الاستقراء والرصد من أحدث نوع فرط الحساسية المتأخرة (DTH) في الفئران

مرحباً، أنا كريستين بيتون. أعمل في مختبر جورج شاندي في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية في جامعة كاليفورنيا، إيرواين (UCI). سأوضح لكم اليوم كيفية تحفيز فرط الحساسية المتأخرة (DTH) النشطة في الجرذان.

لذلك، سأقوم بتحضير مستحلب من KLH، وهو المستضد الخاص بي، في مادة مضافة من الفريون. ومن ثم سأقوم بحقن هذا المستحلب عند قاعدة ذيل جرذان لويس. سيؤدي ذلك إلى تحفيز مناعة الجرذان ضد KLH. وبعد مرور أسبوع واحد، سأقوم بتعريض الجرذان لـ KLH وقياس رد فعل DTH من خلال قياس التورم.

هذا هو موقع التحفيز، ونحن نستخدم ذلك في المختبر لرؤية تأثير حاصرات قنوات PO على التفاعلات الالتهابية مثل DTH. وإليكم المساعد المناعي غير الكامل الذي سأستخدمه لتحضير المستحلب، كما يمكنني أيضاً استخدام المساعد المناعي الكامل.

إليكم كمية من KLH، وهو المستضد المستخدم اليوم، ولدي هنا محلول بتركيز 2 mg/ml في PBS. سأستخدم هذه المحقنة سعة 5 ml لسحب المساعد غير المكتمل (incomplete adjuvant) ونقله إلى أنبوب سعة 15 ml. بعد ذلك، سأضع الأنبوب على جهاز الرج (vortex)، وأثناء عملية الرج، سأقوم بإضافة المستضد قطرة تلو الأخرى إلى المساعد.

وبعد ذلك، سأقوم بعمل مزج دوامي (vortex) لمدة خمس دقائق أخرى. وبعد الانتهاء من ذلك، سأملأ هذه الحقنة الزجاجية سعة 5 mL بالخليط، ويجب استخدام حقنة زجاجية لأن المادة المساعدة تميل إلى تآكل البلاستيك. وقد وجدنا أن الحقن سعة 5 mL هي الأفضل لتحضير المستحلب.

الأحجام الأصغر أو الأكبر ليست بالقدر المطلوب. وبمجرد ملء المحقنة بالمزيج، سأستخدم هذا الجسر المعدني لربط هذه المحقنة الزجاجية بمحقنة زجاجية أخرى سعة 5 مل. ومن ثم سأقوم بتسليط الضغط على المحقنتين لنقل المزيج من محقنة إلى الأخرى بأسرع ما يمكن حتى يصبح المزيج صلباً للغاية، أي حتى يزداد تماسك المستحلب، وعندها يصبح جاهزاً للحقن.

سأقوم الآن بإضافة 2.5 ml من المادة المساعدة. لذا، سأقوم بحقن الهواء لتمكيني من إخراج المادة المساعدة بسهولة أكبر، ثم أضع كل المادة المساعدة في الأنبوب. والآن، سآخذ 2.5 ml من هذه المادة وأضيفها هناك باستخدام جهاز الخلط الدوامي (vortex).

بما أنني أخذت 2.5 mils من المادة المساعدة، فسآخذ 2.5 mils من KLH الخاص بي. وبينما أقوم بالإضافات قطرة بقطرة، ستلاحظون أن الخليط سيتغير لونه ويتحول إلى اللون الأبيض. والآن، قمت بإضافة كل المستضد إلى المادة المساعدة.

لذا، سأقوم برج الخليط باستخدام جهاز الـ vortex لمدة خمس دقائق إضافية. وبما أنني لا أرغب في إمساك الأنبوب بيدي طوال هذه المدة، سأقوم بتثبيته على جهاز الـ vortex باستخدام شريط لاصق. يجب ضبط سرعة الـ vortex داخل الأنبوب بحيث تكون بأقصى سرعة ممكنة دون أن يفيض المحتوى. سأتركه على هذا الوضع لمدة خمس دقائق.

