في الرحم وحقن داخل البطيني Electroporation من أجنة الفئران E15

مرحباً، أنا ويليام تيس من مختبر كريت. سأقوم أنا وزملاؤى اليوم باستعراض طريقة الحقن داخل الرحم لأجنة الفئران في اليوم الجنيني 15 (E 15). مرحباً، اسمي لورا إلياس.

سأقوم اليوم بشرح كيفية تحضير ماصات الحقن المجهري وتعبئتها من أجل عمليات الحقن في البطين والتثقيب الكهربائي التي سنقوم بها. اسمي ديفيد كاستاندا، وسأقوم اليوم بالمساعدة في عمليات الحقن في الجسم الحي داخل الرحم لأجنة الفئران. سنقوم بحقن الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) في البطين الجانبي لأجنة الفئران النامية.

نستهدف القشرة المخية للجسم الثفني (CE cortex) في هذه الأجنة لضمان تعبير جزيئات مختلفة بواسطة الخلايا الدبقية، والتي ستتحول إلى عصبونات لاحقاً في مرحلة النمو. عند إجراء هذه الحقن داخل الرحم، هناك بعض الأدوات الهامة التي ستحتاج إلى استخدامها وسأعرضها لك الآن. نحن نستخدم ملقطاً، وزوجاً من ملاقط التثبيت.

زوج واحد، أحدهما مسنن، والآخر به سن صغيرة في النهاية. نستخدم زوجًا من الملاقط الشريانية (hemostats). وهذا زوج من المقصات.

ومن ثم نستخدم هاتين الدباستين؛ فهذه هي الأكبر حجماً والتي نستخدمها للجرذان، وهذه هي الأصغر التي نستخدمها للفئران.

يُستخدم دباسة مقاس 7، وهذه تستخدم دباسة مقاس 9 وهي محملة بزنبرك. ومن بين الأدوات التي نستخدمها هنا للمساعدة في الجراحات، نستخدم مصدر ضوء بسيط بالألياف البصرية مزود برأس مزدوج. كما نستخدم وسادة تسخين تقوم بتدوير مياه دافئة بداخلها للحفاظ على درجة الحرارة.

بالنسبة لسطح العمل، فإننا نستخدم نظام التثقيب الكهربائي هذا المصنع من قبل شركة BTX. لدينا عدة أحجام مختلفة من الأقطاب التي نستخدمها بناءً على حجم الأجنة. الجانب الأزرق هو القطب الموجب.

بالنسبة للفئران، نستخدم مبخر iso fluorine. فقد وجدنا أن استخدامه يزيد من معدل بقاء الأم والأجنة على قيد الحياة. كما يتيح لنا إدخال الحيوان في حالة فقدان الوعي وإعادته إليها بسرعة كبيرة وبطريقة محكم التحكم.

ولهذا السبب، وجدنا أنها مفيدة للغاية. حسنًا، سنقوم الآن بشطف (برية) أنابيب الحقن. وهذا أمر بالغ الأهمية لضمان أن تكون فتحة الأنبوب واسعة بما يكفي لتحميل DNA، وفي الوقت ذاته أن تكون حادة جدًا حتى لا تتسبب في إتلاف الجنين عند الحقن.

وإذا تسببت في إتلاف الجنين أثناء الحقن، فسترتفع معدلات الوفيات بشكل كبير، وهذا أمر غير مرغوب فيه. لذا، تعد هذه الخطوة عملية بالغة الأهمية في هذه الجراحة.

سوف نقوم أولاً بوضع بعض الماء على حجر الشحذ الذي يدور هنا. ومن ثم سنأخذ، لنرَ، مجرد عود خشبي، وسنثبت الماصة التي سحبناها للتو على هذا العود باستخدام بعض الشريط اللاصق.

