التعبير الجيني عن طريق التثقيب الكهربائي أحادي الخلية في مزارع شرائح الحصين في الفئران

ابدأ بشريحة الحصين من دماغ الفأر المزروع على إدراج ثقافة في طبق.

قم بقص الملحق الذي يحتوي على الشريحة وثبته في غرفة التثقيب الكهربائي تحت المجهر.

بتفريخ الغرفة بمخزن مؤقت يحتوي على مانع قناة الصوديوم بالجهد الكهربائي لمنع الإفراط في الإثارة ومنع السمية الخلوية.

ضع ماصة تحتوي على بلازميدات مع الجين محل الاهتمام بالقرب من الشريحة.

حافظ على الضغط الإيجابي لمنع انسداد الماصة أثناء الاقتراب من خلية عصبية الحصين المستهدفة حتى تتشكل غمازة غشائية.

قم بالتبديل إلى الضغط السلبي لإنشاء ختم بالغشاء.

قم بالتبديل بين الضغط الإيجابي والسلبي لتقليل الضرر الخلوي.

قم بتطبيق نبضة التثقيب الكهربائي لاختراق الغشاء بشكل عابر ، مما يسهل دخول البلازميد.

اسحب الماصة مع الحفاظ على الضغط الإيجابي ، وكرر التثقيب الكهربائي للخلايا العصبية المستهدفة المجاورة.

انقل الشريحة المثقبة بالكهرباء إلى ملحق جديد واحتضانها للسماح بالتعبير عن الجين محل الاهتمام.

لتحضير مزارع الشرائح للتثقيب الكهربائي ، انقل إدخالات الثقافة ذات الأهمية إلى أطباق بتري فردية بحجم ثلاثة سنتيمترات محملة ب 900 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، وضع الثقافات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون على الطاولة. بعد ذلك ، قم باحتضان إدخالات الثقافة الطازجة مسبقا باستخدام مليلتر واحد من وسط زراعة الشرائح لكل إدراج في طبق بتري بطول 3.5 سم لمدة 30 دقيقة على الأقل ، وقم بتعقيم خطوط جهاز التثقيب الكهربائي باستخدام مبيض بنسبة 10٪ لمدة خمس دقائق.

في نهاية التروية ، اشطف الخطوط بالماء المعقمة المتأين لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الترشيح باستخدام aCSF المعقم بالترشيح الذي يحتوي على 0.001 مليمولو من السموم الرباعية المعدنية. اضبط نبضة المثق الكهربائي على سعة سالب خمسة فولت، ونبضة مربعة، وقطار 500 مللي ثانية، وتردد 50 هرتز، وعرض نبضة 500 ميكروثانية. املأ ماصة زجاجية بخمسة ميكرولترات من المحلول الداخلي المحتوي على البلازميد، وقم بنقر الطرف برفق واضغط عليه عدة مرات لإزالة أي فقاعات محاصرة.

استخدم مجهر التشريح للتأكد من عدم تلف الطرف ، وقم بتوصيل طرف الماصة بإحكام بالقطب. عندما يتلامس الطرف مع aCSF، سجل قراءة مقاومة الماصة للمثقب الكهربائي. لعزل ثقافة الشريحة ، قم بقص غشاء إدخال المزرعة بشفرة حادة ، واستخدم ملقطا حادا بزاوية لنقل ثقافة الشريحة بعناية إلى غرفة التثقيب الكهربائي.

ثم قم بإصلاح موضع الثقافة باستخدام مرساة شريحة. للتثقيب الكهربائي للخلايا ذات الأهمية، قم بالضغط الإيجابي على الماصة عن طريق الفم، واستخدم أدوات التحكم في المقبض ثلاثي الأبعاد لمناورة طرف الماصة بالقرب من سطح ثقافة الشرائح. عند عرض الثقافة بالمجهر ، اقترب من الخلية المستهدفة بالحافة ، مع الحفاظ على الضغط الإيجابي المطبق حتى تتشكل غمازة على سطح الخلية.

عند تصور الدمل ، قم بتطبيق ضغط سلبي خفيف بسرعة عن طريق الفم بحيث يتشكل ختم فضفاض بين طرف الماصة وغشاء البلازما. سوف يدخل الغشاء قليلا إلى الماصة. يجب ملاحظة زيادة بمقدار 2.5 مرة تقريبا في المقاومة الأولية للماصة، كما يتضح من زيادة النغمة من مكبرات الصوت.

أعد تطبيق الضغط الإيجابي بسرعة حتى يتم إصلاح الدمل. ثم أكمل على الفور دورتين أخريين على الأقل من الضغط كما هو موضح للتو دون توقف. بعد نبضة الضغط الأخيرة ، استمر في الضغط السلبي لمدة ثانية واحدة.

عندما تصل النغمة من مكبرات الصوت إلى قمة ثابتة في درجة الصوت ، استخدم دواسة القدم لنبض المثقوب الكهربائي بسرعة. بعد التثقيب الكهربائي ، اسحب الماصة برفق حوالي 100 ميكرون من الخلية دون الضغط ، وأعد الضغط الإيجابي ، وتحقق من أن المقاومة مشابهة لقراءة خط الأساس قبل الاقتراب من الخلية التالية. عندما يتم إجراء مثقات كهربائية لجميع الخلايا ذات الأهمية ، انقل مزرعة الشرائح إلى أحد إدخالات الثقافة الطازجة المحضرة ، وضع الملحق عند 35 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.