Transfecting الإنسان الخلايا الجذعية العصبية مع Nucleofector Amaxa

مرحباً، أنا ستيف. أعمل في مختبر الدكتور فلاناغان في قسم علم الأمراض بجامعة كاليفورنيا، إيرفاين. سأوضح لكم اليوم كيفية إجراء عفن (transfection) للخلايا العصبية السلفية البشرية باستخدام عامل نووي من نوع maxis.

بدايةً، ستحتاج إلى عدد كبير من الخلايا. أرى أن قارورة T 25 ممتلئة تماماً (confluent) ستكون كافية لأن هذا البروتوكول يتطلب كثافة خلوية عالية جداً، لذا ستحتاج إلى مليون خلية على الأقل. سأبدأ أولاً بفصل الخلايا عن السطح باستخدام محلول تفكيك الخلايا (cell dissociation buffer)، ثم القيام بعدّها.

ولتنفيذ ذلك الإجراء، يرجى الرجوع إلى بروتوكول التغليف الخاص بي. والسبب الذي يجعلني أفضل نظام Maxa في تجارب عفن الخلايا (transfection) هو أن شركة Maxa تطور بروتوكولات عفن مخصصة لأنواع معينة من الخلايا، وفي حالتي، كانت هذه البروتوكولات مخصصة للخلايا الجذعية العصبية، وهي تعمل بشكل ممتاز.

فهي تمنح كفاءة ترانسفكشن عالية جدًا وحيوية خلوية عالية جدًا. والآن، لنبدأ؛ فأنا مستعدة الآن لإجراء عملية الترانسفكشن.

لذا، وتحضيراً لعملية عفن الخلايا (transfection) هذه، قمتُ مسبقاً بطلاء طبق زراعة الأنسجة ببروتين الفبرين (fibrin) طوال الليل. وبعد ذلك، وضعتُ بعض وسائط النمو فيه. وهو الآن موجود في الحاضنة بانتظار إضافة الخلايا.

كذلك، قمت بتجهيز كافة الكواشف، وناقل DNA، ومحلول عفن الخلية (transfection solution). وكلها تنتظر هنا على الثلج. وأنا الآن مستعدة لبدء عملية عفن الخلية.

هذا هو العامل النووي M max، وقبل وضعه داخل غطاء التدفق الصفحي، سأقوم بتطهيره باستخدام ethanol بتركيز 70%، ثم سأمسحه بمنشفة ورقية. لقد قمت للتو بعدّ الخلايا لضمان وجود 4 مليون خلية في المجموع وقمت بتوزيعها. والآن أنا مستعد لبدء عملية النقل.

سأقوم أولاً بإزالة الوسط الذي توجد فيه الخلايا. لدي هنا كريات الخلايا (cell pallet)، وسأقوم بشفط الوسط الذي كانت موجودة فيه. سأحاول إزالة أكبر قدر ممكن من الوسط لأنني لا أريد وجود أي بروتينات أو ما شابه في وسط عفن الخلية (transfection media)، لأن ذلك قد يؤثر على بروتوكول عفن الخلية.

لقد قمت بإزالة معظم الوسط الغذائي تقريبًا، وسأقوم الآن بإعادة تعليق هذه الكتلة الخلوية في 100 µL من محلول العامل النووي للخلايا الجذعية العصبية للفئران والمصاغ خصيصًا. تنتج شركة Mxa محلول ترانسفكشن لنقل الجينات إلى الخلايا الجذعية العصبية للفئران، ولا يتوفر لديهم محلول للخلايا الجذعية العصبية البشرية، ولكننا وجدنا أن استخدام المحلول الخاص بخلايا الفئران يعمل بشكل جيد جدًا. لذا، سأقوم بإضافة 100 µL من محلول العامل النووي للخلايا الجذعية العصبية للفئران هذا.

سأقوم بإعادة تعليق راسب الخلايا جيداً، حتى لا تتبقى أي تكتلات خلوية، وبذلك أحصل تقريباً على معلق خلوي متجانس. لذا، سأقوم بالسحب والضخ باستخدام الماصة حوالي 10 مرات.

