Name: الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: تعلم تقنية Western blotting لتحليل البروتينات في عينات الأنسجة باستخدام بروتوكولات موثوقة. تُظهر هذه الطريقة أهمية جودة المواد الكيميائية للحصول على نتائج دقيقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. تحضير العينة الخطوة الأولى في غرب النشاف هو إعداد العينة. لإعداد العينات لتشغيل الخلايا والأنسجة هلام يلزم lysed للافراج عن بروتينات الفائدة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومريحة ، والجاهزة للاستخدام كاشف التي هي متعددة وسهلة الاستخدام لاستخراج البروتين غير قابلة للذوبان أو CytoBuster PhosphoSafe. تحتوي هذه المخازن استخراج المنظفات الأمثل لكفاءة الاستخلاص من البروتينات القابلة للذوبان من خلايا الثدييات والحشرات. لطيف ، غير الأيونية تكوين البروتين CytoBuster الكاشف استخراج تمكن من العزلة الذاتية الفعالة وظيفيا أو البروتينات وأعرب دون الحاجة إلى المعالجة الثانوية مثل صوتنة أو تجميد / الذوبان. PhoshoSafe له فائدة اضافية لاحتواء مثبطات الفوسفاتيز الأربعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي سرعة منخفضة (على سبيل المثال 5 دقائق في 2500 XG) ، بيليه الخلية استنزاف جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في البروتين CytoBuster باستخدام الكاشف استخراج 150 ميكرولتر في الخلايا 6 10 (المبلغ الأمثل للبروتين CytoBuster الكاشف استخراج قد تختلف استنادا إلى حجم الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب مناسبة وتدور لمدة 5 دقائق في XG 16000 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح نقل طاف (استخراج الخلايا) إلى أنبوب جديد والمضي قدما في التحليل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخراج البروتين المتخصصة ، ونحن نوصي باستخدام لدينا عالية الجودة أطقم ProteoExtract. EMD ما يزيد على اثني عشر مجموعات لعزل الميتوكوندريا ، التحت خلوية استخراج بروتيوم ، عبر الغشاء استخراج البروتين ، وغيرها الكثير. يرجى زيارتنا لطخة غربية الصفحة المقصودة لمزيد من التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EMD تبيع أيضا تشكيلة واسعة من مجموعات البروتيني والفوسفاتيز كوكتيل المانع. حالما يحدث تحلل ، التحلل البروتيني ، ونزع الفسفات تمسخ تبدأ. يمكن أن تكون هذه الأحداث باستمرار تباطأ بشكل كبير إذا ما حافظت على عينات من الجليد أو عند 4 درجة مئوية تضاف في كل الأوقات ومثبطات مناسبة جديدة للتحلل العازلة. يرجى زيارتنا لطخة غربية الصفحة المقصودة لمزيد من التفاصيل. </li></ul> 2. SDS - PAGE الخطوة الثانية في غرب النشاف هو فصل البروتين. يتم فصل البروتينات على أساس الوزن الجزيئي. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكنك جعل الصفحة الخاصة بك هلام ، ولكن سنكون باستخدام تجاريا مسبقة الصنع هلام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إعداد نموذج الخاص بك ، كنت على استعداد لتحديد تركيز البروتين. EMD ومجموعتين لهذا لقياس التركيز ، واحد يجري الفحص البروتين عدم التدخل كيت والآخر يجري الفحص البروتين BCA كيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم تقييم تركيز البروتين نحن مستعدون لإعداد نموذج لدينا لتحميل الجل. الأضداد تعترف عادة جزء صغير من البروتين من الفائدة (ويشار إليه حاتمة) وهذا المجال قد تتواجد داخل التشكل 3D من البروتين. لتمكين وصول الأجسام المضادة لهذا الجزء من الضروري أن تتكشف البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتفسد ، واستخدام العازلة تحميل مع أنيوني كبريتات الصوديوم المنظفات تغيير طبيعة دوديسيل (SDS) ، ويغلي الخليط في 95-100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وجود مخزن مؤقت التحميل سهلة ومريحة لاستخدام الاحتياطي 4X هو نموذج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل المسار الأول من البئر مع تريل ميكس ماركر البروتين. وهذه العلامة المرجع العصابات الثلاث التي تسمح لك لرصد الكهربائي. عندما اتسخت الجل ، والعصابات 10 مرئية تتراوح 10-225 كيلو دالتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سد الوحدة الكهربائي مع تشغيل العازلة. لPAGE المواد الهلامية ، وهذا هو عادة تريس 1X - جليكاين. العازلة عن وصفات مفصلة ، يمكنك زيارة صفحة الغربية النشاف. EMD عروض عالية الجودة مخازن الكواشف الكيماوية مع خطنا OmniPur. تشغيل في هلام 220V لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في البروتينات وفصلها ، وصمة عار مع الجل الأزرق Coomassie لضمان البروتينات هاجروا بالتساوي وبشكل موحد. RAPIDstain هو وصمة عار فائقة الحساسية التي هي جاهزة للاستخدام. ليس هناك حاجة destaining. </li></ul> 3. نقل البروتين تماما كما يمكن أن يتسبب البروتينات مع شحنة كهربائية من خلال السفر إلى هلام في حقل الكهرباء ، بحيث يمكن نقل البروتينات في مجال كهربائي من الجل على غشاء ، ويجري إما PVDF أو النيتروسليلوز. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم سوف نقوم بنقل الرطب. في مجال نقل الرطب ، وتقع الجل والغشاء بين الإسفنج ورقة (الاسفنج / ورقة / هلام / غشاء / ورقة / الاسفنج) ، وفرضت جميع بإحكام معا بعد التأكد من أي فقاعات هواء شكلت بين جل والأغشية. الغارقة في شطيرة في نقل العازلة التي يتم تطبيق حقل كهربائي. البروتينات المشحونة سلبا السفر نحو القطب المشحون إيجابيا ، ولكن توقف عن غشاء لهم ، يربط بينها ، ويمنعها من الاستمرار في. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوعان من الأغشية متوفرة : النيتروسليلوز وPVDF. تعمل بشكل جيد على حد سواء. اليوم سنكون باستخدام PVDF. الأغشية PVDF تتطلب تمرغ في methanoل لبضع دقائق ، ثم نقل العازلة الجليد البارد لمدة 5 دقائق. الجل يحتاج أيضا للتوازن لبضع دقائق في نقل العازلة الجليد الباردة. قد لا تفعل ذلك تقليص هلام أثناء النقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخزن المؤقت لنقل الرطب 1X تريس - جليكاين مع الميثانول 20 ٪. استعدادات مفصلة العازلة متاحة على موقعنا على الانترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال عملية النقل ، انها فكرة جيدة لرؤية البروتينات لضمان نقل حتى مع عدم وجود جيوب الهواء. ويمكن بسهولة أن يتم ذلك مع RedAlert الغربية وصمة عار وصمة عار. هذه وصمة عار على استعداد للاستخدام ويمكن القيام به بسهولة مع destaining المياه. </li></ul> 4. الأجسام المضادة والكواشف ملحقة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة الأولى في التحقيق والقيام على الضد مستضد هو كتلة الغشاء. حظر يمنع الغشاء غير محددة وملزمة الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام إما منزوع الدسم أو اللبن BSA كحل حظر. ومع ذلك ، عند استخدام الفوسفات محددة الأجسام المضادة ، فمن غير المستحسن استخدام الحليب لأنه سيتسبب في ارتفاع الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EMD عدة عروض عالية الجودة الكواشف حظر ، بما في ذلك SeaBlock ، وهو عامل غير الثدييات الحجب وQuickBlocker BLOT ، الذي يعد وجاهزة للاستخدام عامل محصر. لدينا أيضا عالية الجودة BSA (V الكسر) متوفرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات في TBST أو PBST بعد الحضانة. طريقة سهلة ومريحة لجعل TBST أو PBST هو استخدام أقراص لدينا (PBS توين أقراص / أقراص TBS توين) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم حظر الغشاء ، كنت على استعداد لاحتضان مع الأجسام المضادة الأولية. وقد تقدم EMD مجموعة شاملة من الأضداد استثنائية ، وأفضل ضمانة للأجسام المضادة في هذه الصناعة لأكثر من 30 عاما. تذكر أن مع كل الأضداد EMD ، ونحن نقدم كامل 100 ٪ لا يوجد ضمان للخطر. شراء الأضداد واستخدامها لأية خصوصية الأنواع أو التطبيق الذي يرغبه. إذا كان الضد لا يعمل بشكل يرضيك ، فإننا سوف توفر الائتمان الكامل ليتم استخدامه على أي منتج آخر. لمزيد من التفاصيل ، يرجى زيارة صفحة الويب النشاف الغربية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم سنكون احتضان الضد لدينا الأولية باستخدام حل 1 من SignalBoost. SignalBoost هو منتج كبير السماح تعزيز إشارة إلى حد كبير. ببساطة احتضان الضد الخاص الأساسي في الحل (1) ويحضن لمدة 1 ساعة أو كما تفعل عادة. ليست هناك حاجة لإضافة المزيد من عوامل عرقلة. بدلا من ذلك ، يمكنك استخدام جيش صرب البوسنة أو غير دهن الحليب الجاف كعامل حظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع TBST. نجعل TBST باستخدام - الجاهزة للقرص TBST حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الضد الخاص به حل الثانوية 2 من SignalBoost. احتضان الجسم المضاد الثانوي في حجب العازلة لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء مرة أخرى عدة مرات مع TBST. </li></ol></li></ul> 5. كشف HRP عن الأجسام المضادة الثانوية التصريف ، يستخدم عادة ECL. وكاشف ممتازة ECL نقدمها هي RapidStep. مزايا RapidStep هي أنه لا يلزم من الاختلاط أو محسن اللمعية. رذاذ ببساطة الغشاء بضع مرات ، وتطوير استخدام الأشعة السينية الفيلم. RapidStep عروض حساسية منخفضة فضلا عن الرسم التخطيطي للضوء ينبعث منها لمدة تصل إلى 2 ساعة بعد إضافة الركيزة.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

