Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

استُخدمت العصبونات الحصينية والقشرية على نطاق واسع لدراسة استقطاب العصبونات في الجهاز العصبي المركزي، ونمو المحاور والشجيرات العصبية، وتكوين المشابك العصبية ووظيفتها؛ وتكمن ميزة زراعة هذه العصبونات في أنها تستقطب بسهولة مكونةً محاور وشجيرات عصبية مميزة على ركيزة ثنائية الأبعاد عند كثافات منخفضة جداً. يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل وزراعة ونقل الجينات إلى العصبونات الحصينية والقشرية الجنينية للفئران عبر عملية Nucleofection، مما يسمح بالتعبير عن البروتينات الاندماجية الموسومة بفلوريسنت في مرحلة مبكرة من التطور، تقريباً بعد مرور 4 إلى 8 ساعات من الزرع. ويستمر التعبير عن هذه البروتينات الموسومة بفلوريسنت طوال فترة حياة العصبون لأكثر من شهرين في المزرعة. وهذا يتيح دراسة وظيفة البروتين أثناء أحداث التطور المبكرة مثل نمو المحاور، والأحداث اللاحقة مثل تكوين المشابك العصبية واللدونة المشبكية.

أولاً، يتم عزل الخلايا الدبقية من نصفي الكرة القشرية لجراباء الفئران في اليوم الأول إلى الثالث بعد الولادة، ثم تُزرع في دوارق. وبعد وصول درجة التلاقي إلى 70 إلى 100%، يتم إعادة زرع الخلايا الدبقية على شرائح زجاجية غطائية.

بعد ذلك، يتم عزل العصبونات الحصينية أو القشرية من فئران في عمر E 15.5، وتُنقل إليها البلازميدات التي تشفر بروتينات اندماج فلورية، مثل البروتين الفلوري الأحمر، عبر تقنية nucleo affection. ثم تُزرع العصبونات المنقولة في غرف تصوير للدراسات قصيرة المدى. وبالنسبة للمزارع طويلة المدى، يتم قلب الخلايا الدبقية الموجودة على شرائح زجاجية غطائية فوق المزارع الحصينية أو القشرية لتوفير الدعم الغذائي، ومن ثم يمكن تصوير العصبونات الفردية لإظهار التموضع الديناميكي لبروتينات الاندماج عبر المحاور العصبية أو الزوائد الشجرية للعصبونات.

مرحباً، أنا إريك دينت، أستاذ مساعد في علم التشريح بجامعة ويسكونسن ماديسون. سيقوم اليوم ثلاثة من طلابي في مرحلة البكالوريوس، وهم كريس ويزلمان، وجيسون بوي، وديريك لومبارد، بشرح إجراء لعزل وزراعة والحفاظ على مستنبتات من عصبونات القشرة المخية والحصين للزراعة قصيرة وطويلة المدى. يمكن استخدام هذه المستنبتات لدراسة ديناميكيات البروتينات الاندماجية الفلورية طوال فترة التطور العصبي، بدءاً من النمو الأولي للزوائد العصبية وصولاً إلى تطور المحاور والشجيرات وتكون التشابكات العصبية.

لتحضير الحجرات للتصوير، باستخدام عصبونات جنينية من منطقة الحصين والقشرة المخية للفئران. ابدأ بأطباق بيتري بقطر 35 مليمتر مع ثقوب بقطر 15 مليمتر محفورة في القاع مع إزالة جميع الرايش. قم بإذابة خليط من البارافين والفازلين بنسبة ثلاثة إلى واحد في أنبوب مخروطي عن طريق وضعه في حمام مائي مغلي.

ثم استخدم فرشاة رسم صغيرة لطلاء الجانب السفلي من الطبق حول الفتحة. تأكد من تحريك خليط البارافين وهلام البترول بين الغرف لأن المكونات قد تنفصل. ضع غطاء الشريحة فوق الفتحة.

بمجرد تحضير جميع الأطباق، ضعها في فرن درجة حرارته 80 degree Celsius حتى ينصهر خليط البارافين. تستغرق هذه العملية حوالي 10 دقائق. ثم انقل الأطباق إلى سطح مستوٍ واترك خليط البارافين يتجمد لمدة دقيقة واحدة على الأقل.