لقد انتهت الدقائق الخمس. سأقوم الآن بإيقاف جهاز الرج vortex، وقد أصبح الخليط باللون الأبيض. لذا سأقوم بإخراج الأنبوب. عذراً.

أصبح الخليط الآن أبيض اللون تماماً، ولكنه لا يزال سائلاً إلى حد ما. وبما أنني أرغب في أن يكون أكثر تماسكاً من أجل الحقن، سأقوم بنقل الخليط بالكامل إلى حقنة زجاجية سعة 5 ml.

لقد تم تعقيم هذه المحاقن بواسطة الأوتوكلاف. لذا، أقوم بتوصيل محقنة كاملة بالجسر الخاص بي، بينما أقوم بتوصيل الأسطوانة فقط من المحقنة الأخرى.

سأترك المكبس خارج السرنجة، ثم سأصب الخليط في السرنجة العلوية. سأقوم بنقل كل شيء إلى السرنجة السفلية، وبعد ذلك سأحتاج إلى دفع فقاعة الهواء الموجودة هنا.

سأقوم بفصل المحقنة العلوية وسأعمل على إزاحة فقاعة الهواء. من الصعب رؤية الفقاعة، لكنها موجودة هنا تماماً. لذا، سأقوم بإزاحة فقاعة الهواء.

أقوم أيضاً بطرد الهواء من الوصلة، ثم أعيد توصيل المحقنة العلوية. أتأكد من أن جميع التوصيلات محكمة، ومن ثم سأقوم بنقل الخليط من محقنة إلى أخرى. في البداية يكون الأمر سهلاً، ولكن سرعان ما سيبدأ الخليط في التصلب.

لذا أصبحت الليلة أكثر صعوبة ولا أريد كسر الجسر، لذا أقوم فقط بتدوير المحاقن. يستغرق الأمر وقتاً أطول أحياناً، حيث يختلف ذلك من مستحلب إلى آخر.

ربما يعتمد ذلك على درجة الحرارة ومستوى الرطوبة أيضاً. ولكن أعتقد أن المستحلب قد أصبح جاهزاً، فهو الآن أكثر كثافة مما كان عليه عند صبّه.

إنه أبيض تماماً. وهناك طور واحد فقط. يجب ألا يحدث أبداً انفصال لطور ACO عن الزيت.

لقد أصبح المحلول الآن جاهزاً للحقن. لذا، سأقوم بحقن 200 µL في كل خلية.

ولهذا الغرض، سأستخدم محاقن سعة 3 مل. وأستخدم محاقن ذات رؤوس من نوع Luer Lock لضمان عدم خروج الإبرة، لأن المستحلب قد يكون كثيفاً جداً ويصعب حقنه. وبالنسبة للإبر التي أستخدمها، أحاول استخدام أصغر إبر ممكنة تسمح بمرور المستحلب.

وقد وجدت أن المحاقن سعة 20 3G كافية لهذا المستحلب. أما بالنسبة للمستحلبات الأكثر كثافة، فقد تحتاج إلى استخدام محاقن أكبر. وبالنسبة للطريقة التي نتبعها، يقوم شخص بتثبيت الجرذ بينما يقوم الشخص الآخر بالحقن.

ولتحقيق أقصى درجات السلامة، يقوم الشخص الذي يمسك الجرذان بارتداء قفازات واقية من عضات القوارض، ورغم أن هذه الجرذان هادئة للغاية ومعتادة على التعامل معها، إلا أننا نستخدم هذه القفازات لضمان السلامة القصوى وتجنب التعرض للعض. بعد ذلك، أضع كامل المستحلب في محقنة زجاجية واحدة، ثم أفصل المحقنة الزجاجية الفارغة عن الجسر، وأضع بدلاً منها محقنة بلاستيكية سعة 3 mL من نوع Luer lock.

الآن أقوم بنقل كمية أكبر مما أحتاجه لمسار واحد من المستحلب. وأقوم بطرد فقاعة الهواء. وبما أنني سأحقن 200 µL لكل مسار، فإنني أترك 300 µL في المحقنة.