ويعمل في كتاب اسلامي وآنا لوجان جيسي EMD من قبل شركة كيماويات التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المادة.

في هذا العرض الفيديو ، فقد أبرزنا الخطوات الرئيسية في غرب النشاف التي هي إعداد العينات ، SDS - PAGE ، غشاء حجب / التحقيق مع الأجسام المضادة ، والكشف. لكل خطوة من العملية ، يجب استخدام البروتوكولات المناسبة والكواشف المناسبة لتحقيق نتائج عالية الجودة.

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; كاشف استخلاص البروتين</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; كاشف الاستخلاص</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;ألف-أرتباط=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>مقايسة البروتين غير المتداخلة&amp;#8482; طقم الاختبار</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;أدخل الرابط هنا&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>طقم مقايسة بروتين BCA </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;أو تصفح الرابط&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;أداة الارتباط التشعبي (a href=)&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>محلول عازل لعينات SDS بتركيز 4X </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>مزيج المكسرات والفواكه المجففة&amp;#8482; مؤشرات البروتين</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;أداة نقل البروتينات (اللطخة الغربية)&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>بروتين&amp;#8211;مستخلص&amp;#8482; أطقم استخلاص البروتين</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;مستخلص&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;مستخلص&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;أداة الربط التشعبي (a href=)&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;مستخلص&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;مستخلص&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; المنتجات</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; الكاشف</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;أداة الربط التشعبي (a href=)&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;رابط لـ&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; صبغة لطخة ويسترن بتركيز 10X</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;رابط لـ&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;أداة ربط تشعبية (href=)&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; الكاشف، بلازما السلمون</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;أداة الربط التشعبي (a href=)&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;أداة الربط التشعبي (a href=)&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>كاشف BLOT-QuickBlocker</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;أضف رابطاً إلى&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ألبومين مصل بقري، جزء V</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;رابط لـ&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;لطخة وسترن (Western blotting) هي تقنية تحليلية تُستخدم للكشف عن بروتينات محددة في عينة معينة من متجانس الأنسجة أو مستخلصاتها. وتعتمد هذه التقنية على الرحلان الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية أو الممسوخة بناءً على طول البوليببتيد (في ظروف الممسوخة) أو بناءً على البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين (في الظروف الطبيعية/غير الممسوخة). بعد ذلك، تُنقل البروتينات إلى غشاء (عادةً ما يكون من النيتروسليلوز أو PVDF)، حيث يتم سبرها (الكشف عنها) باستخدام أجسام مضادة متخصصة بالبروتين المستهدف.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>محلول PBS-TWEEN&amp;#174; أقراص</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>محلول TBS-TWEEN&amp;#174; أقراص</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>سجنال بوست (SignalBoost)&amp;#8482; طقم تعزيز التفاعل المناعي</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;أداة الربط التشعبي (a href=)&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; كاشف ECL</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;أداة الربط التشعبي (a href=)&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