اقلب الأطباق وضعها تحت غطاء سحب الهواء (hood). قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة لتعقيم كل من الأجزاء الداخلية للأغطية وقيعان الحجرات. ثم انتقل إلى مرحلة التغطية (coat).

تُطلى شرائح غطاء الغرفة بـ poly D lycine لمدة ساعة واحدة. ثم تُشطف الشرائح المطلية جيداً من ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماء منزوع الأيونات مُرشح ومعقم لإزالة كافة آثار محلول التخزين. بعد الشطف النهائي، استخدم المكنسة الكهربائية (vacuum) لتجفيف الغرف. يمكن استخدام هذه الشرائح فوراً أو تخزينها في غرفة زراعة الأنسجة لاستخدامها لاحقاً.

يجب استخدام الغرف المطلية في غضون أسبوع واحد من التحضير في حال الرغبة في إعداد مستنبتات طويلة الأمد. سيتطلب الأمر البدء في تحضير طبقات تغذية من الخلايا الدبقية القشرية قبل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من المتابعة في عمليات تشريح القشرة المخية أو الحصين. ضع أدمغة أربعة من صغار الفئران في المرحلة العمرية P1 إلى P3 في طبق يحتوي على وسط تشريح بارد، ثم ضع الطبق تحت مجهر التشريح.

قم بإزالة البصيلات الشمية، ونصفي الكرة المخية، والسحايا. انقل نصفي الكرة المخية إلى طبق جديد لا يحتوي على أي وسط زراعي. وباستخدام شفرة حلاقة معقمة ونظيفة، قم بتقطيع القشور المخية إلى أن تصبح ناعمة قدر الإمكان.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة بلاستيكية، انقل الأنسجة المقطعة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter يحتوي على 12 milliliters من وسط التشريح البارد. أضف trypsin و DNAs بتركيزات نهائية تبلغ 0.25% و 0.1% على التوالي. قم بالتحضين في حمام مائي بدرجة حرارة 37 degree Celsius لمدة 10 دقائق مع التقليب المتقطع.

بعد انتهاء فترة التحضين، أخرج الأنبوب من الحمام المائي ونظفه جيداً بـ 70%ethanol قبل نقله إلى غطاء استنبات الأنسجة. ثم اسحب نسيج القشرة المخية وادفعه للأعلى وللأسفل باستخدام الماصة.

باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر، قم بالعملية من 10 إلى 15 مرة تقريباً أو حتى تختفي معظم الكتل، ثم أعد الأنبوبة إلى الحمام المائي لمدة 10 دقائق أخرى مع التحريك المتقطع. مرة أخرى، نظف الأنبوبة جيداً باستخدام الإيثانول بتركيز 70% وأعدها إلى غطاء زراعة الأنسجة.

قم بسحب النسيج القشري وإطلاقه باستخدام الماصة لتقطيعه. كما في السابق، استخدم هذه المرة ماصة سعة 5 مل وأضف 15 مل من الوسط الدبقي الدافئ، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا المترسبة في 20 مل من الوسط الدبقي الطازج.

استخدم مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لعد الخلايا. بعد ذلك، قم بزراعة من 5 إلى 7.5 مليون خلية في 15 ملليلتر من الوسط الدبقي (glial medium) لكل قارورة بمساحة 75 سنتيمتر مربع. ضع الخلايا في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، وبعد يوم واحد وكل يومين إلى ثلاثة أيام تالية من الزراعة، قم بتفكيك أي خلايا غير ملتصقة عن طريق نقر القارورة مقابل سطح غطاء التدفق الصفائحي (hood).

قم بإزالة الوسط مع أي خلايا منفصلة واستبدله بـ 15 milliliters من وسط glial الطازج. يمكن حصاد خلايا glia بعد أسبوع إلى أسبوعين من النمو في الدوارق عندما تصل إلى حالة الالتحام الكامل بنسبة 100%confluent. ولتحضير شرائح غطاء فردية مطلية بخلايا glia، ابدأ بوضع ست شرائح تم تنظيفها بحمض النيتريك وتعقيمها.