أعتقد أن لدي الآن خليطاً متجانساً تماماً، وسأقوم بنقله الآن إلى أنبوب "دورف" مفتوح سعة 1.5 ml. سأستخدم ماصة P 1000 للتأكد من سحب كامل هذا المحلول. الآن لدي 4 مليون خلية معيدة التعليق في محلول ترنسفكشن الفئران الجديد، وسأقوم الآن بإضافة خمسة µL من الناقل الخاص بي.

لقد كنتُ أحفظه على الثلج طوال هذا الوقت وحتى الآن. لذا سأقوم أولاً بسحب 5 µL، ومن ثم سأضيفه إلى معلق الخلايا.

سأستخدم الآن ماصة P 200 مضبوطة على حوالي 50 µL، وسأقوم بخلط الخلايا مع الناقل بشكل جيد جداً. لذا، سأقوم بسحب السائل ودفعه للأعلى والأسفل 10 مرات. حسناً، لقد أصبح المزيج جاهزاً.

والآن، أنا مستعد لعملية التعداء. لذا سأقوم بفتح أنبوبة جديدة، كما سأحضر ماصة خاصة مقدمة من شركة amaxa.

سأقوم بإزالة الغطاء وسأقوم بسحب هذا المزيج برفق. ثم سأقوم بإدخال الماصة بالكامل في الأنبوب والضغط برفق لإخراج المحلول. سأقوم بتشغيل جهاز قياس العامل النووي، وسأضبط القيمة على 330 3 3 ثم سأضغط على مفتاح الإدخال.

سأقوم بعد ذلك بوضع أنبوبة vete في حامل vete، ثم سأقوم بتدوير العجلة، والآن أنا مستعد لإجراء عملية عفن الخلايا (transfection). ولكن قبل ذلك، سأتأكد من تجهيز وسط غذائي دافئ لإضافته إلى الخلايا التي تم عفنها على الفور. يساعد ذلك في زيادة حيوية الخلايا إذا أضفت الوسط الدافئ في أنبوبة vete مباشرة بعد عملية العفن.

سأقوم بتجهيز ماصة P 1000. كما سأحضر الطبق المحتوي على الوسط الغذائي الموجود حالياً في الحاضنة حتى أتمكن من نقل الخلايا إلى الوسط الغذائي على الفور. والآن، سأضغط على مفتاح الإدخال مرة أخرى وقد انتهيت.

وعند نجاح عملية عفن الخلايا (transfection)، كما ترون، تظهر هذه الطبقة الكثيفة جداً من الفقاعات التي تشير إلى نجاح العملية. لذا سأقوم بإضافة 500 µL من الوسط الغذائي المسخن مسبقاً إلى الـ vete. وبذلك أضيف مزيداً من الوسط الغذائي الذي تحتاجه الخلايا بشدة، وسأستخدم نفس ماصة MX لإخراج الخلايا من الـ vete.

لذا فهي تعاني من إجهاد شديد حالياً. لذا سأقوم بنقلها مباشرة إلى وسط دافئ، المزيد من الوسط الدافئ. وأخيراً، في الخطوة الأخيرة، سأقوم بشطف Q vete ببعض الوسط المسخن مسبقاً للتأكد من إخراج جميع هذه الخلايا، وسأضعها في نفس البئر L، ثم أضع الطبق في الحاضنة على الفور.

نرى في هذه الصورة خلايا عصبية بشرية سلفية تم ترنسفيكشنها بعامل نووي وصول وزراعتها على شرائح غطائية شبكية. وحتى بعد مرور يومين على عملية الترنسفيكشن، لدينا كفاءة ترنسفيكشن تبلغ حوالي 50% يمكن ملاحظتها من خلال تعبير GFP. لقد أريتكم اليوم كيفية إجراء الترنسفيكشن للخلايا العصبية البشرية السلفية باستخدام العامل النووي Xis.

بالتوفيق في عملية عفن الخلايا الخاصة بك.