النشاف الغربي هو أسلوب التحليل المستخدمة للكشف عن بروتينات معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج. ويستخدم الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الأصلي أو التشويه والتحريف من طول ببتيد (شروط تغيير طبيعة) أو عن طريق هيكل 3 - D من البروتين (أصلي / عدم تغيير طبيعة الظروف). ثم يتم نقل البروتينات إلى غشاء (عادة النيتروسليلوز أو PVDF) ، حيث يتم بحث (الكشف) باستخدام أجسام مضادة محددة للبروتين الهدف.

النشاف الغربي هو أسلوب التحليل المستخدمة للكشف عن بروتينات معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج.

تعد طريقة "لطخة ويسترن" (Western blotting) تقنية تحليلية تُستخدم للكشف عن بروتينات محددة في عينة معينة من متجانس الأنسجة أو مستخلصاتها. وتعتمد هذه التقنية على استخدام الهلام...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح سهولة إجراء تحليل لطخة ويسترن (Western blot) عند استخدام المنتجات المناسبة. فبعد تحضير العينات، يتم فصل البروتينات بناءً على الحجم ثم تُنقل إلى طور صلب. بعد ذلك، يتم فحص البروتينات باستخدام أجسام مضادة وكشفها، حيث يؤدي استخدام البروتوكولات المناسبة والكواشف عالية الجودة وذات التكلفة الفعالة إلى تحسين نتائج تحليل لطخة ويسترن.أهلاً بكم، أنا جيسي لوهان، باحث في قسم البحث والتطوير في شركة EMD Chemicals في سان دييغو، كاليفورنيا. شركة EMD هي شركة تابعة لشركة Merck, KGAA في دارمشتات بألمانيا. سنعرض لكم اليوم إجراء تحليل اللطخة الغربية (western blotting).لنبدأ الآن. الخطوة الأولى في عملية اللطخة الغربية (western blotting) هي تحضير العينة. ابدأ تحضير العينة عن طريق تجميع الخلايا في شكل كريسالة باستخدام طرد مركزي منخفض السرعة، مثل خمس دقائق عند 2,500 ×g.بعد عملية الطرد المركزي، قم بتصريف الرواسب الخلوية. أعد تعليق الخلايا جيداً في كاشف استخلاص البروتين cyto buster باستخدام 150 µL لكل 10⁶ خلية. احضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.بعد ذلك، قم بطرد العينة مركزياً لمدة خمس دقائق عند 16,000 ×g في درجة حرارة 4 °C. انقل الـ SNA المصفى إلى أنبوب جديد وابدأ في التحليل. بعد تقييم تركيز البروتين في العينة، قم بتحضير العينة لتحميلها على الهلام بغرض تغيير طبيعة البروتين.استخدم محلولاً منظماً للعينات يحتوي على منظف مسخ أيوني مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم أو SDS. اغْلِ الخليط عند درجة حرارة 95 إلى 100 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. وباستخدام هلام مسبق الصب متاح تجارياً، يمكن فصل البروتينات بسرعة بناءً على الوزن الجزيئي.املأ وحدة الفصل الكهربائي بمحلول التشغيل المنظم، والذي يمكن تحضيره من الكواشف المتوفرة ضمن خط المواد الكيميائية Omni PU. قم بتحميل الحارة الأولى من البئر بعلامة بروتينية مرجعية (trail mix protein marker). تحتوي هذه العلامة على ثلاثة نطاقات مرجعية تسمح بالمراقبة أثناء عملية الفصل الكهربائي.بمجرد صبغ الهلام، تظهر 10 حزم تتراوح أحجامها بين 10 و 225 kilo Daltons. قم بتحميل العينة الممسوخة في الآبار المتبقية. قم بتشغيل الهلام عند 220 فولت لمدة ساعة واحدة.