل إثبات وجود الغشاء بجسم مضاد ، يتم حظر الغشاء.

لمنع الارتباط غير المحدد ، قم بسد الغشاء بكواشف حجب عالية الجودة. لتجنب زيادة الخلفية عن طريق احتضانها في محلول حجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تحت تحريض لطيف ، ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST أو PBST بعد الحضانة. يمكن صنع هذه المخازن المؤقتة بسهولة ويسر باستخدام أقراص TBS tween وأقراص PBS tween على التوالي.

بمجرد حظر الغشاء وغسله ، يمكن تحضنه بالجسم المضاد الأساسي. قم بتطبيق الجسم المضاد الأساسي باستخدام محلول ، وهو أحد معززات الإشارة ، مما يسمح بتحسين الإشارة بشكل كبير. تحضير الجسم المضاد الأساسي في المحلول الأول واحتضان الغشاء لمدة ساعة واحدة.

ليست هناك حاجة لإضافة المزيد من عوامل الحظر بعد الحضانة. اغسل الغشاء باستخدام TBST. بعد ذلك ، احتضان الغشاء بالجسم المضاد الثانوي المخفف في المحلول الثاني من تعزيز الإشارة لمدة ساعة واحدة.

أخيرا ، اغسل الغشاء مرة أخرى عدة مرات باستخدام TBST لHRP المترافق. يستخدم اكتشاف الأجسام المضادة الثانوية عن طريق التلألؤ الكيميائي المعزز أو ECL تقليديا هنا. يتم استخدام الخطوة السريعة لكاشف ECL لأنها لا تتطلب خلطا من اللومينول أو المحسن.

ما عليك سوى رش الغشاء عدة مرات ، واحتضانه لمدة دقيقتين ، وتطويره باستخدام فيلم الأشعة السينية. يوفر Rapid Step حساسية منخفضة للبيكوغرام بالإضافة إلى مهمة أخف لمدة تصل إلى ساعتين بعد إضافة الركيزة. تسمح علامات البروتين Trail mix بتتبع البروتين أثناء الرحلان الكهربائي عند مقارنتها ببروتوكولات اللطخة الغربية القياسية.

يسمح Signal Boost بنطاق ديناميكي وحساسية أكبر. أخيرا ، يمكن الحصول على حساسية فائقة باستخدام الخطوة السريعة بدلا من كواشف ECL التقليدية. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء التعمية الغربية بكفاءة وفعالية من حيث التكلفة مع مجموعة شاملة من المنتجات.

تذكر أن جودة نتائجك تعتمد على جودة الكواشف الخاصة بك. هذا هو. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.