ضع شرائح غطاء مستديرة بقطر 25 millimeter في طبق سعة 10 centimeter، وباستخدام فرشاة رسم صغيرة، ضع ثلاث نقاط من خليط الفازلين البارافيني بنسبة ثلاثة إلى واحد على كل شريحة غطاء على شكل مثلث. ثم ضع نقطتين على حواف شريحة الغطاء لتثبيتها في الطبق.

عالج الأطباق المفتوحة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة. غطِّ شرائح الغطاء بمادة poly D lysine لمدة ساعة واحدة. ثم اغسلها جيداً من ثلاث إلى خمس مرات باستخدام ماء منزوع الأيونات ومعقم ومفلتر، واتركها لتجف، ثم أخرج الخلايا الدبقية من الحاضنة.

تخلص من الوسط واغسله بخمسة ملليلترات من التريبسين المُدفأ مسبقاً. أضف ثلاثة ملليلترات من التريبسين إلى القارورة واحضنها لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية. وبمجرد انفصال الخلايا، أضف خمسة ملليلترات من الوسط الدبقي لإيقاف مفعول التريبسين.

أزل الـ GL من الدورق عن طريق السحب والإفراغ بالماصة من 10 إلى 15 مرة. بعد ذلك، انقل الوسط إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مليلتر، ثم قم بطرد مركزي بسرعة 1000 RPM لمدة ثماني دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، علّق الخلايا في 10 مليلتر من الوسط الدبقي (glial medium).

بعد ذلك، ومن خلال عدّ الخلايا، يتم توزيع 5 × 10⁵ خلية في 12.5 ملليلتر من الوسط الدبقي لكل طبق قطر 10 سنتيمتر يحتوي على شرائح التغطية. يُستبدل الوسط بوسط دبقي طازج ومسخن مسبقاً كل يومين إلى ثلاثة أيام، وفي اليوم الذي يسبق عملية تشريح العصبونات، يُزال الوسط الدبقي ويُستبدل بوسط خالٍ من المصل.

استخدم هذا الوسط الخالي من المصل المخصص للخلايا الدبقية لاحقاً. عند غمر مزارع القشرة الدماغية أو الحصين، يُضاف C بتركيز نهائي قدره five micromolar. ومن أجل منع التكاثر الدبقي، تُضاف كواشف النوكليوفيكشن لكل عملية ترنسفيكشن وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة، ثم يتم تدفئة المحلول حتى درجة حرارة الغرفة.

ضع طبقاً يحتوي على أدمغة فئران في المرحلة الجنينية E 15.5 في وسط تشريح بارد. وباستخدام مجهر تشريحي، استعمل إبرة تنجستن منحنية لإزالة كلتا القشرتين المخيتين الحديثتين. ثم باستخدام ملاقط دقيقة، قم بإزالة السحايا وضع القشرتين في طبق جديد من وسط التشريح البارد.

يمكن رؤية الحصين والقشرة على طول الجانب الإنسي لنصف الكرة المخية باستخدام مقصات قزحية صغيرة. قم بإزالة الحصين بعناية، ثم قم بإزالة القشرة المتبقية.

كرر عملية التشريح على أدمغة جميع أفراد البطن. ضع القشور القشرية للحصين في أنابيب دقيقة منفصلة سعة 1.5 milliliter مملوءة بـ one milliliter من وسط تشريح بارد. ضع الأنابيب على الثلج بعد الانتهاء من تشريح جميع القشور والحصينات.

أضف 110 µL من trypsin بتركيز 2.5% إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على النسيج، وضع الأنابيب في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 20 دقيقة. وباستخدام ماصة P 1000، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من الأنبوب. ثم أضف 1 mL من وسط الزرع إلى كل أنبوب واغسل النسيج عن طريق قلب أنبوب الطرد المركزي الدقيق بلطف.

