في الرحم وحقن داخل البطيني Electroporation الجنين الجرذ E16

مرحباً، اسمي ويليام تي. أنا من مختبر أرنولد كريك ستين. اليوم، سأقوم أنا وزملاء آخرون بعرض طريقة الحقن داخل الرحم لأجنة الجرذان في اليوم الجنيني E 16. مرحباً، اسمي لورا إلياس.

سأوضح لكم اليوم كيفية تحضير ماصات الحقن المجهري وتعبئتها من أجل الحقن في البطينات الدماغية والترحيل الكهربائي اللذين سنقوم بهما اليوم. كما سأعرض لكم كيفية إجراء الحقن في البطينات الدماغية والترحيل الكهربائي في أجنة الجرذان في اليوم الجنيني 16 (E 16). وتعد عمليات الحقن والترحيل الكهربائي في الرحم لدى الجرذان مفيدة بشكل خاص لأن الجرذ يمثل نظاماً لا يمكن فيه إجراء التلاعبات الجينية بسهولة.

حسنًا، هناك عدد من الأدوات الجراحية التي نستخدمها في هذا الإجراء. نستخدم مسباراً (freer)، وزوجين من ملاقط الإمساك (addin forceps)، أحدهما مسنن، والآخر له سن صغير في نهايته. كما نستخدم زوجاً من الملاقط المرقئة (hemostats).

هذا زوج من المقصات، ثم نستخدم هاتين الدباسةين. هذه هي الدباسة الأكبر التي نستخدمها للفئران (rats). وهذه هي الدباسة الأصغر التي نستخدمها للفئران (mice)، حيث تستخدم دبابيس مقاس 7، بينما تستخدم الأخرى دبابيس مقاس 9، وهما تعملان بنظام التحميل الزنبركي.

من بين الأدوات التي نستخدمها هنا للمساعدة في العمليات الجراحية، نستخدم ببساطة مصدر ضوء ألياف بصرية برأس مزدوج. كما نستخدم وسادة تسخين تقوم بتدوير مياه دافئة وساخنة للحفاظ على الدفء. أما بالنسبة لسطح العمل، فنحن نستخدم نظام التثقيب الكهربائي الاختياري المصنع من قبل شركة BTX.

لدينا عدة أحجام مختلفة من المجاريف التي نستخدمها بناءً على حجم الأجنة. الجانب الأزرق هو الجانب الموجب. حسناً، سنقوم الآن بشحذ رؤوس ماصات الحقن.

وهذا أمر بالغ الأهمية لضمان أن تكون فتحة الماصة واسعة بما يكفي لتحميل الـ DNA، وفي الوقت نفسه حادة جداً لكي لا تتسبب في إتلاف الجنين أثناء الحقن. فإذا تضرر الجنين عند الحقن، ستزداد معدلات الوفيات بشكل كبير، وهو أمر غير مرغوب فيه.

إن هذه العملية في الواقع مهمة جداً في هذه الجراحة. وأولاً، سنقوم بوضع بعض الماء على حجر الشطب الذي يدور هنا. ومن ثم سنأخذ، دعونا نرى، مجرد عود.

وسنقوم بتثبيت الماصة التي سحبناها للتو على هذا العود باستخدام بعض الشريط اللاصق. وسنستخدم أحد هذه الموجهات الدقيقة (micro manipulators) لتثبيت الماصة عند زاوية الشطب والسماح لها بالشطب هنا. لذا، سنضعها ببساطة ونستخدم المجهر من أجل رؤية طرف الماصة.

وسنضعه مباشرة في الماء فوق الحافة المائلة التي أعددناها سابقاً بحيث يكون هناك قدر بسيط من الضغط. ويمكنكم رؤية الطرف وهو يضغط على الحجر هنا. واتركه ليتم شطبه لبعض الوقت، لمدة 15 دقيقة على الأقل.

أفضل تركها حتى لمدة ساعة مثلاً. في بعض الأحيان تصبح حادة للغاية، ولكن الأمر يعتمد بالتأكيد من شخص لآخر في المدة التي يستغرقونها لشطف حواف الماصات. حسنًا، لدينا هنا، كما ترون في الأعلى، ماصة تم سحبها ولم يتم شطف حوافها بعد.

لذا، بينما تكون حادة، فإنها لا تحتوي على أي فتحة يمكنك من خلالها تحميل الـ DNA. أما الماصة السفلية فقد تم شطب طرفها، ويمكنكم رؤية هذه الفتحة المائلة الجيدة؛ وهذا سيسمح لكم بتحميل الـ DNA، ولكنها لا تزال تحتفظ بطرف حاد حتى تتمكنوا من الحقن دون التسبب في أي ضرر. حسنًا، سنقوم الآن بملء ماصات الحقن بالـ DNA.