وسنستخدم أحد هذه المناورات الدقيقة (micro manipulators) لتثبيت الماصة فوق الحافة المائلة والسماح لها بالاستقرار هنا. لذا، سنقوم بوضعها، ونستخدم المجهر لرؤية طرف الماصة. ثم سنضعها مباشرة في الماء فوق الحافة المائلة بحيث يتم تطبيق قدر بسيط من الضغط.

ويمكنكم رؤية الطرف وهو يضغط على الحجر هنا. واتركه ليتم شطفه لفترة من الوقت، لمدة 15 minutes على الأقل. وأنا أفضل تركها حتى لمدة ساعة.

في بعض الأحيان، تصبح حادة للغاية، ولكن الأمر يعتمد بالتأكيد من شخص لآخر فيما يتعلق بمدة شطب الماصات. حسنًا، لدينا هنا، كما ترون في الأعلى، ماصة تم سحبها ولكن لم يتم شطبها بعد. لذا، ورغم أنها حادة، إلا أنها لا تحتوي على أي فتحة يمكنك من خلالها تحميل الـ DNA الخاص بك.

لقد تم الآن شطف طرف الماصة السفلي بشكل مائل، ويمكنكم رؤية هذه الفتحة الزاوية الجيدة؛ وهذا سيتيح لكم تحميل الحمض النووي DNA، ومع ذلك لا تزال تمتلك طرفاً حاداً لتمكين الحقن دون التسبب في أي ضرر. حسناً، سنقوم الآن بملء ماصات الحقن بالحمض النووي DNA. من المهم تحضير الحمض النووي DNA بطريقة خالية من الذيفانات الداخلية (endotoxins) لضمان عدم حقن أي من عديدات السكاريد الشحمية (lipopolysaccharides) عند حقن الحمض النووي DNA.

سنقوم الآن بأخذ الحمض النووي DNA، ونقوم هنا بتجهيز غشاء البارافيلم. ستقوم بتجهيز غشاء البارافيلم هنا، ثم تجمع الحمض النووي DNA وتضعه على شكل نقطة صغيرة على هذا الغشاء. وبعد ذلك سنقوم، وعادةً ما آخذ لكل 10 µL من الحمض النووي DNA، والذي أستخدمه عادةً بتركيز يتراوح بين 1.5 إلى 1.7 µg من كل µL.

سأستخدم حوالي 1 µL من صبغة fast green هذه. والهدف من ذلك هو مساعدتنا في تحديد موقع الحقن والتأكد من أننا قد حقنا بنجاح داخل البطين. لذا، سأقوم بخلط صبغة fast green هذه مع DNA الخاص بي.

بعد ذلك، نأخذ قطب الحقن ونقوم بتعبئة الماصة عن طريق سحب المكبس للخلف. ويمكنكم ملاحظة أنه إذا كانت حافة الماصة مشطوفة بشكل صحيح وبها فتحة واسعة بما يكفي، فإن الـ DNI سيُشحن بسهولة تامة. وفي بعض الأحيان، قد تحتاجون إلى تحريك المكبس ذهابًا وإيابًا للمساعدة في شحنه بشكل صحيح.

وبذلك يمكنك ملء الماصة بهذا الشكل. الآن أصبح الحمض النووي DNA محملًا بالكامل في هذه الماصة وهو جاهز للحقن. حسنًا، سأقوم الآن بغسل الحيوان بالكحول واليود، ولكن أولاً بالطبع أريد إجراء اختبار قرصة إصبع القدم للتأكد من أن الحيوان تحت تأثير التخدير الكامل، ويبدو الأمر جيدًا.

لذا، يمكنني المضي قدماً والبدء. سأبدأ، تماماً كما فعلنا مع الجرذان، بسلسلة من ثلاث عمليات، نبدأ بالإيثانول. حسناً، اليود.

لتقليل خطر العدوى، يرجى ملاحظة أن ويليام عندما فتح المناديل المبللة، قام بتنظيف الحيوان بالجزء الذي لم تلمسه أصابعه؛ وذلك لضمان أقصى درجة من نظافة المنطقة. ثانيًا، قام بمسحة واحدة فقط لتجنب توزيع الجراثيم على سطح البطن.