أقوم بفصل الجسر، ثم أركب الإبرة في المحقنة البلاستيكية، وبعد ذلك أملأ الإبرة وأدفع المكبس للأسفل حتى 200 µL. بهذه الطريقة أتأكد من عدم وجود فقاعات هوائية. والآن أصبحنا جاهزين للحقن.

لذا، نريد التأكد من عدم تحرك الجرذ. لذا نمسك الجرذ وأضع إصبعاً فوق الكتف، وآخر تحته، ثم باليد الأخرى، أمسك الأرجل الخلفية والذيل، وسنقوم بالحقن في الخاصرتين هنا، حيث نحقن microliters على هذا الجانب ثم microliters على الجانب الآخر. وفي الأسبوع الماضي، قمت بتحصين الجرذان بمستحلب يحتوي على KLH كمستضد.

واليوم سأقوم بتحفيزهم جلدياً في منطقة الظهر باستخدام KLH، وهو المستضد الخاص بي، وباستخدام o albumin، وهو مستضد ذي صلة، ولكن لكي أتمكن من حقنهم في الظهر جلدياً، يجب علي أولاً حلاقة شعرهم. ولهذا الغرض، سأستخدم مجرد ماكينة حلاقة كهربائية بسيطة. نعم، سأقوم بتغيير الإبر بين كل جرذ وآخر للتأكد من أن الإبرة ليست ثلمة.

هذا يجعل الحقن داخل الجلد أسهل بكثير، خاصة وأنني أحقن أحجاماً صغيرة تبلغ 20 µL من كل مستضد. لقد انتهيت من حقن المستضدين في جميع الجرذان، وسأتركها في أقفاصها حتى الغد. وغداً سنتمكن من رؤية الالتهاب.

لذا، سيكون موقع الحقن أحمر ومتورماً، وسنتمكن من قياس قطر موقع الالتهاب كمقياس لشدة الالتهاب. وبالأمس، قمت بتحفيز الجرذان عن طريق الحقن داخل الجلد في الظهر باستخدام المستضد ذي الصلة، وهو KLH، ومستضد غير ذي صلة، وهو الألبومين. والآن، بعد مرور 24 ساعة، سأقوم بفحص الجرذان لمعرفة ما إذا كان هناك التهاب.

لذا، أتوقع حدوث التهاب في موقع حقن KLH فقط، وسيظهر هذا الالتهاب على شكل احمرار وتورم. وبعد معاينة الالتهاب، سأقوم بقياس المنطقة الملتهبة ببساطة عن طريق قياس قطر المنطقة. هذا هنا هو موقع حقن KH، ويمكنكم أن تروا بوضوح وجود التهاب شديد.

تبدو المنطقة حمراء جداً مقارنة بالجلد الطبيعي وهي متورمة. وإذا نظرنا الآن إلى الموقع الآخر الذي تلقى الألبومين، يمكنك رؤية موقع الحقن هنا، ولكن لا يوجد احمرار أو تورم ملحوظ. لذا، فقد نجحت المجموعة الضابطة السالبة.

سأقوم الآن بقياس موقع الالتهاب. وللقيام بذلك، سأستخدم مسطرة عادية وأجري القياس بالملليمترات. يبلغ هذا القياس 6 mm، وسأقوم بأخذ قياس ثانٍ.

يبلغ وزن هذا خمسة مليمترات. هناك احمرار طفيف جداً، وسنقوم بقياسه، لكنه بالكاد يصل إلى واحد مليمتر. لذا، ما عرضته لكم هنا هو كيفية تحضير مستحلب يحتوي على مستضد، وكيفية تحصين الجرذان بهذا المستحلب، ثم تعريضهم للتحدي بعد أسبوع باستخدام المستضد الذي استُعمل في التحصين وكذلك مستضد ذي صلة، وكيفية تصور وقياس درجة الالتهاب في المختبر المستخدم ومختبر Chan.

نحن نستخدم هذه التقنية بشكل روتيني كاختبار بسيط لقياس تأثير حاصرات قنوات البوتاسيوم على الالتهاب في الجرذان.