بمجرد فصل البروتينات، قم بصبغ الهلام بصبغة Coomassie blue للتأكد من أن البروتينات قد هاجرت بشكل متساوٍ ومنتظم باستخدام الصبغ السريع والصبغ فائق الحساسية، وهو جاهز للاستخدام دون الحاجة لـ DS. الصبغ ضروري لأن البروتينات ذات الشحنة الكهربائية يمكن تحفيزها للانتقال عبر الهلام في مجال كهربائي، وبذلك يمكن نقل البروتينات في مجال كهربائي من الهلام إلى غشاء مثل NITROCELLULOSE أو PVDF. عند استخدام أغشية PVDF، اغمر الغشاء في الميثانول لبضع دقائق، يليه موازنة في محلول نقل منظم بارد جداً (في الثلج) لمدة خمس دقائق. قم أيضاً بنقع الهلام لبضع دقائق في محلول نقل منظم بارد جداً؛ حيث تمنع هذه الموازنة انكماش الهلام أثناء عملية النقل.لإجراء عملية النقل الرطب، قم بتجميع "ساندوتش" يتكون من الهلام والغشاء بين الإسفنج والورق. ثم قم بتثبيت المجموعة معاً بإحكام بعد التأكد من عدم تكون فقاعات هوائية بين الهلام والغشاء. اغمر المجموعة في محلول النقل ثم قم بتطبيق مجال كهربائي.ستنتقل البروتينات سالبة الشحنة باتجاه القطب الكهربائي الموجب. بعد ذلك، تعمل الغشاء على إيقافها وربطها ومنعها من مواصلة التحرك. وبمجرد اكتمال عملية النقل، يتم تصوير البروتينات للتأكد من حدوث نقل متسق دون وجود فقاعات هوائية.يمكن القيام بذلك بسهولة باستخدام صبغة red alert لتقنية Western blot. هذه الصبغة جاهزة للاستخدام، ويمكن إزالة الصبغة بسهولة باستخدام الماء. يظهر هنا الجل بعد إزالة الصبغة منه عن طريق الغسل بالماء، وقبل أن يتم تحضين الغشاء بالأجسام المضادة، يتم حجب الغشاء.لمنع الارتباط غير النوعي، قم بحجب الغشاء باستخدام كواشف حجب عالية الجودة. ولتجنب زيادة الخلفية، قم بتحضين الغشاء في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التحريك الخفيف، ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST أو PBST بعد التحضين. يمكن تحضير هذه المحاليل المنظمة بسهولة ويسر باستخدام أقراص TBS tween وأقراص PBS tween على التوالي.بمجرد حجب الغشاء وغسله، يمكن تحضينه مع الجسم المضاد الأولي. يتم تطبيق الجسم المضاد الأولي باستخدام المحلول one of signal boost، والذي يسمح بتعزيز الإشارة بشكل ملحوظ. قم بتحضير الجسم المضاد الأولي في المحلول one وحضّن الغشاء لمدة ساعة واحدة.لا داعي لإضافة المزيد من عوامل الحجب بعد عملية التحضين. اغسل الغشاء بمحلول TBST. بعد ذلك، حضّن الغشاء مع الجسم المضاد الثانوي المخفف في المحلول الثاني من signal boost لمدة ساعة واحدة.أخيراً، اغسل الغشاء مرة أخرى عدة مرات باستخدام TBST من أجل اقتران HRP. يُستخدم هنا تقليدياً الكشف عن الأجسام المضادة الثانوية عن طريق التلألؤ الكيميائي المعزز أو ECL. يتم استخدام خطوة ECL السريعة لأنها لا تتطلب خلط اللومينول أو المعزز.ببساطة، قم برش الغشاء بضع مرات، ثم اتركه في الحاضنة لمدة دقيقتين، وقم بتظهيره باستخدام فيلم الأشعة السينية. توفر تقنية Rapid Step حساسية منخفضة بمستوى البيكوجرام، بالإضافة إلى وميض أخف لمدة تصل إلى ساعتين بعد إضافة الركيزة. تتيح واسمات البروتين Trail mix تتبع البروتينات أثناء الرحلان الكهربائي مقارنة ببروتوكولات Western blot القياسية.يتيح تعزيز الإشارة (Signal Boost) نطاقًا ديناميكيًا وحساسية أعلى. وأخيرًا، يمكن الحصول على حساسية فائقة باستخدام خطوة Rapid بدلاً من كواشف ECL التقليدية. لقد عرضنا لك للتو كيفية إجراء عملية كشف البروتينات بطريقة Western blinding بكفاءة وبتكلفة اقتصادية من خلال مجموعة شاملة من المنتجات.تذكر أن جودة نتائجك تعتمد على جودة الكواشف المستخدمة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

western-blotting-sample-preparation-to-detection

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا المقال يصف التقنية القياسية الغربي النشاف الإجراء باستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا مصغرة جل النظام من Invitrogen.

الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels

Immunoblotting (غرب النشاف) هو الفحص السريع وحساسة للكشف وتوصيف البروتينات التي تعمل من خلال استغلال خصوصية متأصلة في مستضد الضد الاعتراف. هذا الفيديو يوفر بروتوكولات لفصل البروتين ، والبروتينات النشاف على الأغشية ، immunoprobing ، والتصور ركائز باستخدام مولد اللون أو chemiluminescent.

تحليل طخة مناعية

يوضح هذا الفيديو تقنية لطخة نقطية كمية ، أو QDB ، للقياس الكمي المطلق للبروتينات ذات الأهمية في عينة الأنسجة. يتم تثبيت البروتينات الموجودة في العينة على غشاء النيتروسليلوز داخل آبار صفيحة QDB. باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالبروتين المستهدف المسمى بإنزيم البيروكسيديز ، تتأكسد الركيزة الكيميائية المضيئة لإنتاج الضوء ، والذي يتم قياسه لتحديد تركيز البروتين في العينة.

لطخة النقطة الكمية لتقدير البروتينات المستهدفة في محللة الأنسجة

يوضح الفيديو تقنية نشاف غربية قائمة على تطبيع البروتين بالكامل لتحديد تعبير البروتين المستهدف في العينة. من خلال استخدام تلطيخ البروتين الكلي للعينة ، يتم إجراء تحليل نسبي لتحديد مستوى التعبير النسبي للبروتين المستهدف.

النشاف الغربي الكمي لتقدير مستويات التعبير عن البروتين

يصف هذا الفيديو النشاف الغربي القائم على التلألؤ الكيميائي للمحللات المناعية المرسبة. تساعد هذه التقنية في تحديد معالجة البروتين وتنشيطه. تتناسب الإشارة الكيميائية المكتشفة مع مستوى معالجة البروتين أثناء تنشيطه.

فحص اللطخة الغربية المضيئة الكيميائية لمعالجة البروتين

هذا البروتوكول يستكشف أحدث التطورات في أداء تحليلات لطخة غربية. هذه التعديلات رواية توظف نظام هلام مكرر تريس مع 35 دقيقة الكهربائي تشغيل الوقت، جافة نظام نقل النشاف 7 دقائق، والأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري والتصوير الذي يولد دقة أعلى، والجودة، والحساسية، وتحسين دقة البيانات الغربية.

أسرع الغربية في المدينة: لمسة عصرية على تحليل كلاسيكي غربي وصمة عار

سمح تقدم النشاف الغربي باستخدام التألق بالكشف عن التغييرات الطفيفة في تعبير البروتين مما يتيح إجراء تحليلات كمية. نصف هنا منهجية قوية للكشف عن مجموعة من البروتينات عبر مجموعة متنوعة من الأنواع وأنواع الأنسجة. كما يتم توفير استراتيجية للتغلب على المشاكل التقنية الشائعة.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

ويصف هذا الأسلوب نهجاً قويا واستنساخه لمقارنة مستويات البروتين في الأنسجة المختلفة وفي تيميبوينتس التنموية المختلفة باستخدام نهج blotting غربية كمية موحدة.

مقارنة مستويات البروتين عبر الأنسجة، وفي جميع أنحاء تطوير استخدام النشاف الغربية كمية موحدة قوية

هذا الفيديو يوضح إعداد طبقة مصفوفة / الحليلة رقيقة جدا لتحليل الببتيدات والبروتينات التي كتبها ماتريكس بمساعدة الليزر المج التأين طيف الكتلة (MS - MALDI).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

الفورمالين الأرشيفية ثابتة وجزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) العينات السريرية هي مادة قيمة للتحقيق من الأمراض. نحن هنا يبرهن على وجود إعداد سير العمل عينة مما يتيح تحليل متعمق البروتين من الأنسجة FFPE microdissected.

إعداد نموذج البروتين من الفورمالين الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من نسيج

تعلم تقنية Western blotting لتحليل البروتينات في عينات الأنسجة باستخدام بروتوكولات موثوقة. تُظهر هذه الطريقة أهمية جودة المواد الكيميائية للحصول على نتائج دقيقة.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

استكشف المزيد من الفيديوهات