كرر عملية الغسل مرتين. بعد الغسل النهائي، أضف 1 مل من وسط الزراعة. استخدم ماصة P 1000 لمزج الكتل عن طريق السحب والتفريغ (triturate) 15 مرة. ثم انقل الرائق والخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من وسط الزراعة، مع ترك أي كتل متبقية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق (microfuge tube).

قم بطرد أنبوب الـ 15 milliliter بسرعة 350 RPM لمدة سبع دقائق مع إيقاف الكبح بعد عملية الطرد المركزي، ثم تخلص من السائل الطافي وأضف 100 µL من محلول النقل النووي (nucleofection solution) المخلوط مسبقاً في درجة حرارة الغرفة لكل عملية عفن، مع السحب والضخ بالمصّة خمس مرات للمزج. بعد ذلك، انقل 100 µL من خليط الخلايا ومحلول النقل النووي إلى كل أنبوب طرد مركزي صغير (microfuge tube) جديد يحتوي على كمية مناسبة من الـ DNA؛ حيث إن استخدام 1 to 2 µg من الـ DNA لكل عملية عفن في المزارع طويلة الأمد سيؤدي إلى وسم أقل من 10% من العصبونات في المزرعة.

بينما سيؤدي استخدام 5 إلى 10 micrograms من DNA لكل عملية ترانسفكشن إلى كفاءة ترانسفكشن أعلى للمزارع الخلوية، أضف معلق الخلايا ومزيج DNA إلى أنبوب electroporation. ثم ضع الأنبوب في جهاز electroporation. بالنسبة للعصبونات في CNS للفأر، اضبط برنامج nucleo effector على oh 0 0 5، وبسرعة، أضف 500 microliters من وسط الزراعة الذي سبق تدفئته وموازنته إلى الأنبوب وانقل محلول الخلايا إلى أنبوب micro fuge جديد سعة 1.5 milliliter.

أضف كمية كافية من وسط الزرع لرفع حجم كل عملية ترنسفكشن (transfection) إلى 1 مللتر. بعد عد الخلايا، ازرع من 3 إلى 5 × 10³ خلية/سم² للمزارع الحديثة، أو من 5 إلى 10 × 10³ خلية/سم² للمزارع طويلة الأمد؛ وعموماً يتم استخدام 5 × 10⁵ أو 1 × 10⁶ خلية لكل عملية ترنسفكشن لتحضير المزارع قصيرة الأمد.

بعد ساعة واحدة من الزراعة، يتم غمر أطباق المزارع التي يبلغ قطرها 35 مليمتر بملليلترين من الوسط الخالي من المصل والمدفأ والمتوازن مع ثاني أكسيد الكربون. وتؤدي غرف التصوير إلى محتوى مصل منخفض جداً يقل عن 0.5%. لا تحتاج المزارع قصيرة المدى إلى الزراعة مع طبقة تغذية دبقية ولا تحتاج إلى إعادة التغذية. ولتحضير المزارع طويلة المدى، يتم إضافة ملليلتر واحد من الوسط الدبقي المكيَّف إلى الوسط الخالي من المصل.

قم بإزالة شريحة غطاء GL تحتوي على ثلاث نقاط من هلام البارافين البترولي واقلبها فوق الفتحة التي يبلغ قطرها 15 مليمتر في الطبق 35. ثم أضف 1 ملليلتر آخر من الوسط الغذائي لتغذية المزارع طويلة الأمد. استبدل ثلث الوسط الخالي من المصل كل يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد خمسة إلى سبعة أيام من الزرع، يُضاف Cytosine Arabinoside أو Ara-C ليصل إلى تركيز نهائي قدره 5 µM من أجل منع تكاثر الخلايا الدبقية. تُظهر الصور المزدوجة التالية لعصبونات حصينية حية ممثلة كلاً من صورة تباين التداخل التفاضلي والصورة المجهرية الفلورية المقابلة لها. وقد تم ترانسفكشن كل خلية من هذه الخلايا بـ EGFP وtubulin وDsRed2 في ناقلات PA.