حسنًا، رائع. سأقوم الآن بالتنظيف قليلًا ثم سأرتدي قفازات جراحية. حسنًا. حسنًا. الآن سأقوم بفتح الفأر واستخراج قرون الرحم، وسأبدأ ذلك بقرصة صغيرة للجلد.

سأقوم بإجراء قرص إصبع آخر هنا للتأكد من أنها تحت تأثير التخدير الكامل، وهذا جيد. لذا سأقوم بقرص الجلد لإحداث ثنية صغيرة تبرز للأعلى، مما يسهل عملية القص. ومرة أخرى، نريد إجراء الشق على طول الخط الناصف للحيوان لتجنب أي أوعية دموية.

عادةً ما أقوم بقص الجلد بهذه الطريقة، ثم أفصله لأكشف عن العضلة. وبمجرد القيام بذلك، يمكنك رؤية الخط المتوسط بوضوح في العضلة، حيث يكون محددًا للغاية.

سأقوم بالإمساك ببعض العضلات هناك ثم قصها، وهذا حجم شق جيد؛ حيث لا أرغب في القيام بشق أكبر من ذلك. بعد ذلك، أستخدم هذا الرافع (freer) لرفع العضلات والجلد وسحبهما إلى الجانب، ثم أقوم بسبر المنطقة هنا برفق شديد وأحاول وضع الرافع بين الجنينين، بحيث يمكنني سحبهما للخارج بلطف دون التسبب في أي ضرر لهما.

أحياناً يكون الأمر أسهل من مرات أخرى. ها قد نجحت. لذا، اسحبها برفق إلى الخارج، وبمجرد إخراجها، يمكنني حينئذٍ دفعها للخارج قليلاً.

من المهم عدم الضغط على الأجنة نهائياً، بل يجب الاكتفاء بتوجيهها أو دفعها برفق. وبمجرد إخراجها، يجب التأكد من إبقائها رطبة دائماً، إذ يجب تجنب تعرضها للجفاف.

ودعونا نرى، سأستخدم المسبار مرة أخرى هنا، وأقوم بالفحص. ها قد وجدناها. هذا رائع.

لذلك، أرغب دائمًا في التأكد من إخراجها جميعًا لأن من السهل ترك أحدها بالداخل إذا لم يتم البحث عن المبيضين. لذا أقوم بسحبها دائمًا برفق شديد مرة أخرى، مع البحث عن المبيضين والتحقق من وجودهما في النهاية، وهما موجودان هنا تمامًا. ويبدو الأمر مجرد كتلة صغيرة من الأنسجة الحمراء في هذا الحيوان.

ثم اقلبها، وعُد للتحقق من الجانب الآخر، حيث يمكنني رؤيتها هناك. لذا، تأكد فقط من الحفاظ على رطوبتها وبذلك نكون مستعدين للبدء. وهناك نقطة أود الإشارة إليها وهي ضرورة التقاط الأجنة برفق شديد والحرص على التقاط الأجنة فقط.

تجنب الإمساك بالمناطق التي توجد بها الأوعية الدموية لأنها قد تتعرض للتلف بسهولة شديدة، مما قد يتسبب في إصابة الحيوان بنزيف، وهو ما سيؤدي إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة بشكل كبير. لذا، فإن الخطوة الأولى التي نريد تحديدها هي موقع الرأس في الجنين المراد حقنه بالـ DNA. نقوم بذلك عن طريق تدوير الحيوان بلطف وفحص كل جزء بطني.

في هذا المثال تحديداً، يقع الرأس على يميني والذيل بالقرب من يساري. يقع الخط الناصف في هذا الموضع، وسيقوم ويليام الآن بوضع الجنين بطريقة مناسبة حتى أتمكن من حقنه. تماماً كما أفعل مع الجرذان، أقوم دائماً بوضعهم بحيث يكون الرأس على الجانب الأيمن للأم ويكون موجهاً نحوي.

