Transfecting الإنسان الخلايا الجذعية العصبية مع Nucleofector Amaxa

مرحبا ، أنا ستيف. أعمل في مختبر الدكتور فلاناغان في قسم علم الأمراض في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين. سأوضح لكم اليوم كيفية نقل الخلايا السليفة العصبية البشرية باستخدام عامل نووي ماكسيس.

أولا للبدء ، ستحتاج إلى الكثير من الخلايا. أود أن أقول على الأقل قارورة T 25 ملتصقة لأن هذا البروتوكول يتطلب كثافة خلية عالية جدا ، لذلك ستحتاج إلى مليون خلية على الأقل. أولا ، سأبدأ بإزالة الخلايا عن السطح باستخدام المخزن المؤقت لتفكك الخلايا ، ثم عدها.

ولهذا الإجراء ، راجع بروتوكول التعبئة والتغليف الخاص بي. والسبب الذي يجعلني أفضل الحد الأقصى لتجارب الشفافية الخاصة بي هو أن amaxa تطور بروتوكولات تعدين مصممة خصيصا لأنواع معينة من الخلايا ، وفي حالتي ، للخلايا الجذعية العصبية. وهو يعمل بشكل رائع.

إنه يعطي كفاءة عالية جدا في الشفافية وقابلية عالية جدا للخلية. ولنبدأ. لذا أنا الآن مستعد لإجراء تعداد.

لذلك استعدادا لهذا التعدي ، قمت بالفعل بترميز طبق زراعة الأنسجة الخاص بي بالفيبرين بين عشية وضحاها. وبعد ذلك ، وضعت بعض وسائط النمو فيه. لذا فهو الآن يجلس في الحاضنة في انتظار استقبال الخلايا.

أيضا ، لقد أعددت كل ، جميع الكواشف الخاصة بي ، وناقل الحمض النووي الخاص بي ومحلول التعداد. لذا فهم جميعا ينتظرون هنا على الجليد. وأنا مستعد لبدء التعدي.

إذن هذا هو العامل النووي M max ، وقبل أن أضعه في الغطاء ، سأقوم بتطهيره بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم سأقوم بمسحه بمنشفة ورقية. لذلك لقد عدت للتو بحيث يكون لدي 4 ملايين خلية إجمالا وأنتجهها. والآن أنا مستعد لبدء النقل.

لذا سأقوم أولا بإزالة الوسائط التي يتواجدون فيها. لذلك لدي منصة نقالة خلوية هنا ، وسأقوم بشفط الوسائط التي كانوا فيها. وسأحاول إزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط لأنني لا أريد أن يكون لدي أي بروتينات أو ما شابه ذلك في وسائط التعدي لأن ذلك قد يؤثر على بروتوكول التعدين.

لذلك قمت بإزالة معظم الوسائط تقريبا، والآن سأقوم بتعليق هذه البليت الخلوي في مائة ميكرولتر من محلول العامل النووي للخلايا الجذعية العصبية للفأر المصمم خصيصا يصنع Mxa محلول تعداء لنقل الخلايا الجذعية العصبية للفأر ، وليس لديهم حل للخلايا الجذعية العصبية البشرية ، لكننا وجدنا أن استخدام المحلول لخلايا الفئران يعمل بشكل جيد للغاية. لذا سأقوم بإخراج مائة ميكرولتر من محلول المستجيب النووي للخلايا الجذعية العصبية للفأر.

وسأقوم بتعليق منصة الخلية الخاصة بي فيها جيدا ، بحيث لا تبقى كتل من الخلايا. إلى حد كبير ، لدي معلق خلوي متجانس. لذلك سأقوم بالأنابيب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات.

لذلك أعتقد الآن أن لدي خليطا متجانسا جدا ، وسأقوم بنقله الآن إلى أنبوب دورف مفتوح بحجم 1.5 مل. لذلك أنا أستخدم ماصة P 1000 وسأتأكد من حصولي على كل هذا الحل. والآن لدي 4 ملايين خلية معلقة في الفأر ، محلول تعداء جديد للفأر ، والآن سأضيف خمسة ميكرولترات من المتجه الخاص بي.

لذلك كنت أحتفظ بها على الجليد طوال هذا الوقت حتى الآن. ولذا سأقوم أولا بتجميع خمسة ميكرولترات صغيرة. لذا سأقوم الآن بإضافته إلى تعليق الخلية.

الآن سأستخدم مجموعة P 200 على حوالي 50 ميكرولتر ، وسأخلط الخلايا مع المتجه بشكل جيد حقا. لذلك سأقوم بتثبيتها لأعلى ولأسفل 10 مرات. حسنا ، هذا جاهز.

وأنا مستعد للنقل لذلك سأقوم بفتح صورة جديدة. وأيضا سأحصل على ماصة خاصة مقدمة من amaxa.

لذلك سأقوم بإزالة الغطاء وسأقوم بسحب هذا المزيج برفق. وسأقوم بإدخال الماصة على طول الطريق في القرص والضغط برفق على المحلول. لذلك سأقوم بتشغيل العامل النووي الأقصى ، وسأقوم بضبط هذا على 33 0 3 3 سأضغط على Enter.

ثم سأضع القرص البيطري في حامل vete ، وبعد ذلك سأقوم بتدوير العجلة ، والآن أنا مستعد للنقل. لكن قبل ذلك ، سأتأكد من أن لدي وسائط دافئة جاهزة لإضافتها إلى الخلايا المنقولة على الفور. يساعد ذلك على زيادة صلاحية الخلية إذا أضفت وسائط دافئة إلى الطبيب بعد التعدي مباشرة.

لذلك سأقوم بإعداد P 1000. وهكذا ، وسأقوم أيضا باللعب بالوسائط الموجودة في الحاضنة الآن حتى أتمكن من نقل الخلايا إلى الوسائط على الفور. لذا أنا الآن ، والآن سأضغط على Enter مرة أخرى وانتهى الأمر.

والتعداء الناجح ، كما ترون ، لديك هنا هذه الطبقة السميكة جدا من الفقاعات التي تشير إلى التعدي الناجح. لذلك سأضيف 500 ميكرولتر من وسائط التدفئة المسبقة إلى الطب الدقيق. لذلك أقوم بإضافة المزيد من الوسائط التي تريدها الخلايا بشدة ، وسأستخدم نفس ماصة MX لإخراج الخلايا من الفيطرية.

لذلك هم متوترون حقا الآن. لذلك سأضعها مباشرة في وسائط دافئة ، وسائط أكثر دفئا. وأخيرا ، الخطوة الأخيرة ، سأقوم بشطف Q vete ببعض الوسائط الدافئة للتأكد من أنني أخرج كل هذه الخلايا ، وسأضعها في هذا في نفس البئر L وأضع اللوحة في الحاضنة على الفور.

في هذه الصورة ، نرى خلايا السلائف العصبية البشرية التي تم نقلها بعامل نووي للوصول وطلاءها على زلات غطاء شبكية. لذلك حتى بعد يومين من التعدي ، لدينا حوالي 50٪ من كفاءة التعداء التي يمكننا ملاحظتها من خلال تعبير GFP. أوضحت لكم اليوم كيفية نقل خلايا السلائف العصبية البشرية باستخدام العامل النووي Xis.

حظا سعيدا في تعداء الخاص بك.