خلال المرحلة الأولى، ستلتصق الخلايا العصبية في البداية، وخلال فترة يوم تقريباً، ستبرز من حول محيط جسم الخلية أرجل صفائحية (lamellipodia) وأرجل خيطية (filipodia) تشبه الأصابع. وخلال المرحلة الثانية، ستتمايز هذه البروزات الأولية إلى عدة نتوءات عصبية (neurites) تنبثق من جسم الخلية، وعادةً ما يظل طولها يتراوح بين 30 إلى 50 microns. أما خلال المرحلة الثالثة، فتبدأ إحدى هذه النتوءات العصبية بشكل عشوائي في الاستطالة سريعاً لتصبح المحور العصبي (axon).

تظل neurites الأخرى قصيرة وتسمى زوائد ثانوية. انتقلت معظم العصبونات في الحصين والقشرة المخية إلى المرحلة الثالثة خلال يومين إلى ثلاثة أيام في المزرعة؛ أما المرحلة الرابعة، والتي تحدث على مدار الأسبوع أو الأسبوعين التاليين، فتزداد فيها الزوائد الثانوية سمكاً وطولاً وتتفرع لتصبح dendrites، وهي الموضحة هنا باللون الأخضر. وفي الوقت نفسه، يزداد المحور العصبي دقة بينما يستمر في النمو والتفرع بحلول الأسبوع الثاني أو الثالث.

في المزرعة، تتمايز الزوائد الشجرية من خلال تكوين الأشواك الشجرية، وهي بروزات صغيرة على طول الزوائد الشجرية. ستختلف الخلايا العصبية في المرحلة الخامسة في شكلها وحجمها، ولكن يجب أن تمر معظمها بهذه السلسلة من المراحل النمائية. وقد لا تتقدم الخلايا العصبية المنقولة جينياً عبر هذه المراحل إذا أدى الإفراط في تعبير البروتينات إلى تعطيل التطور العصبي.

علاوة على ذلك، قد لا تمر الخلايا العصبية بجميع مراحل النمو. وإذا لم يتم تنظيف الشرائح الغطائية بشكل صحيح أو لم يلتصق البولي ليسين بشكل جيد، فقد تتكاثر الخلايا الدبقية أيضًا بشكل واسع، خاصة في حال عدم استخدام C. هذه صورة متباينة الطور لمزرعة عمرها أسبوعان، حيث نمت الخلايا الدبقية بشكل مفرط وتجاوزت المزرعة في المزارع طويلة الأمد.

كما يمكن أن يؤدي تغيير الوسط الغذائي بمعدل تكرار عالٍ جداً أو منخفض جداً إلى تضرر حيوية الخلايا العصبية. هذه صورة مباينة طور لمستنبت ماتت فيه معظم الخلايا العصبية، بينما تظهر الخلايا العصبية المتبقية أجساماً خلوية منكمشة وزوائد خلوية محببة. وللمقارنة، هذه صورة مباينة طور لخلايا عصبية صحية من الحصين بعد أسبوعين من الاستنبات؛ لاحظ هنا كبر حجم الأجسام الخلوية وغياب التحبيب في الزوائد الخلوية.

بالإضافة إلى ذلك، في هذه المرحلة، تكون الزوائد الشجرية قد تضخمت وظهرت شبكة دقيقة وواسعة من الزوائد المحورية. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام التشريح الجنيني والقشري، والترنيس، وزراعة مجموعة كاملة من الأجنة في غضون ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر أن العصبونات الحصينية والقشرية حساسة للغاية تجاه التلف الميكانيكي.

كذلك، من المهم الحفاظ على المحاليل في أبرد درجة حرارة ممكنة أثناء عزل الخلايا العصبية لإبقاء النشاط الأيضي منخفضاً. وعقب هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل تصوير الخلايا الحية والتسجيل الفسيولوجي للنشاط من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية توزيع البروتينات الاندماجية الفلورية المستهدفة في مناطق مختلفة من الخلية العصبية، أو ما إذا كان تموضع البروتين مرتبطاً بتغيرات في النشاط التشابكي، أو كيفية تأثر وظائف هذه البروتينات بtreatments دوائية مختلفة.