وسأبدأ بذلك الآن. حسنًا، يمكنك رؤية العمود الأرضي الأيسر هناك، حركه قليلاً وستتمكن بالتأكيد من رؤية الخط الناصف هناك تمامًا. سأحاول تدويره قليلاً ليكون في وضعية جيدة بالنسبة لديفيد.

حسنًا، وسأقوم الآن بالبدء في حقن البطين الأيسر. يمكننا أن نرى هنا أن البطين الأيسر ممتلئ تمامًا بالصبغة. كما نلاحظ أن بعض الصبغة قد انتقلت إلى البطين الأيمن وكذلك إلى البطينين الثالث والرابع هنا.

يعد ذلك مؤشراً جيداً على نجاح عملية الحقن. سنقوم الآن بإدخال الـ DNA إلى الخلايا عن طريق الترحيل الكهربائي. ومن المهم هنا معرفة أي قطب كهربائي يمثل الطرف الموجب.

نحن نعلم أن القطب ذو المقبض الأزرق هنا هو القطب الموجب، وهذا الجانب يجب أن يوضع في الجانب الذي نريد إجراء التثقيب الكهربائي لـ DNA فيه. وبما أننا قمنا بحقن البطين الأيسر بمعظم الـ DNA، سأقوم بوضع القطب الموجب على الجانب الأيسر بهذا الشكل، ثم سنقوم بتطبيق خمس نبضات وهذا كل شيء. من المهم أن تكون الأقطاب مبللة تماماً بمحلول PBS لضمان جودة التلامس بين الأقطاب والرحم وضمان نقل النبضات الكهربائية بشكل مناسب.

حسنًا، الآن وبعد اكتمال عملية الاستكشاف، سأقوم بإعادة القرون إلى الداخل. وسأفعل ذلك عن طريق تحريك القرون بلطف شديد إلى أحد الجانبين، ثم الوصول إلى الداخل والإمساك بالعضلة والجلد وإرجاعهما برفق شديد إلى الداخل. حسنًا، ممتاز.

كن حذراً من المثانة. يمكنني القيام بالجانب الآخر. ومن ثم نقوم بهزها قليلاً لترتيبها في الداخل.

يمكن استخدام الملقط قليلاً لتسويتها برفق. ومن ثم سأقوم بالغسل باستخدام 3 mL من مضاد حيوي ومضاد للفطريات. لنقم بإجراء قرصة إصبع القدم للتأكد من أنها غائبة عن الوعي تماماً قبل أن أبدأ في الخياطة.

وهذا يبدو جيداً. سأستخدم خيط جراحي من نوع Henry Shine، مقاس 6.

أفضل استخدام الغرز المربعة، فأنا أعتقد أنها أكثر تماسكاً. وسنبدأ ببساطة بتمرير الإبرة هناك، ثم سحبها، ولفها ثلاث مرات، ثم الإمساك بالطرف وسحبه.

1، 2، 3، قص الزوائد. لذا، عليك الاستمرار في التحرك على طول الخط بمسافات متساوية مع الشد جيداً. ثم استمر فيما بعد نقطة انتهاء الشق وقم بالربط مرة أخرى.

وأنا أقترب من ذلك الآن. اسحب النسيج أو الجلد للخلف قليلاً. هناك القليل من النزيف هناك.

من المفترض أن تسير الأمور على ما يرام. فنحن نحتفظ بجهاز كيّ بالقرب منا في حال حدوث نزيف، وهو أمر يحدث أحياناً، وجهاز الكيّ يعمل بشكل جيد لوقف ذلك.

حسنًا، لقد تجاوزت موضع الشق الجراحي. سأتوقف هنا. سأقوم بالسحب، ثم تكوين حلقة، والتدوير ثلاث مرات، ثم أمسك الحلقة وأسحبها للأسفل.