لذا، من المهم تحضير الحمض النووي DNA بطريقة خالية من الذيفانات الداخلية (endotoxin)، لضمان عدم حقن أي من عديدات السكاريد الدهنية (lipopolysaccharides) عند حقن الحمض النووي DNA. لذا، سنأخذ الحمض النووي DNA، ونقوم هنا بتجهيز البارافورم (paraform). ستقوم فقط بتحضير البارافورم هنا، ثم تجمع الحمض النووي DNA وتضعه كنقطة صغيرة على هذا البارافورم.

وبعد ذلك سنقوم بأخذ، حيث آخذ عادةً مقابل كل 10 µL من الـ DNA، والذي أستخدمه عادةً بتركيز يتراوح بين 1.5 إلى 1.7 µg لكل 1 µL، حوالي 1 µL من صبغة Fast Green هذه. وهذا يساعدنا فقط في تحديد موقع الحقن والتأكد من أننا قد حقنا بنجاح داخل البطين.

لذا، سأقوم بخلط صبغة fast green هذه مع الـ DNA الخاص بي. بعد ذلك، خذ قطب الحقن الكهربائي وسنقوم بملء الماصة عن طريق سحب المكبس للخلف. ويمكنك أن ترى هنا أنه إذا كانت الماصة صحيحة وبها فتحة واسعة بما يكفي، فإن الـ DNA يجب أن يتم تحميله بسهولة تامة.

في بعض الأحيان، ستحتاج فقط إلى تحريك المكبس ذهاباً وإياباً للمساعدة في سحب العينة بشكل صحيح. وبذلك يمكنك شحن الماصة بهذه الطريقة. والآن أصبح لدينا DNA محمل بالكامل في هذه الماصة وهو جاهز للحقن.

حسنًا، سأقوم بتخدير الحيوان. نستخدم هذه المخاريط الخاصة بـ dec capi. سأقوم فقط بطي الحافة إلى الخلف لتسهيل عملية الإمساك بها.

لنبدأ إذاً. عادةً ما أضعها على حافة القفص لإنشاء نفق صغير وجميل ليدخل فيه بهذا الشكل. حسناً، يبدو أن هذا الحيوان قد تم تخديره.

سنقوم الآن بإجراء قرصة لإصبع القدم للتأكيد، لذا نحتاج فقط إلى الإمساك بالإصبع وقرصه جيداً. لا تضغط بقوة، فأنت لا تريد إصابة الحيوان، ولكن الهدف هو التأكد فقط من فقدانه للوعي.

وهذا الحيوان الآن في حالة تخدير تام. لذا سأشرع في حلاقة بطنها، مع الحرص على تجنب الحلمات لتفادي قص أطرافها.

أعتقد أن الأمر قد يكون مؤلماً جداً للحيوان. لذا، يتم حلق شعر الحيوان. والآن، سأقوم بنقله إلى غطاء التدفق الصفائحي.

سنقوم بغسلها وبدء الإجراء. حسناً، لقد تأكدنا من أن هذا الحيوان غائب عن الوعي مرة أخرى، ونحن مستعدون لغسلها أولاً. ما أريد فعله هو وضع القليل من مرهم العين، وذلك فقط لمنع جفاف عينيها، في كل عين.

وبعد ذلك، سنقوم بالتنظيف بالتبادل باستخدام مسحات كحولية ومسحات يود. نكرر هذه العملية ثلاث مرات، أي ثلاث مسحات متبادلة. ويجب توخي الحذر الشديد أثناء القيام بذلك لتجنب إتلاف الأجنة.

لذا، ستقوم ببساطة بالسحب مباشرة إلى الأسفل، ثم السحب مباشرة إلى الخلف. هذه هي الخطوة الأولى. يجب عليّ فقط ترطيبها جيداً أولاً حتى أتمكن من القيام بعمليات المسح. جيد.

هذا هو الثاني وهذا هو الثالث. حسناً، لقد وضعنا هذا الغطاء للمساعدة في التعقيم، والآن سأقوم بفتح الحيوان. لنبدأ بالقص.

حسنًا، أول شيء يجب علي فعله هو ارتداء القفازات المعقمة. نرتدي القفازات المعقمة ونصبح مستعدين للفتح هنا. أريد دائمًا التأكد من أن الحيوان لا يزال تحت تأثير التخدير.

سأقوم بإجراء قرصة إصبع أخرى، وسنكرر ذلك طوال العملية. عادةً ما أقوم بقرص جزء صغير من النسيج، ثم أجري شقاً سريعاً، وأمسكه من الأعلى ثم أقطع للأسفل، ثم أمسك بزوج آخر من الملاقط لإبقاء النسيج متباعداً.

بعد ذلك، قم بالإمساك بالعضلة المطلوبة، واقطع مباشرة على طول الخط المتوسط لتجنب إصابة أي أوعية دموية أو أعصاب. كن حذراً في الإمساك بها. حسناً، يبدو أن لدينا كمية جيدة هنا.

أريد التأكد من إبقائه مشحماً جيداً حتى لا يجف. وسأقوم بوضع علامة أخرى للتأكد من أن كل شيء على ما يرام، ويبدو أننا كذلك. لذا أقوم دائماً بتحديد وضعية هذه الأجنة لـ لورا، وما أفعله عادةً، أو ما أفعله دائماً، هو وضع رأس الجنين بحيث يكون على الجانب الأيمن من الأم الجرذ، وذلك من أجل التوحيد فقط.

وسأبدأ الآن. هنا يمكننا رؤية الجنين. يمكننا رؤية الذيل والعدسة الخلفية هنا، والرأس في الأعلى هنا.

نحن ننظر هنا إلى رأس هذا الجنين. يمكنك رؤية الخط الناصف هنا عند هذا الخط الداكن. يمكنك رؤية نصف الكرة المخي الأيسر ونصف الكرة المخي الأيمن، بالإضافة إلى وجود الدماغ الخلفي.

سأقوم الآن باستهداف نصف الكرة المخية الأيسر أثناء الحقن. اسحب الماصة للحقن، ارفعها قليلاً ثم احقن الصبغة. والآن تلاحظ انتشارها في البطين الجانبي الأيسر.

وهكذا يبدو أن عملية الحقن قد تمت بنجاح. حسنًا، نرى الآن أن البطينين قد امتلآ بشكل جيد، وقد انتقلت الصبغة بالفعل من البطين الأيسر إلى البطين الأيمن.

لدينا الآن D و DNA في كلا البطينين. في هذه المرحلة، سأقوم بأخذ أقطاب التثقيب الكهربائي ووضعها عبر الدماغ مع وضع القطب الموجب على الجانب الأيسر. هنا، بحيث يدخل DNA إلى الخلايا السلفية والجدار القشري للنصف الأيسر من الدماغ.

وسأقوم الآن بتمرير التيار الكهربائي. وعند البدء في تمرير التيار، ستلاحظ ظهور بعض الرغوة عند الطرف السالب للقطب الكهربائي. وهذا أمر مطمئن ويؤكد لك أنك قد أجريت التوصيلات بشكل صحيح.

حسنًا، الآن وبعد أن انتهينا من إجراء التثقيب الكهربائي لهذه الأجنة، سأقوم بإعادتها إلى الداخل ثم خياطة الفتحة. سأعطيها الآن 10 مليلتر من المضاد الحيوي، ثم أقوم بالخياطة الجراحية. أفضل استخدام الغرز المتقطعة.

بعد ذلك، سنقوم بتدبيس الجلد باستخدام دباسة الجلد. حسناً؟ حسناً. لقد أعطيتها جرعة من buprenorphine للتأكد من عدم شعورها بأي ألم عند الإفاقة. والآن سأضعها في الحاضنة للحفاظ على دفئها أثناء الإفاقة، وذلك لضمان عدم إصابتها بانخفاض درجة حرارة الجسم.

حسنًا، لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء الحقن داخل البطينات الجنينية والترسيب الكهربائي. في الجرذ، يمكنك حقن عدد من المواد المختلفة؛ حيث يمكنك ببساطة حقن فيروس، بما في ذلك الفيروسات البطيئة أو الفيروسات القهقرية، مباشرةً في البطينات.

وفي هذه الحالة، لن تحتاج إلى إجراء التثقيب الكهربائي لأن الفيروس سيتكامل في الخلايا. أما إذا قمت بحقن بلازميدات DNA، كما فعلنا اليوم، فسيتعين عليك إجراء التثقيب الكهربائي من أجل إدخال البلازميدات إلى الخلايا المبطنة للبطين. لذا، يمكنك استخدام هذه النواقل لعدة احتمالات.

يمكنك استخدامها ببساطة لتتبع الخلايا والتعبير عن GFP، ومن ثم ستتمكن من مراقبة انقسام هذه الخلايا السلفية وهجرتها. كما يمكنك استخدام هذه النواقل للتلاعب بالخلايا؛ حيث يمكنك التعبير عن دبوس شعر S-H-R-N-A، وبالتالي يمكنك تثبيط جينات محددة.

يمكنك أيضاً زيادة تعبير جينات محددة، وبهذه الطريقة، يمكنك التحكم في الخلايا التي قمت بإجراء التثقيب الكهربائي لها أو إصابتها بالفيروس. ويمكن أن تكون هذه تقنية قوية جداً لدراسة دور بروتينات معينة في العملية التي تهتم بها. وهذا الأمر مهم بشكل خاص للدراسات التي تُجرى على الجرذ، نظراً لأنك لا تستطيع إجراء التعديلات الجينية في الجرذ بنفس السهولة التي يمكنك بها القيام بذلك في الفأر.