قم بتدوير الحلقة ثلاث مرات، ثم أمسك العروة، واسحبها للخارج، وتخلص من الزيادة. ضع الإبرة في حاوية الأدوات الحادة. وبعد ذلك، سنستخدم الدباسة.

سنستخدم دبابيس جراحية مقاس 7 لهذا الحيوان. فنحن نستخدم مقاس 7 للفئران، ومقاس 9 للجرذان.

قم ببساطة بإمساك الجلد، واسحبه للأعلى قليلاً، وابدأ في وضع المشابك. أمسك بالمشبك مرة أخرى. نريد توزيع المشابك بمسافات متساوية وصولاً إلى ما بعد الشق الجراحي بقليل، وبهذا يكون الأمر جيداً.

أكمل العملية بمسح المنطقة بالكامل بمسحة كحولية. بعد ذلك، سنقوم بإعطائها حقنة من buprenorphine للتأكد من عدم شعورها بأي ألم. وسنستمر في مراقبتها على مدار اليومين القادمين للتأكد من بقائها بصحة جيدة وعدم تعرضها لأي نوع من الألم.

حسنًا، بعد أن قمنا بحقنها بمادة buprenorphine، سنعيدها إلى قفصها الأصلي لكي تشعر بالراحة عند استيقاظها، ونضع القفص في الحاضنة ونتركها هناك لمدة 20 دقيقة تقريبًا حتى تستيقظ تمامًا وتجف. لقد شرحنا لكم كيفية إجراء عملية التثقيب الكهربائي لـ plasma DNA داخل الرحم في الجسم الحي (in vivo in utero). حيث يمكننا حقن أي جزيء.

قد تكون هذه الجزيئات عبارة عن DNA أو أدوية، أو عوامل نمو. إذا كنت بحاجة إلى إيصال هذه الجزيئات إلى داخل الخلايا وهي لا تعبر عن طريق الانتشار السلبي، فستحتاج إلى عملية التثقيب الكهربائي، ولهذا الغرض، يجب أن تكون الجزيئات مشحونة.

ولكن في الأساس، فإن الاحتمالات لا حصر لها. ومن الأمثلة على النواقل البديلة لإيصال الجينات إلى الخلايا الفيروسات.

وفي السابق، استخدمنا الفيروسات القهقرية لوسم الخلايا الدبقية بالـ DNA ولتوضيح كيفية انقسامها وتحولها إلى عصبونات، والتي تهاجر في النهاية إلى القشرة المخية بعد وسم الخلايا بفيروس أو باستخدام التثقيب الكهربائي، أو عن طريق حقن العقاقير أو أي جزيئات أخرى للتأثير على تطور الدماغ. ويمكن دراسة ذلك بعدة تقنيات، إحداها هي التصوير بفاصل زمني (TimeLapse) حيث يتم إجراء زراعة لشرائح عضوية النمط.

وبعد ذلك، ستتابع مصير الخلايا باستخدام المجهر. وكما تلاحظ هنا، في الزمن 0.0، نبدأ بمجموعة من الخلايا القريبة جداً من البطين الجانبي.

ومع مرور الوقت، يمكننا ملاحظة أن الخلايا تبدأ في الهجرة خارج المنطقة البطينية والتوجه نحو الصفيحة القشرية. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بتثبيت الأجنة وإجراء كيمياء نسيجية مناعية لدراسة توزيع الجزيئات المختلفة، أو لتحديد مصير هذه الخلايا المختلفة. وهناك إمكانية أخرى تتمثل في إجراء الفسيولوجيا الكهربائية.

نقوم بتحديد الخلايا المُميزة ومن ثم ندرس خصائصها الكهربائية. حسناً، شكراً لمرافقتنا اليوم. نأمل أن تكونوا قد استمتعتم بعروضنا التوضيحية وأن تنجحوا في إجراء تجاربكم.

إذا كانت لديكم أي أسئلة، فلا تترددوا في الاتصال بنا. نتمنى لكم كل التوفيق.